（1贵州省疾病预防控制中心 贵州 贵阳 550004）
（2贵州医科大学公共卫生学院毒理学教研室 贵州 贵阳 550004）
【摘要】目的：探讨竹荪多糖提取条件和对小鼠肝癌H22细胞生长的影响。方法：采用水提醇沉法提取竹荪多糖，并分析未脱和脱蛋白竹荪多糖的含量；采用四甲基偶氮唑盐（MTT)法检测不同剂量未脱、脱蛋白竹荪多糖对小鼠肝癌H22细胞生长24h存活率的影响。结果：未脱蛋白竹荪多糖的提取率为3.93%、多糖含量为46.21%，脱蛋白竹荪多糖的提取率为2.33%，多糖含量为54.13%；体外实验显示：0.4、0.8mg/ml剂量组的未脱和脱蛋白竹荪多糖对小鼠肝癌H22细胞存活率的影响明显，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：脱蛋白竹荪多糖含量高于未脱蛋白多糖；不同剂量的未脱和脱蛋白竹荪多糖对小鼠肝癌H22细胞的生长均有抑制作用。
【关键词】 竹荪；多糖；小鼠肝癌H22细胞；水提醇沉法；MTT法
【中图分类号】R735.7 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）19-0349-03
前言
竹荪(Dictyophora)是一种珍贵的食、药两用真菌，具有开发的潜能[1]。20世纪90年代以来，我省某些地区掀起竹荪种植热潮[2]，以织金为代表，纳雍、大方、黔西等县利用自己探究的科学技术对竹荪进行人工栽培并取得很大的经济效益，带动着我省农业技术的发展[3-4]。肿瘤是目前对人类健康威胁最大的疾病之一，目前仍未有较好的治疗方法[5]。随着人们对多糖研究的深入，发现大部分多糖类药物有可能成为临床中重要的肿瘤治疗药物[6]。研究表明竹荪所含多糖是具有高活性的大分子物质[7],在抗肿瘤、抗炎症、刺激免疫等方面都有一定的疗效[8]。目前对竹荪多糖的提取主要是水提醇沉法[9，10，11]，由于该方法易于操作、对仪器的消耗较少、成本较低，适用比较广泛。本研究以竹荪子实体为原料采用水提醇沉法提取竹荪多糖，对其含量进行测定，同时探讨竹荪多糖对小鼠肝癌H22细胞生长的影响，为进一步研究竹荪多糖的生物活性提供实验依据。
1.材料
1.1 竹荪
竹荪购于织金四方宏业竹荪开发有限公司。
1.2 细胞株
小鼠肝癌H22细胞株购自中国医学科学院肿瘤医院生物监测中心肿瘤细胞库。
1.3 主要仪器
HH-8数显恒温水浴锅、台式离心机（金坛市富华仪器有限公司）；PB303-N电子天平(梅特菲力-托勒多仪器上海有限公司)；μQuant，MQX200超级酶标仪（bio-tek公司，美国）；BCD-539WT冰箱（青岛海尔股份有限公司）；GZX-9246数显鼓风干燥箱（上海康路仪器设备有限公司）；HETO真空干燥机(丹麦)；Q/320584VSC002超净工作台（苏州市亿达净化钢结构工程有限公司）；MCO-15AC CO2培养箱（Sanyo公司，日本）；TE2000-U+DXM1200倒置显微镜（Nikon公司，日本）。
1.4 主要试剂
无水乙醇（分析纯,上海振兴化工厂)；异丙醇、异丁醇（分析纯,上海试四赫维化工有限公司）；三氯甲烷（分析纯，上海申博化工有限公司）；四甲基偶氮唑蓝MTT（Gibco公司）；葡萄糖标准品（中国药品检定所）；RPMI1640培养基、10%小牛血清（天津澋洋生物制品科技有限责任公司）；SDS裂解液（Sigma公司，德国）。
2.方法
2.1 竹荪多糖提取流程
2.1.1多糖提取率的计算 多糖提取率=（冷冻干燥后多糖的质量/所用竹荪粉末质量）×100%
2.1.2多糖含量分析 用硫酸-苯酚比色法测多糖含量。葡萄糖标准曲线的制作：分别吸取葡萄糖标准液（mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，置于25ml比色管中，各以蒸馏水补至2ml，加苯酚2ml，浓H2SO4 10ml，混匀后于沸水浴中15min冷却后用分光光度计在570nm处测吸光度值。以质量（g）为横坐标，吸光度值作为纵坐标，绘制曲线。
2.2 细胞培养及分组
H22细胞于37℃5%CO2培养箱内培养，每24h换培养液，细胞密度至106个/ml左右时传代。将细胞均匀接种于96孔板中，5×104～1×105个/孔，2h后将实验组分别加入终浓度为0.8、0.4、0.2、0.1mg/ml10μl的竹荪多糖提取液，同时设空白对照组（只加等体积完全培养液）和阴性对照组（加等体积完全培养液和细胞），各组均设五个复孔，置于37℃5%CO2培养箱内培养。
2.3 细胞存活率测定
用酶联免疫检测仪测定各组570nm处吸光度（OD）值。计算公式如下：细胞生长存活率（%）[12]= 1-（对照组OD值-实验组OD值/对照组OD值）×100%。
2.4 体外肿瘤细胞生长抑制试验（MTT法）
将H22细胞制成悬液，浓度5×104～6×104个/ml，96孔板每孔5×103～1×104个细胞接种90μl。实验组、对照组按上述方法加入相应竹荪多糖提取液后于37℃5%CO2培养箱中培养24h，取出96孔板，于每孔分别加入5mg/ml MTT10μl，继续培养4h，再向每孔中加入100μl三联液，培养过夜后测OD值。
2.5 统计学分析
实验数据用SPSS19.0软件进行统计学分析，数据采用x-±s的形式表示，F检验方差齐性后，对数据采用方差分析，检验水平α=0.05，P<0.05认为差异有统计学意义。
3.结果
3.1 竹荪多糖的提取率
由表2可见，未脱蛋白和脱蛋白竹荪多糖的提取率分别为3.93%、2.33%且差异有统计学意义（P<0.05）。
注：组间比较★P<0.05
3.2 竹荪多糖含量的测定结果
由表2可见：未脱蛋白和脱蛋白竹荪多糖中含糖量分别为46.21%、54.13%。
图2未脱蛋白、脱蛋白竹荪多糖对H22细胞24h生长情况的抑制趋势图
Fig2.Deproteinized, removal of protein polysaccharide on H22 cell growth inhibition of 24h trend chart
4.讨论
本次实验发现竹荪多糖进行脱蛋白处理后，其多糖提取率较未脱蛋白多糖低，表明实验过程中有部分多糖损失，从竹荪子实体提取多糖的经济效益不高，制约了竹荪的开发利用。今后的实验可以考虑回收竹荪的菌托来提取多糖，一方面可能提高多糖提取率，另一方面可以大大地降低提取成本，同时提高竹荪的利用率。
由于竹荪多糖具有丰富的生物活性，值得进一步开发，可不断扩展其在保健品、功能性食品中的应用。因此，我们对竹荪多糖的抗肿瘤作用进行了初步探讨，体外实验显示：不同剂量的脱蛋白和未脱蛋白竹荪多糖均对小鼠肝癌H22细胞的存活率有影响，其存活率最低至78.5%，可为以后的竹荪抗肿瘤实验提供参考。本次实验仅局限于体外实验对肿瘤细胞存活率的影响，尚未对其作用机制进行探讨，还需进一步确证竹荪的抗肿瘤作用和机制。研发天然新型的抗肿瘤产品，对延伸竹荪产业链，提供竹荪产品的附加值，增加农民收入，及对竹荪产业的可持续发展起积极推动作用。
【参考文献】
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论文作者:张豫,罗鹏,肖佳艳,叶建方,吴雪艳
论文发表刊物:《医药前沿》2017年7月第19期
论文发表时间:2017/7/27
标签：竹荪论文; 多糖论文; 蛋白论文; 小鼠论文; 细胞论文; 肝癌论文; 存活率论文; 《医药前沿》2017年7月第19期论文;