张国俊[1]2003年在《微卫星DNA改变与肺鳞癌发生关系的系列研究》文中研究表明微卫星DNA又称短串联重复序列(Short tandem repeats，STRs)或简单重复顺序(Simple sequences repeats，SSRs)，是一类不编码的数目可变的重复DNA序列，多以2～6个核苷酸为重复单位，长度10～60bp，广泛分布于人类基因组及其他真核生物基因组中。由于微卫星DNA重复单位小，串联重复之后的长度较短，有利于应用PCR技术进行检测，所以被广泛用于基因作图的遗传标记、遗传病致病基因的连锁分析及基因位点缺失或杂合性缺失的研究。研究表明，微卫星DNA异常是人类大多数恶性肿瘤常见的遗传改变之一，而在正常组织中微卫星DNA却很少发生变异。肿瘤中微卫星DNA异常主要表现为微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)和微卫星的杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)。在同一个体中肿瘤组织与相应正常细胞中微卫星DNA长度存在一定的差异，表现为重复单元的增加或丢失，这种差异被称为微卫星不稳定性(MSI)；同一个体的正常细胞DNA中存在两个等位基因，而其肿瘤组织DNA中一个等位基因消失，被称为微卫星的杂合性缺失(LOH)。随着对微卫星DNA研究的深入，以微卫星DNA为肿瘤早期诊断标志物及其可行性的研究已成为当今肿瘤分子生物学研究的热点。 肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展是一个多因素、多步骤、复杂的渐进过程。从支气管粘膜的过度增生、突变到真正的肿瘤形成，经历了一系列分子水平的基因改变和基因表达产物的异常。而微卫星DNA的变异是细胞恶性转化的多步骤基因改变中重要的标志之一。迄今为止，有关肺癌微卫星DNA变化的研究已有很多，但大多数的研究仅限于对肺癌组织中微卫星DNA的检测，对血液、支气管肺泡灌洗液中微卫星DNA变化的研究较少;对支气管冲洗液中微卫星DNA变化的研究尚未见报导;对微卫星DNA的变异与错配修复基因 (Mismatch rePair，MMR)、细胞周期调控因子及增殖细胞核抗原 (PCNA)在肺癌组织中表达的相关性研究更为罕见;有关对肺鳞癌微卫星DNA改变的相关多基因位点的系统研究，迄今在国内外亦未见报道。为探讨微卫星DNA改变与肺癌发生的关系及其在肺癌早期诊断中的意义和价值，本实验采用聚合酶链反应一银染法定性技术，以肺鳞癌患者癌组织、血液、支气管冲洗液为标本，选择染色体上20个基因位点，分析微卫星DNA的出现规律，以探讨微卫星DNA在肺癌早期诊断中的应用价值及在预测肺癌发生中的意义;同时应用免疫组织化学法检测hMLHI、PCNA、P53、PZI在肺癌组织中的表达，探讨其在肺癌微卫星DNA改变中的作用和相关关系。本实验分为以下两部分。郑州人学2003年博几l:研究生论文微卫星DNA改变与肺鳞癌发生关系的系列研究 第一部分肺鳞癌组织、血液及支气管冲洗液中微卫星DNA改变的相关研究 方法 1.选取20个基因位点，采用聚合酶链反应一银染法，分别对30例肺鳞癌患者的癌组织、血液及支气管冲洗液标本进行了微卫星DNA的检测;同时，对30例肺部良性疾患者的血液标本进行微卫星DNA的对照检测。故每种标本分别进行20只30二600次检测。 2.统计学处理:应用SPSS统计软件包，采用xZ检验、Fisher精确概率法、t检验、方差分析，对所有资料进行统计学分析。检验标准以P<0.05为差异有显着性，P<0.01为差异有高度显着性。 结果 1.肺鳞癌组织微卫星DNA的检测结果 1.1以实验位点分析，600次检测中，MSI出现率为13.3%(80/600)，LOH出现率为1 2.6%(76/600)，两者的总出现率为26.0%(156/600);其中，有8个微卫星位点MSI和/L OH均超过20.0%，分别是D351067D3S1447、D55346、D3S16ll、D951748、D3S1284、D3SlllO、D3 5 1 007。 1.2以30例实验病例分析，MSI、LOH、MSI和/L OH的阳性率分别为83.3%(25/30)、80.0%(24/30)、90.0%(27/30)。 (注:以上为以至少有1个位点异常为微卫星DNA改变的阳性标准所得出的结果) 2.血液标本微卫星DNA的检测结果郑州人学2003年博_!:研究生论文微一性星DNA改变几J肺鳞癌发生关系的系列研究 2.1以实验位点分析，600次检测中，MSI出现率为10.8%(65/600)，LOH出现率为9.3%(56/600)，两者的总出现率为20.2%(121/600)。 2.2以30例实验病例分析，MSI、LOH、MSI和几OH的阳性率分别为66.7%(20/30)、63.3%(19/30)、70.0%(21/30)。 (注:以上为以至少有1个位点异常为微卫星DNA改变的阳性标准所得出的结果) 2.3对照组血液标本中均为检测到MSI和LOH。 3.支气管冲洗液标本微卫星DNA的检测结果 3.1以实验位点分析，600次检测中，MSI出现率为1 1.7%(70/600)，LOH出现率为1 2.0%(72/600)，MSI和LOH出现率为23.7%(142/600)。 3.2以30例实验病例分析，MSI、LOH、MSI和几OH的阳性率分别为70.0%(21/30)、66.7%(20/30)、80.0%(24/30)。 (注:以上为以至少有1个位点异常为微卫星DNA改变的阳性标准所得出的结果) 4.实验组血液标本MSI、LOH、MSI和LOH出现次数分别是肺鳞癌组织的81.3%(65/80)、73.7%(56/76)、77.6%(121/1
陈国安[2]1999年在《DNA错配修复缺陷在肺癌发病中的作用》文中研究说明目的：探讨肺癌组织中错配修复(MMR)基因功能缺陷、微卫星改变及其靶基因BAX、TGF β RⅡ基因移码突变的关系以及它们在肺癌发病中的作用，为临床诊断及预后判断提供参考性标志。方法：50例新鲜肺癌标本，通过PCR、RT-PCR、SSCP、PAGE-银染、免疫组化等方法对3P13-26及2P21-22六个微卫星标志的不稳定性及杂合性丢失、BAX基因、TGF β RⅡ基因移码突变、五种错配修复基因(hMSH2、hMLH1、hPMS1、hPMS2、hMSH6)蛋白表达、mRNA表达、基因点突变及hMLH1启动子甲基化状态进行了系统研究。结果如下： 1．肺癌组织中有中等频率的微卫星不稳定性(MSI)和杂合性丢失(LOH)。MSI发生率为6％-34.7％，总的发生率(≥1个位点)为52％(26／50)，若≥2个位点异常则为42％(21／50)；LOH发生率为8％-14％，总的发生率(≥1个位点)为44％(22／50)，若≥2个位点异常则为8％(4／50)；MSI和／或LOH的发生率(≥1个位点)为72％(36／50)，若≥2个位点异常则为48％(24／50)。 2．微卫星改变与肺癌组织类型和分化程度有关。肺鳞癌LOH发生率(60％，15／25)明显高于肺腺癌(26.3％，5／19)；低分化肺癌MSI(77％)、MSI和／或LOH(71％)明显高于高、中分化肺癌。 3．肺癌组织中存在一定比例的MMR蛋白不表达。单种蛋白表达阴性率为19.6％-30.4％，总的不表达(≥1种蛋白)率为63％(29／46)。蛋白表达与肺癌临床
郭丽丽[3]2005年在《3p、9p微卫星DNA异常与肺癌早期诊断的研究》文中进行了进一步梳理目的:研究3p、9p微卫星DNA异常在肺癌早期诊断中的价值。 方法:用PCR—银染法从外周血检测原发性肺癌病人、肺部良性病人及正常人3p14、3p21、9p21上的叁个微卫星位点(D3S1228、D3S1029、D9S171)的异常表现。 结果:肺癌病人血清中DNA含量多于良性病人及正常人。肺癌组各微卫星位点的MSI或LOH异常的阳性率在43～50%之间(n=105),以D3S1029最高,达到49.6%,叁个位点中至少一个位点出现微卫星异常为76.2%,其中有45.7%呈多位点的改变,同肺良性病变组(n=97)及健康对照组(n=7)均有显着差异(P<0.05)。在肺癌组中,各个微卫星位点的异常表现与肺癌临床分期和临床病理类型之间无明显差异(P>0.05)。 结论:3p、9p微卫星DNA异常和肺癌分期无关,可以作为一项肺癌早期基因检测的新途径。不同微卫星位点出现异常表现的具体形式有所不同,多位点联合检测可以提高诊断的敏感性和特异性。
梅新宇[4]2008年在《非小细胞肺癌3P基因多区域杂合性缺失联合检测的研究》文中研究表明研究背景:肺癌是当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一,肺癌的发病率和死亡率居恶性肿瘤的首位,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)病例占全部肺癌病例的80%。肺癌患者的远期治疗效果仍不尽人意,即使Ⅰ、Ⅱ期NSCLC患者,术后5年生存率也只有40%-70%。在被确诊的肺癌患者中,仅有20%的患者处于疾病早期,而80%的患者病情已发展到中晚期,并且常出现肿瘤早期发生微转移。因此利用分子生物学的方法在最小创伤的前提下进行肺癌的诊断和微转移的检测具有重要意义。荧光定量PCR(fluorescence quantification PCR)技术,是一种新的核酸定量技术,其基本原理就是在PCR的基础上加入荧光标记探针,巧妙地把核酸扩增(PCR)、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起,借助于扩增过程中产生的荧光信号来检测PCR产物,从而提高了检测的特异性并且在保持高敏感性的前提下尽量减少假阳性的干扰。目的:探讨人3号染色体短臂(3P)等位基因位点杂合性缺失(loss of heterozygaity,LOH)在人非小细胞肺癌(NSCLC)临床检测中的意义。方法:分别对32例非小细胞肺癌肿瘤组织标本和8例肺非恶性肿瘤组织标本以及两组外周血有核细胞标本进行3p染色体3个位点LOH检测,其中鳞癌13例、腺癌12例、腺鳞癌4例,大细胞癌3例,对照组均为经病理证实的肺非恶性肿瘤组织。检测方法采用实时荧光定量PCR方法,PCR产物经8%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染,经凝胶成像系统(AlphaInnotech)的密度分析功能判断结果并对试验结果进行非参数检验。结果:32例肺癌标本中LOH联合检出率为78.125%,外周血有核细胞LOH联合检出率为65.625%,其中肺癌组织标本各位点的LOH检出率分别为43.75%(3p25)、56.25%(3p14)、56.25%(3p21.3),外周血有核细胞各位点检出率分别为18.75%、31.25%、50%,相比对照组结果具有显着差异。组织及外周血有核细胞联合检出率高于各区域单纯检出率,差别具有统计学意义。同一患者的肺癌肿瘤组织与外周血有核细胞3P基因LOH联合检测结果存在一致性。结论:肺癌组织及外周血有核细胞3p基因LOH检测对于肺癌的无创诊断有重要意义,且多区域联合检测有助于提高检测的敏感性。肿瘤组织与外周血有核细胞3P基因LOH联合检测存在一致性对于检测肿瘤微转移有一定意义。
王鑫, 沈诚, 田龙, 车国卫[5]2014年在《微卫星与肺重复癌的研究进展》文中研究说明微卫星(microsatellite,MS)是指以少数几个核苷酸(多为2~4个)为单位多次串联重复的DNA序列。肺重复癌(肺多原发癌,multiple primary lung cancer)是指一侧肺或两侧肺的不同部位发生两个或两个以上原发癌,其组织类型相同或不同,但各肿瘤之间无从属关系,每个肿瘤的发生有着各自独立的成瘤因素。微卫星异常与肺重复癌的发生及发展密切相关。本文主要综述:1微卫星的概念及产生机制;2微卫星异常;3肺重复癌的概念及分类;4微卫星对肺重复癌的早期诊断和预后治疗的影响。
谢永红[6]2007年在《中国人肺鳞癌nm23H1基因遗传不稳定性的研究》文中研究说明1．目的肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，近年来，在我国肺癌的发病率和死亡率均有明显增长。肺鳞癌是肺癌中最为常见的类型，约占肺癌手术切除标本的60％以上。在肺鳞癌中，淋巴道转移是最常见且较为早期的扩散途径，也是肿瘤患者致死的重要原因。因此，揭示肺鳞癌淋巴转移的作用机制，对该病的治疗及预后具有重要的临床意义。肿瘤的发生发展是一个多基因多步骤的复杂过程，其中涉及到癌基因的激活和抑癌基因的失活。基因遗传不稳定性，如基因的微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)和杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)可能是引起抑癌基因失活，导致肿瘤发生发展的重要分子事件。nm23H1基因作为一种肿瘤转移抑制基因，类似于其他抑癌基因，它的失活可使其编码的蛋白NDPK(核苷酸二磷酸激酶)表达减少，进而促进肿瘤的发展、侵袭与转移。目前对中国人nm23H1基因遗传不稳定性如何参与肺鳞癌淋巴转移机制的研究，仍鲜见报道。本课题应用荧光PCR-单链构象多态性(FPCR-SSCP)方法、免疫组织化学染色法等方法，检测肺鳞癌nm23H1基因5'端非转录区微卫星位点的MSI和LOH以及nm23H1蛋白的表达，分析该基因位点遗传不稳定性对肺鳞癌蛋白表达及其进展的影响，以便为肺鳞癌临床治疗和预后提供实验依据。2．材料与方法2．1标本新鲜肺鳞癌手术标本50例，其中男性47例，女性3例。每例均包括肿瘤组织和周围正常组织。每例标本均作冰冻切片由病理医师予以确诊，并确保每例肿瘤标本中的肿瘤细胞比例在80％以上。2．2引物和抗体nm23H1基因5'端非转录区微卫星位点引物序列：5' TAT GAG TTC AAC TAC GCACG 3'和5' CTC GAG CAC AGG AGC AGG GTT 3'。鼠抗人nm23H1蛋白单克隆抗体。2．3基因组DNA的抽提按照试剂盒提供的方法，提取肿瘤组织基因组DNA。同时，抽提患者肿瘤周围正常组织基因组DNA作为对照。2．4荧光PCR-单链构象多态性方法(FPCR-SSCP)引物经荧光标记后，进行PCR扩增微卫星片断(110bp-120bp)。将PCR产物行毛细管电泳，同时采用Genescan分析软件给出电泳图谱。2．5免疫组织化学染色常规石蜡切片，脱蜡后行nm23H1蛋白免疫组织化学法染色，DAB显色，镜下控制显色时间，常规脱水、透明、中性树胶封片。同时，采用PBS代替一抗作阴性对照。2．6判断标准以正常组织的电泳图谱作为对照，如果在肿瘤组织电泳图谱上至少有一个对应峰发生移位或者峰的数量增多，则为微卫星不稳定(MSI)。已为MSI阳性的病例不再作LOH的评价。分别计算正常组织和肿瘤组织的两个主峰之间的峰值比率，然后由正常组织的峰值比率除以肿瘤组织的峰值比率，得到LOH指数(LOHindex)。如果LOH指数为≤0.67或≥1.5时则被认为是LOH。2．7图像分析每例标本连续选取不重迭的20个高倍视野，在相同灰度设定条件下测出G_A(整个背景视野灰度值)、G_a(视野内nm23H1蛋白免疫组化阳性染色颗粒的灰度值)、A_(Aa)(nm23H1阳性细胞占视野面积的面积密度)。2．8数据处理用Excel函数算出PU值(positive unit阳性单位)，代表nm23H1蛋白在肺鳞癌细胞的表达强度。2．9统计学分析所有数据均采用SPSS10.0软件包行单因素方差分析(One-Way ANOVA)、t检验和x~2检验。3．结果3．1肺鳞癌与MSI、LOH的关系利用FPCR-SSCP检测法，发现50例肺鳞癌患者中能提供信息的个体数(杂合子数)为44例(88％)，其可用于LOH分析。44例能提供信息的肺鳞癌患者中MSI和LOH检出率分别为11.36％(5／44)和25.00％(11／44)，5例MSI全部发生在分化良好(G1为2例和G2为3例)及存活患者(1年生存率)中。然而，MSI和LOH的检出率与肺鳞癌分化程度、TNM分期、淋巴转移、患者生存状态及其它临床病理参数均无关(p＞0.05)。3．2肺鳞癌与nm23H1蛋白表达的关系nm23H1蛋白免疫染色反应阳性结果为棕黄色颗粒，主要位于细胞质，胞核和胞膜也有阳性反应结果。44例肺鳞癌nm23H1蛋白检出率为50％(22／44)。nm23H1蛋白阳性表达率在TNMⅠ期(65.22％)、无淋巴结转移组(66.67％)显着高于TNMⅢ期(18.18％)、淋巴结转移组(30.00％)(p＜0.05)。3．3 MSI、LOH与nm23H1蛋白表达的关系nm23H1蛋白在MSI阳性组和阴性组的阳性检出率分别为40％、51.28％，而其在LOH阳性组和阴性组的阳性检出率分别为54.55％、48.48％，但统计学分析表明MSI和LOH对nm23H1蛋白表达均无影响(p＞0.05)。另外，计算机图像定量分析显示，在各临床病理参数影响下，各组nm23H1蛋白的表达强度也没有差异(p＞0.05)。4．结论nm23H1蛋白可能对抑制肺鳞癌淋巴结转移有重要作用。nm23H1基因5'端非转录区微卫星的MSI和LOH对nm23H1蛋白的表达无影响，也未发现其与肺鳞癌发生发展具有相关性。
张岚, 张国俊, 高冬玲, 张云汉, 张蕾[7]2004年在《肺鳞癌组织中hMLH1、PCNA、P53及P21的表达及其与微卫星不稳定性的相关性》文中研究说明目的:探讨肺鳞癌组织中hMLH1、PCNA、P53及P21的表达及其与癌组织微卫星不稳定性(MSI)之间的关系。方法:采用免疫组化SP法检测上述各指标在18例MSI阳性和12例MSI阴性的肺鳞癌组织中的表达。结果:在肺鳞癌组织中MSI阳性组的hMLH1的阳性表达率明显低于MSI阴性组(P<0.05);MSI阳性组PCNA指数明显低于MSI阴性组(P<0.05);MSI阳性组P53及P21蛋白的阳性表达率明显高于MSI阴性组。结论:肺鳞癌hMLH1表达、PCNA标记指数与癌组织的MSI呈负相关,而P53、P21表达则与MSI呈正相关。
徐先发[8]2000年在《喉癌9p13-23区域微卫星DNA杂合性缺失的研究》文中提出头颈鳞癌(Head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)LOH的研究表明，与HNSCC发生发展有关的等位基因缺失最常发生于9p21-22区域。然而，对9p21-22区域缺失的等位靶基因仍存在争议。抑癌基因p16／CDKN2定位于9p21这一较小区域，但研究发现HNSCC的p16／CDKN2基因的遗传学改变并不常见。编码p16蛋白的基因可能并不是HNSCC在9p21-22区域发生LOH的唯一靶基因。9p21-22区域可能还存在与HNSCC发生发展有关的其它抑癌基因。精细定位9p21-22区域的等位基因缺失位点有助于这一区域其它抑癌基因的发现。 本研究采用显微切割法从42例喉癌病理切片中挑取肿瘤组织，选取9p13-23上13个高多态性微卫星引物进行PCR扩增和变性凝胶电泳来探讨喉癌9p13-23区域发生LOH的热点，并对高频发LOH的微卫星位点与喉癌患者临床病理特征进行比较分析。 结果：(1) 42例喉癌9p13-23区域等位基因LOH的总发生率是97.6％(41／42)。在13对微卫星引物中，LOH发生率最高者是位于9p22-23的D9S162(89.5％)，其次是位于9p21的D9S171(80％)。与p16／CDKN2基因紧密连锁的D9S1748的LOH发生率仅50％。(2) 等位基因缺失作图分析发现42例喉癌组织在9p13-23上存在两个明显的LOH较小区域，分别位于9p21的D9S161～D9S171之间和9p22-23的IFNA～D9S162之间。(3)
缪珑升[9]2009年在《食管鳞癌抑癌基因启动子甲基化及微卫星不稳定的研究》文中提出食管鳞癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其发生是一个多阶段,涉及遗传学及表观遗传学的复杂过程,近年来表观遗传学改变在恶性肿瘤的发生、发展中的作用越来越受到重视,其中抑癌基因启动子甲基化作为影响基因表达的新机制被广泛研究,已陆续有文献报道其在预后方面的价值,而食管鳞癌中有关抑癌基因甲基化与临床病理特征及预后之间关系的研究相对较少。微卫星不稳定则是近年来恶性肿瘤研究的又一热点,微卫星不稳定是基因组不稳定的表现,导致细胞增殖及分化异常,促进肿瘤的发生,许多肿瘤中都发现了微卫星不稳定,而食管鳞癌中有关微卫星不稳定的研究结果差异较大。有关微卫星不稳定与hMLH1基因甲基化之间的关系尚无定论,国内也未见相关报道。因此本研究选取p16~(INK4a)、E-cadherin及hMLH1叁个抑癌基因,探讨抑癌基因甲基化在食管鳞癌发生发展中的作用,并对微卫星不稳定在食管鳞癌中的发生情况及与hMLH1基因异常之间的关系做初步的研究。现对上述研究内容分别报告如下:第一部分食管鳞癌hMLH1、E-cadherin、p16~(INK4a)基因启动子甲基化的研究目的:1.检测食管鳞癌癌组织及配对正常组织中hMLH1、E-cadherin及p16~(INK4a)基因启动子甲基化的发生情况。2.评价上述叁基因甲基化在食管鳞癌发生发展中所起到的作用。方法:收集整理105例食管鳞癌患者的临床病理资料,采用酚—氯仿法提取这105例食管鳞癌癌组织及配对癌旁正常组织的基因组DNA,运用甲基化特异PCR(Methylation Specific PCR,MSP)的方法对所提DNA分别进行hMLH1、E-cadherin及p16~(INK4a)基因甲基化检测,抽选MSP产物进行普通测序或克隆测序,验证PCR扩增结果。采用Envision二步法对癌组织中hMLH1、E-cadherin及p16~(INK4a)基因蛋白表达进行免疫组化检测。分析上述叁个抑癌基因甲基化在食管鳞癌及配对正常组织中的发生情况及与临床病理特征的关系。结果:1.癌组织E-cadherin、hMLH1及p16~(INK4a)。基因启动子甲基化的阳性率分别为57.1%(60/105)、20.9%(22/105)和50.5%(53/105),正常食管粘膜相应叁个基因甲基化阳性率分别为10.5%(11/105)、1.9%(2/105)和7.6%(8/105),E-cadherin(P=0.002)、hMLH1(P=0.042)及p16~(INK4a)(P=0.004)基因在癌组织中的甲基化率均显着高于正常食管粘膜。2.食管鳞癌E-cadherin、hMLH1及p16`(INK4a)蛋白表达阳性率分别为51.4%(54/105)、78.1%(82/105)、28.6%(30/105),E-cadherin(P=0.021)及p16~(INK4a)(P=0.026)基因启动子甲基化与相应蛋白失表达显着相关,而hMLH1基因甲基化与蛋白表达无相关性。3.E-cadherin基因启动子甲基化的食管鳞癌中淋巴结转移更多见(P=0.016),p16~(INK4a)基因启动子甲基化的食管鳞癌中低分化癌更多见(P=0.024),hMLH1基因启动子甲基化与各项临床病理特征无显着关联。结论:1.食管鳞癌中p16~(INK4a)及E-cadherin基因启动子甲基化较常见,癌组织的甲基化率均远高于癌旁正常食管组织,并且导致蛋白失表达,这两个甲基化位点与食管鳞癌密切相关。2.p16`(INK4a)基因启动子甲基化与肿瘤低分化有关,但与肿瘤的浸润深度及淋巴结转移等无关,提示这一变化可能出现在食管鳞癌发生的早期阶段。E-cadherin基因启动子甲基化与淋巴结转移有关,提示其在食管鳞癌的恶性进展中可能起到一定的作用。3.食管鳞癌中有一定频率的hMLH1基因启动子甲基化,但与蛋白表达无关,与各项临床病理特征也无关,可能并不直接参与食管鳞癌的发生发展。第二部分食管鳞癌术后复发危险因素的研究目的:1.分析食管鳞癌术后两年内复发转移的发生情况及与临床病理因素的关系。2.评价hMLH1、E-cadherin及p16~(INK4a)基因甲基化对于复发的预测价值。方法:回顾分析了2006年1月至2007年2月在复旦大学附属肿瘤医院接受了食管癌二野清扫根治手术的患者105例,总结术后两年内复发情况,结合第一部分甲基化的检测结果,应用Pearson卡方检验或精确概率法比较复发率的差异,应用Logistic回归分析判定肿瘤复发的危险因素。结果:1.2年内41例(39%)患者复发。局部-区域性复发占21例(51.2%),其中纵隔淋巴结复发11例(52.4%),颈部淋巴结复发5例(23.8%)。血行转移占17例(41.5%),以肺(6例)、骨骼(5例)和肝(3例)为主,共占血行转移的82.3%,局部-区域性复发与血行转移同时发生3例(7.3%)。2.单因素分析显示淋巴结转移数目(P＜0.001)、浸润深度(P=0.002)及淋巴管、血管侵犯(P=0.001)与复发密切相关,其中淋巴结转移数目≥3个的患者术后两年复发率为69%。3.多因素Logistic回归分析显示T3期(P=0.023),淋巴结转移数目(P=0.001)是术后复发的独立危险因子,淋巴管、血管侵犯不是独立危险因素。4.无淋巴结转移食管鳞癌患者中,E-cadherin基因甲基化是唯一与复发相关的因素,有甲基化患者的复发率显着高于无甲基化患者(33.3%VS4.2%,P=0.031)。结论:1.食管癌二野清扫术后两年内39%的患者出现复发,纵隔淋巴结、颈部淋巴结、肺、骨及肝是主要的复发部位,术后应重点对这些部位定期复查。2.T3及淋巴结转移数目是食管鳞癌术后复发的危险因素,其中淋巴结转移数目≥3枚的患者术后两年复发比例很高,应考虑采取更积极的治疗方法。3.E-cadherin基因启动子甲基化与无淋巴结转移食管鳞癌的术后复发显着相关,可以考虑将其作为新的分子标志物用于复发的预测。第叁部分食管鳞癌微卫星不稳定及与hMLH1基因改变之间关系的研究目的:1.检测食管鳞癌中微卫星不稳定及hMLH1基因内的D3S1611位点杂合性缺失的发生情况。2.探讨微卫星不稳定在食管鳞癌中的作用及与hMLH1基因改变之间的关系。方法:以第一部分提取的105对癌及癌旁正常组织的基因组DNA为模板,选取BAT-26、D16s265、D9S1748及位于hMLH1基因内的D3S1611共四个微卫星位点进行检测,使用荧光标记引物扩增微卫星片段,产物进行毛细管电泳并由DNA序列检测仪自动收集荧光扫描结果,Genemapper软件进行数据收集及分析,记录并分析上述四个位点的微卫星不稳定发生情况及D3S1611位点杂合性缺失情况。结果:1.食管鳞癌MSI发生率是19%(20/105),其中D3s1611、D9s1748及D16s265位点分别有8例、5例和7例。BAT-26位点未发现微卫星不稳定,也未发现两个位点同时有MSI(MSI-H)的病例,20例均为MSI-L。2.MSI-L与各项临床病理因素均无显着关联。3.hMLH1基因内D3s1611位点的杂合性缺失率为58.6%,但与hMLH1蛋白失表达及hMLH1基因甲基化均无显着关系。4.MSI-L与hMLH1基因甲基化、杂合性缺失及蛋白失表达均无显着关系。结论:1.食管鳞癌中仅存在一定比例的低度微卫星不稳定(MSI-L),未发现高度微卫星不稳定(MSI-H)。2.MSI-L与各项临床病理因素均无关,在食管鳞癌的发生发展中可能不起关键作用。3.hMLH1基因异常可能不是MSI-L发生的原因。3.hMLH1基因内D3s1611位点有较高的杂合性缺失率,hMLH1基因可能是食管鳞癌基因改变的靶点,但基因缺失与甲基化及蛋白表达均无关,是否存在突变等其他异常有待进一步研究。
彭全洲[10]2007年在《应用微切割技术对非小细胞肺癌3p杂合性缺失的研究》文中认为目的：建立稳定的石蜡切片微切割-PCR-SSLP银染技术以应用于对存档组织蜡块的回顾性分子生物学研究，探讨3p杂合性缺失与肺癌发生发展关系的相关性，为肺癌的分子病理学诊断提供细胞遗传学、分子遗传学依据。方法：实验分两部分。第一部分：通过检测DNA提取方法、组织蜡块存档时间以及目的片断长度对PCR结果的影响，建立稳定的石蜡切片微切割-PCR技术；第二部分：采用第一部分建立的石蜡切片微切割-PCR技术，对53例肺癌标本、17例肺良性病变、10例肺鳞癌的54个正常支气管粘膜上皮、轻度异常上皮、不典型增生上皮和原位癌标本以及53例无肿瘤侵犯淋巴结标本进行3p上10个微卫星位点的PCR-SSLP-银染检测。结果：1、粗提DNA方法是微切割-PCR技术首选的DNA提取方法；2、扩增110bpDNA片段，蜡块存档时间应少于13年，扩增268bpDNA片段，蜡块存档时间应少于11年；3、目的片段长度小于536bp时能得到满意扩增；4、染色体3p等位基因缺失在肺癌中普遍存在(98.1％)且主要为多个位点缺失，53例肺癌标本中的LOH检出率分别为：3p25(57.5％)、3p22-p24.3(65.4％)、3p21-p23(58.3％)、3p21.3(76.5％)、3p14.2(66.0％)和3p12(66.7％)。大部分肺癌标本(98.1％)至少有一个位点出现LOH；5、正常支气管粘膜上皮和轻度异常上皮细胞中也可检测到3p位点的LOH，分别为62.5％和63.2％。将正常粘膜组和轻度异常上皮组合并，与不典型增生、原位癌组比较，发现后者LOH发生率明显高于前者(P=0.01)；6、比较肺癌原发灶LOH与临床病理因素的关系，发现NSCLC患者中鳞癌LOH发生率明显高于腺癌，差别具有统计学意义；鳞癌与腺鳞癌和大细胞癌比较，在3p22-p24.3(P=0.029)和3p14.2(P=0.016)位点的LOH的差别具有统计学意义，鳞癌LOH发生率高于腺鳞癌和大细胞癌；同样，腺癌在3p12位点的LOH发生率高于腺鳞癌和大细胞癌(P=0.033)。随着肿瘤分化程度的降低，LOH发生率呈现逐渐升高的趋势。3p LOH发生率与TNM分期、性别无明显关系(P＞0.05)，但在3p21-p23位点Ⅰ～Ⅱ期NSCLC的LOH发生率明显低于Ⅲ期(P=0.045)，在3p21-p23位点女性的LOH发生率要高于男性(P=0.027)；7、有肺癌家族史者的LOH发生率在检测的各个3p位点均明显高于无家族史者。结论：1、建立了稳定的石蜡切片微切割-PCR技术，进行肿瘤组织精确定位切割和微卫星不稳定、杂合性缺失等的检测；2、3p杂合性缺失是非小细胞肺癌的常发事件且常为多个位点缺失。在肺癌患者的癌前病变组织中也可检测到3p位点等位基因杂合性缺失。肺癌组织中3p21.3区域等位基因杂合性缺失的发生频率最高，在肺癌发生发展中起重要作用；3、肺鳞癌组织发生3p等位基因杂合性缺失的频率最高。随着病变程度的增加，癌前病变支气管上皮3p位点杂合性缺失的发生频率随之升高。肺癌患者的TNM分期和性别与3p位点杂合性缺失无相关性；4、有肺癌家族史者更宜出现3p位点等位基因杂合性缺失。
参考文献：
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[7]. 肺鳞癌组织中hMLH1、PCNA、P53及P21的表达及其与微卫星不稳定性的相关性[J]. 张岚, 张国俊, 高冬玲, 张云汉, 张蕾. 郑州大学学报(医学版). 2004
[8]. 喉癌9p13-23区域微卫星DNA杂合性缺失的研究[D]. 徐先发. 中国协和医科大学. 2000
[9]. 食管鳞癌抑癌基因启动子甲基化及微卫星不稳定的研究[D]. 缪珑升. 复旦大学. 2009
[10]. 应用微切割技术对非小细胞肺癌3p杂合性缺失的研究[D]. 彭全洲. 暨南大学. 2007
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