杨丽丽[1]2014年在《苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌主要杀蚊毒蛋白的克隆及表达》文中研究指明Cry4Aa、Cry4Ba是苏云金芽孢杆菌以色列亚种在芽孢时期产生的毒蛋白，Cry4Aa蛋白的分子量为130Kda，Cry4Ba蛋白的分子量为128Kda；Mtx1、Mtx2、Mtx3是球形芽孢杆菌SSII-1在营养期产生的毒蛋白，Mtx1蛋白的分子量为100Kda，Mtx2蛋白的分子量为31.8Kda，Mtx3蛋白的分子量为35.8Kda。为了进一步了解Cry4Aa、Cry4Ba、 Mtx1、Mtx2、Mtx3蛋白的特性，本文参照已发布NCBI的GenBank目的基因序列，采用软件Primer5设计Cry4Aa、Cry4Ba、Mtx1、Mtx2、Mtx3基因扩增引物，并加入酶切位点序列。以苏云金芽孢杆菌以色列亚种的质粒和球形芽孢杆菌SSII-1的染色体为模板，进行PCR扩增，将PCR产物与PMD18-T载体连接构建克隆质粒，然后进行酶切鉴定并测定序列，结果表明成功获得目的基因。将目的基因分别与pHT315载体连接，然后将表达质粒分别转入到大肠杆菌BL21和苏云金芽孢杆菌无晶体突变株内，使用IPTG诱导目的蛋白表达。生物测定结果表明Cry4Aa、Cry4Ba蛋白对淡色库蚊幼虫的致死率基本相同。但Cry4Aa、Cry4Ba蛋白的致死率要明显低于苏云金芽孢杆菌以色列亚种，这可能是由于苏云金芽孢杆菌以色列亚种菌液中含有多种毒蛋白并且具有协同作用所造成的；Mtx1与球形芽孢杆菌的毒力相当，而Mtx2、Mtx3无毒。
师永霞[2]2001年在《球形芽孢杆菌杀蚊毒素基因的克隆、序列分析及表达》文中研究指明不同的球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus，B.s）菌株对蚊幼虫具有不同的杀蚊活性和杀虫谱，其中IAB872对敏感致倦库蚊高毒，对B.s抗性致倦库蚊中毒，而LP1-G菌株对两种蚊虫品系都具有中度毒杀作用。为了探讨B.s菌株间杀蚊活性和杀蚊谱差异的分子基础，本文进行了IAB872菌株和LP1-G菌株杀蚊毒素基因的克隆、序列分析和表达。 IAB872菌株的二元毒素基因位于其染色体—3.5Kb HindⅢ片段上。IAB872菌株的总DNA经HindⅢ完全酶切后，回收3.5Kb左右的片段，连接于穿梭载体pBU4上，利用Southern blot和酶切鉴定筛选出含有二元毒素基因所在3.5KbHindⅢ外源片段的重组质粒pBS-1，随之再构建与pBS-1外源片段连接方向相反的重组质粒pBS-2。测序结果表明外源片段由3479个核苷酸组成，其上二元毒素基因的核苷酸序列与2362菌株二元毒素的核苷酸序列完全相同。将pBS-1和pBS-2电激转入苏云金杆菌无晶体型菌株4Q-7（cry~-）中获得转化菌株Bt-BS1和Bt-BS2，SDS-PAGE和Western blot检测证实了IAB872菌株的二元毒素基因在转化菌株中获得了表达，在电镜下可观察到表达的二元毒素蛋白在转化菌株中形成了菱形和不规则形晶体。转化菌株的生测结果表明Bt-BS1和Bt-BS2对敏感蚊幼虫的毒力与野生株IAB872相当，均对敏感蚊幼虫具有高毒力，LC_(50)值分别为2.32×10~(-6)和5.89×10~(-7)，但与IAB872野生株的杀蚊活性不同的是，转化菌株对抗性蚊幼虫完全无毒，所以IAB872菌株对抗性蚊幼虫的毒力可能是作用机理不同于二无毒素的Mtx毒素或其它毒素造成的。此外，Bt-BS2的杀蚊毒力高于Bt-BS1，Bt-BS1和Bt-BS2对蚊幼虫毒力的不同可能是由于重组质粒上外源片段的插入方向影响二元毒素基因在受体菌中的表达水平的缘故。 另外，本论文还将LP1-G菌株的杀蚊毒素基因在E.coli中进行了克隆。LP1-G菌株的总DNA经HindⅢ随机不完全酶切，纯化后的酶切产物与pUC18载体连接后转化，筛选E.coli转化子，构建部分基因组文库。通过生测的方法从E.coli转化子中筛选出一株对敏感和抗性蚊幼虫均有中等毒力的菌株E-UL68，其对敏感和C3-41抗性蚊幼虫的LC_(50)分别为2.58×10~(-4)和3.66×10~(-4)，与LP1-G野生株的毒力相当。测序结果表明外源片段由3876个核苷酸组成，其编码区的核苷酸 中国科学院硕士研究生毕业论文序列与SSll．l菌株的mtrl基因完全相同。因为＊心中二元毒素基因的表达产物对敏感和抗性蚊幼虫完全无毒，但该茵株抱子囊时期的发酵液对敏感和抗性蚊幼虫具有中等的毒力，因此，推测 LP IG菌株对蚊幼虫的毒力可能是由于该菌株的mtrl基因表达产生的杀蚊毒素或者该菌株在芽抱形成期表达的其它杀蚊活性因子引起的。
梁钧[3]2003年在《杀蚊球形芽孢杆菌pLG质粒的序列分析及复制单元特性》文中指出球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus，B.s）菌株是防治蚊虫的重要病原菌，由于其的杀蚊毒素基因是位于染色体上，质粒的分子量小，所能提供的生物信息量少，因此对Bs质粒还未见有关生物信息学方面的研究报道。本研究对通过对Bs Lp1-G株分离到的隐形质粒的全序列测定及详尽的生物信息学分析，首次报道了Bs小质粒的分子遗传学信息。通过改进的QIAGEN质粒试剂盒法，获得了高纯度质粒DNA。根据酶解的结果，选择了HindIII的一组片段，大小分别为6.4 kb、4.3 kb和0.75 kb，将其克隆到pUC18并进行序列测定。同时在各已测片段接头处利用PCR技术通过Primer Walking法覆盖测序gap，并判定各片段的拼接方式，从而获得质粒全序列。测序结果显示全长11,066 bp，平均CG％为37.92%。经过软件识别和综合分析确定其编码序列即ORF为23个。基因编码密度为2.078个基因/kb，编码链的平均长度为416 bp，编码序列占全序列的百分比为86.6%，该质粒的Genbank登记号为AY325804。通过与公共数据库比对，发现可以识别功能的ORF共有4个。其中最重要的是与质粒复制所必需的rep基因，pLG的rep基因与已测序的苏云金芽孢杆菌质粒 pBMB9741和苏云金芽孢杆菌质粒pGI1的复制蛋白基因在氨基酸序列上分别有47.53%和40.89%同源性。并根据rep基因的同源性比较，判断pLG的复制模式归属与RCR模式的GroupIII组，即pC194家族。ORF16与已测序的苏云金芽孢杆菌质粒 pGI3编码的一个23.1 kDa蛋白在氨基酸序列上有30.89%的同源性，但功能未知。并且在这个ORF中存在的ATP/GTP结合结构域独有的P-loop结构。另外ORF7和ORF8分别可能编码富脯氨酸转运蛋白和膜结合水解酶基因，同时这两个OFR都存在信号肽序列。为了研究其复制单元的特性，我们将pLG质粒用酶解为大小不同的片段，分别克隆到载体pAW001上，转化Bt 4Q7观察其复制能力。初步结果表明重组克隆子pAW2的插入片段含有 pLG的复制单元，转化率约为3x10~3个/(g DNA。
张蓓华[4]2002年在《球形芽孢杆菌100KD杀蚊毒素和Cyt1Aa毒素在苏云金芽孢杆菌中的协同作用》文中提出Mtx1(100 kD mosquitocidal toxin)杀蚊毒素是一种在球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus,B.s)营养体期表达的毒素蛋白，其纯化蛋白对蚊幼的毒力与二元毒素相当。但它在野生型菌株中的表达量低，易被蛋白酶降解失活。 为了提高Mtx1杀蚊毒素蛋白的表达量和稳定性，本文将来源于球形芽孢杆菌B.sSSⅡ-1的mtx1毒素基因克隆至穿梭载体pBU4上，得到mtx1插入方向相反的重组质粒pMT9和pMT4。含有pMT9和pMT4的大肠杆菌转化子能表达产生Mtx1毒素，发酵液对敏感和抗性致倦库蚊幼虫具有中度毒杀作用；含有pMT9和pMT4的苏云金芽孢杆菌转化子B-pMT9和B-pMT4在营养体生长阶段对敏感蚊幼和抗性幼虫也具有毒性，毒力与野生型B.sSSⅡ-1相当，而不同转化子在芽孢形成期的毒力因插入的mtx1基因转录方向不同而表现出差异，其中B-pMT4对目标蚊幼毒力极低(LC_(50)＞10mg／mL)，而B-pMT9对蚊幼虫具有毒性(LC_(50)=2.49mg／mL)。同时，将来源于苏云金芽孢杆菌以色列亚种(B.thuringiensis subsp.israelensis,B.t.i)的cytlAa基因和P20伴侣蛋白基因克隆连接到质粒pMT9中，并转化到苏云金芽孢杆菌无晶体型中得到重组转化子B-pMPX2，电镜观察发现重组转化子B-pMPX2形成一菱形晶体。SDS-PAGE电泳证明转化子B－pMPX2中Cyt1Aa蛋白过量表达。生物测定结果表明B-pMPX2无论在营养体期还是在芽孢期，对敏感和抗性致倦库蚊具有中毒毒杀作用，而且其杀蚊毒力稳定，与mtx1在蛋白酶缺陷型的菌株表达情况类似。同时，对不同稀释度的重组菌株最终发酵液以及B.sSSⅡ－1营养体期发酵液分段时间的毒力曲线表明，在P20蛋白作用下，Cyt1Aa与Mtx1毒素具有一定的协同作用。生物测定结果表明，在对致倦库蚊蚊幼95％致死浓度下，B－pMT9、B－pMPX2和只含cyt1Aa基因的B－pBA30对3-4致倦库蚊的LT_(50)值分别为28.53h、17.22h和7.61h，说明Cyt1Aa毒素能够提高Mtx1毒素的杀蚊速度。
袁志明, Ｎｉｅｌｓｅｎ-ＬｅＲｏｕｘ, Ｃ, Ｐａｓｔｅｕｒ, Ｎ, Ｄｅｌｅｃｌｕｓｅ, Ａ, Ｃｈａｒｌｅｓ, Ｊ-Ｆ[5]1999年在《球形芽孢杆菌C_3-41二元毒素基因在苏云金芽孢杆菌以色列亚种中的克隆和表达》文中研究指明球形芽孢杆菌Ｃ３４１是我国分离的一株对蚊幼虫有毒杀作用的高毒力菌株，对库蚊、按蚊幼虫的毒性高于２３６２菌株，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明Ｃ３４１总ＤＮＡ中３５ＫｂＨｉｎｄＩＩ片段上带有４１９和５１４ｋＤ二元毒素基因，该片段由３４７９个核苷酸组成，核苷酸序列同２３６２菌株的二元毒素基因序列完全相同。含二元毒素基因的重组质粒ｐＣＷ１和ｐＣＷ２能在大肠杆菌中表达产生二元毒素蛋白，但表达量低，重组子杀蚊毒性低。无晶体型苏云金芽孢杆菌以色列亚种重组子在其芽孢形成中能产生以晶体形式存在的二元毒素蛋白，其全发酵液和纯化晶体蛋白的杀蚊活性与Ｃ３４１相近。
张琪[6]2010年在《苏云金芽孢杆菌BRC-LLP29菌株cyt2B基因的克隆、表达及杀蚊活性测定》文中进行了进一步梳理Cyt蛋白是由苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis.subsp. israelensis,Bti)在芽形成孢阶段产生的δ-内毒素组成。本研究根据己报道在NCBI上的cyt2B基因序列,设计特异引物对Bt LLP29菌株中总DNA进行PCR扩增,得到大小约为1,000bp的类似cyt2B基因,对该基因进行克隆、表达,确定了菌株中cyt2B基因的存在,以pGEX-KG为表达载体构建cyt2B基因的表达重组质粒,并对其杀蚊活性进行测定,从而试图探索Cyt2B蛋白的生物活性及其在菌株中的生物功能。结果表明,经PCR扩增、克隆、测序,获得序列大小约为1,000bp的基因全序列,序列里包含两个ORF,大小分别为789 bp和117 bp,其中789bp编码约为262个氨基酸,与文献中Cyt2B蛋白的氨基酸大小一致。利用NCBI上的Blast在线软件进行比较,发现10个Bt cyt2B基因序列以及多个基因组片段,其中与己报道的cyt2Ba7,cyt2Ba8等5个基因全序列(包括原始基因片段)同源性达到98%。因此,判断克隆出来的基因序列为cyt2B基因。经SDS-PAGE验证诱导表达重组菌株,显示该蛋白大小约为30kD,确定该基因编码的蛋白为Cyt2B。取Cyt2B蛋白表达重组菌株对白蚊伊蚊和致倦库蚊进行毒性测试,与Bt LLP29菌株相比,该表达菌株并不显示杀蚊活性。
郑爱萍[7]2003年在《微生物来源的防病、杀虫相关因子的分离与功能解析研究》文中提出微生物可作为研究生物学的理想材料，同时由于具有代谢能力强、功能各具特色、产物多种多样，在农业、医学、食品以及许多工业中的应用也历来受到人们的关注。特别是农用微生物资源，可进行微生物农药、微生物肥料的产业化。随着经济的发展，人们对绿色无公害食品的需求越来越大，化学农药的一些高残留、高毒性、破坏生态环境的特点被认识到，基于此种状况，所以有必要探求新型的生物农药，以期能为保持生态平衡，保护人类的健康，为农业可持续发展打下基础。 本研究在四川生态条件下，针对特有的农用微生物资源，进行了防病、杀虫因子的分离以及结构解析研究，希望能为四川生态条件下微生物源农药的产业化提供条件和理论基础。主要结果如下： 一、农用抗生素的研究 1．从土壤中筛选土壤链霉菌，通过反复纯化，以水稻稻瘟病、水稻纹枯病病原菌作为指示菌，在PDA平板上与病原菌进行对峙培养，共获得150株对病原菌有不同程度抑制作用的链霉菌株。根据对病原菌的抑制效果，共获得4株链霉菌菌株，分别编号为S-21、S-25、S-26、S-34。 2．通过生理、生化检测和形态鉴定，S-21、S-25、S34、S-26菌株分别被确定为Streptomyces flavescens、Streptomyces luteogriseus、Streptomyces lavendularectus、Streptomyces fradiae var．Sichuan。 3．抑菌谱、杀虫谱测定结果表明，菌株对14种病原菌具有不同程度的抑制作用，综合抑制效果，S-26对水稻病害和蔬菜病害病原菌具有比较明显的抑制优势，具有广泛的抑菌谱带，发酵菌液的上清液，饲喂害虫，利用发酵原液作为对照，S2-26、S2-25对于供试害虫具有较好的杀虫效果，特别是S-26处理后，草地蝗虫、十八星瓢虫、螨虫的校正死亡率均在82％以上，最高可达98.2％。 4．发酵液有效成分稳定性的检测结果表明，利用S2-26菌株在普通发酵培养基，收集发酵液，经过120℃30min，分别在PH8、PH6的作用，紫外线照射30min，发酵液与水稻纹枯病原菌拮抗作用，仍然具有强拮抗活性，抑菌圈直径为6.0-5.5cm，与对照差异不明显，表明S2-26的有效次生代谢产物具有稳定的特性。 5．发酵配方和发酵条件实验表明，菌株在碳源为10％淀粉、氮源为2％的花生饼粉，培养条件在28℃条件、转速为250r／min、5％接种量、起始PH为5时、加入优化培养基150ml、一级种子的培养时间为72h、发酵时间为144h的条件下，可以获得最好的抑菌效果，且整个发酵过程中以一次性加入各培养基成分为效果最好。 6．田间试验表明，应用上述优化配方进行发酵，收集发酵菌液，进行大田防治水稻纹枯病，田间防效达到50.2％，高出井冈霉素和清水对照，对茄十八星瓢虫试验表明，对瓢虫的防效达到78.5%。高于清水对照，并对平均结实个数和结实率具有促进作用，高于其它对照。针对编号为S一26的菌株并进行了发酵生物学特性的研究，并经过发酵产物的分离、纯化，通过IH一NMR、1 3C一MR、红外、紫外、质谱、H一HCOSY、H一CCOSY、HMBC等测定了asperufoside、pinoresino、eseuletin、magnolioside、52、536种化合物的结构，通过功能测定，52、S3化合物为功能性化合物，结构解析表明，是一类杀虫、防病的大环内醋类抗生素。经过叁维结构模拟和功能预测，该类化合物可能通过阻断虫体神经信号传导而达到杀虫效果的。二、芽抱类杀虫基因的研究1.本研究在四力}生态条件下，对芽抱杆菌进行分离筛选，共获得279株，经过特异引物 对基因型进行分析，结果表明107株菌株具有明显的多态性2.多态性分析表明，所分析的资源含有4种复合基因型的比例高，对鞘翅目有特异作用 的芽抱杆菌资源最多，聚类分析表明，具有十分多样的基因分布特点。3.通过生理生化检测和形态指标的测定，确定了其中为非Bt芽抱杆菌2、4一14、39、D3 菌株分别为刀acizzusfasrs成osus、刀aeszzus刀rmus、刀aeillus cereos、Baeillus me卯terium菌 类，确定了s、sL、不SS菌株分别为Bacillus thringglensis var tolworthi、Bacillus thringiensis var刀nitimus、Baeillus thringiensis var entomocidus、Bacillus rhingiensis var galleriae4类苏云金芽抱杆菌的分类地位。4.对2种D3、39芽饱杆菌基因进行测序分析、比较，结果表明，cry1Ab类基因与报道 的基因一致，cry1Ac、cry1C类基因与报道的基因核昔酸具有一定的同源性，分别为 87%、89%和78%，氨基酸序列比较:同源性分别为76.5%、79.8%、51%，不同菌株 种类之间cry IA。类之间核昔酸同源性为90%，氨基酸的同源性为85%。5.通过PcR克隆方法获得cry1Ab基因的全长序列。6.通过饲喂、小区实验，测定了菌株的杀虫谱和毒力方程。大田防效测定表明，该类与 所报道的cry基因具有一定同源性的菌株具有比很好的防治效果，最高防虫效果可达 到98%，显着高于对照和Bt悬浮制剂，并显示对鳞翅目、鞘翅目害虫较宽的杀虫谱。7.对cry类基因进行了定位和毒性蛋白质的分离、纯化，同时，还进行生物学特性等方 面的研究。叁、抑菌肤研究1.从黄瓜植株的根围土壤中分离到有拮抗性的细菌100多株。通过对峙法?
张文飞[8]2011年在《苏云金芽孢杆菌分离与新型cry基因资源的挖掘》文中进行了进一步梳理苏云金芽孢杆菌(简称：Bt)为土着的革兰氏阳性细菌,广泛分布于自然界,能够在各种不同的生境中分离得到,譬如土壤、树叶、水中、昆虫体内等。Bt菌区别其它芽孢杆菌的最大的特点是在生长后期有晶体蛋白会伴随芽孢的形成而生成,一般称为伴胞晶体。Bt菌株被认为是一种昆虫病原菌,其致病性主要或者完全取决于伴孢晶体蛋白,近年大量文献报道了各种Bt菌株对鳞翅目,鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目昆虫有杀虫活性,同时还发现一些Bt菌株对线虫、螨类和寄生虫有不同程度的活性。现今Bt被广泛应用商业化农业生产、森林害虫防治以及蚊虫控制,已经成为化学合成农药必要的补充或替代产品。尤其是来自Bt菌的杀虫晶体蛋白基因作为转基因作物关键性的基因资源,已经成功转入各种重要的农作物而为之提供抗虫能力最为引人关注。然而,现有的Bt毒蛋白依然对许多重要的农业害虫无能无力,需要进一步筛选分离新型Bt菌株和毒蛋白来有效控制它们。此外,现有Bt毒蛋白多年被反复应用,部分昆虫已经或正在逐渐形成抗性。因此全世界各国还在继续开展一系列高密度Bt菌株筛选和毒蛋白基因鉴定克隆的项目。从2004年起,我们发起了对中国各自然保护区Bt资源收集和新型杀虫基因鉴定克隆的研究项目。迄今为止,我们从黑龙江的凉水国家自然保护区(温带),广西区的大王岭、十万大山和弄岗国家自然保护(亚热带),以及海南尖峰、吊罗山、霸王岭岭和五指山热带国家自然保护区,共收集了2,916份土壤样品。利用醋酸钠-温度筛选方法,总共分离获得5,915株芽孢杆菌和208份Bt菌株,菌株平均分离率为3.52%,至此,一个较具规模的芽孢杆菌和Bt菌株库在海南热带农业资源研究所(HITAR)建成。与此同时我们对Bt菌株分布和生境相互关系进行了分析,为了解Bt菌株分布和进一步分离筛选Bt菌株提供思路。本研究中采取扫描电镜观察(SEM)、SDS-PAGE蛋白电泳分析、脉冲场电泳分析、以及生物活性测定等方法对Bt分离株进行鉴定和分析。为了鉴定Bt分离株所含有的新型杀虫晶体蛋白基因,我们发展了新的Polymerase Chain Reaction-fragment length polymorphism (PCR-RFLP)鉴定体系,从不同Bt菌株中鉴定克隆10个新型的cry基因,包括cry1Ac22、cry1Ac30、 cry1Ac31、cry30Ea1、cry30Ga2、cry40Da1、cry50Ba1和cry54Ba1等基因。研究结果表明我们发展的新型PCR-RFLP鉴定体系不仅可以鉴定已知cry基因,还能鉴定未知的cry基因,我们相信应用这套新型PCR-RFLP杀虫蛋白基因鉴定体系,将来会有更多的杀虫基因被鉴定克隆。接下来传统的DNA文库,PCR方法,包括Inverse PCR和single oligonucleotide nested-PCR(SON-PCR)等方法,被用来克隆鉴定的杀虫基因的全序列。两种表达体系用于克隆的cry基因的表达,分别用大肠杆菌和Bt无晶体突变株作为表达宿主。鳞翅目昆虫小菜蛾、双翅目昆虫致倦库蚊和白纹伊蚊以及鞘翅目昆虫椰心叶甲幼虫作为靶标昆虫用来测试表达蛋白和Bt菌株的杀虫活性。生物测定结果表明表达的Cry1蛋白对小菜蛾幼虫有很高的杀虫活性。蚊虫是一种非常重要的疾病媒介昆虫,在全世界范围内广泛传播各种人和动物致病病毒和寄生虫,诸如疟疾、黄热病、登革热、丝虫病、乙型脑炎和西尼罗河病毒等。由于没有成功开发或者开发成本过于昂贵,目前有效的预防药和疫苗还未普及,因此控制这些蚊媒疾病主要靠控制蚊的数量来降低蚊媒疾病的大规模爆发。但由于化学合成杀蚊剂对环境污染和蚊虫极易对化学杀蚊剂产生抗性,人们逐渐把注意力转向了生物农药,以杀蚊Bt菌为代表的生物农药的表现令人鼓舞。尤其是苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bti)具有高效的杀蚊活性,而且蚊虫不容易对之产生抗性,最重要是对环境友好,被世界卫生组织(WHO)推荐来控制蚊虫的滋生而降低蚊媒疾病爆发。Bti作为化学杀蚊剂的补充多年来被广泛应用,长期反复使用Bti的毒素蛋白,大大增加了蚊对之产生抗性的风险。本研究中分离鉴定了30多株对蚊有活性的Bt菌株,其中BtS2160-1具有和Bti相当的杀蚊活性。但是BtS2160-1的大质粒的脉冲场电泳分析、伴孢晶体蛋白的SDS-PAGE电泳分析、以及cry基因类型等与Bti表现出很大的差异。因此我们有理由相信BtS2160-1是一种新的杀蚊Bt菌株,可以与Bti的互为补充应用于蚊虫的控制,减少蚊虫对Bti的毒蛋白产生抗性的风险。我们应用PCR-RFLP鉴定体系成功鉴定Bt S2160-1中含有cry30Eal, cry30Ga2,cry50Ba1和cry54Bal4个新型杀虫基因,但是另外2种主要的晶体蛋白(140kDa和30kDa)对应的杀虫基因没有鉴定出来。进一步利用质谱分析晶体蛋白,结果发现只有cry50Ba和cry54Ba基因被鉴定在BtS2160-1菌株中表达,其它2个cry30基因在原始宿主中不表达或者表达微弱。然而表达的Cry54Ba蛋白只表现出较低的杀蚊活性,在原始宿主中可能和其它的毒素蛋白有协同作用而发挥更大杀虫活性。基因组测序分析表明许多以前没有被鉴定的杀虫基因,但发现它们实际并没有杀虫活性,一般被认为是假基因。Bt S2160-1菌株中cry30Ea和cry30Ga基因初步鉴定在原始宿主不表达,类似于假基因。总的来说,中国具有辽阔的疆域,具有独一无二的生态环境和地理特征,并且拥有丰富生物资源和良好的物种多样性,蕴藏了大量Bt菌株资源亟待我们开发利用。本研究着重Bt菌株资源收集和杀虫基因鉴定克隆,以期获得新杀虫菌株和杀虫基因应用于农业生产、森林保护和疾病媒介昆虫的控制,而这些研究对农业生产、环境保护和疾病防治将是非常必要和有意义的。
刘汉军[9]2005年在《hwtx-Ⅰ基因四价体表达载体构建及苏云金芽孢杆菌工程菌株研究》文中研究表明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)编码杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)的cry基因中cry1类基因的启动子是一类芽孢依赖型启动子,从芽孢形成T_2期开始被激活。虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ(Huwentoxin-Ⅰ,简称Hwtx-Ⅰ)是虎纹捕鸟蛛分泌产生的一类乙酰胆碱受体阻断剂,作用于神经肌肉的连接处,能阻断神经肌肉的信号传导,其溶液构象为叁对二硫键和叁股反平行β折叠的抑制剂胱氨酸结构模体。同时,其生物学活性表明也是一种N型Ca~(2+)离子通道的阻断剂。本研究根据已知的Hwtx-Ⅰ氨基酸序列,按照苏云金芽孢杆菌偏爱密码,将氨基酸序列转换成核苷酸序列,并将其基因单价体分片段化学合成。将合成片段磷酸化并退火连接。同时设计一段含有核酸内切酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ位点的衔接子linker,利用这两种内切酶酶切后的粘性末端互补这一特性,可将hwtx-Ⅰ基因头尾串联形成四价体。 带有Bt杀虫晶体蛋白基因cry1Ac的质粒pUA19经内切酶BsaBI和MunI酶切后,去掉了cry1Ac基因的ORF,只剩下cry1Ac基因的上游启动子序列和下游终止子序列。将设计的linker片段插入此位点,得到pUAK质粒,利用内切酶SpeⅠ和Xba Ⅰ双酶切后将已退火连接好的hwtx-Ⅰ基因插入其中,得到质粒pUKH1。将质粒pUKH1分别用SalⅠ/SpeⅠ 和Sal Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切回收其中目的片段,连接后得到质粒pUKH2,将此质粒分别用SalⅠ/JpeⅠ和Sal Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切回收其中目的片段,连接后得到质粒pUKH4。将pUKH4用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切回收1.1kb片段,与同样双酶切的大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌的穿梭载体pHT304连接得到表达质粒pXH4。将pXH4分别电转入苏云金芽孢杆菌无晶体突变株XBU001和野生型菌株Bt4.0718中,Hwtx-Ⅰ四价体在苏云金芽孢杆菌转化子中得到表达,蛋白质定量分析显示目的蛋白摇瓶发酵表达量达到14.0mg/L。目的蛋白在XBU001的重组子UH04中占可溶性蛋白总量的11.48%,在Bt4.0718的重组子Bh4-4中占可溶性蛋白总量的4.51%。生测结果显
韩蓓, 蔡亚君, 胡晓敏, 袁志明[10]2008年在《球形芽胞杆菌C3-41磷酸果糖激酶的克隆、表达及基本生物活性》文中提出【目的】球形芽孢杆菌缺乏EMP、HMP、ED途径的关键酶,如磷酸果糖激酶等被认为是其不能以糖类物质进行生长的主要原因。杀蚊球形芽孢杆菌C3-41全基因组序列分析表明,在染色体DNA上存在的磷酸果糖激酶基因pfk,为了进一步分析球形芽孢杆菌糖酵解途径,进一步确定磷酸果糖激酶在糖酵解途径中的功能。【方法】通过pfk基因在球形芽孢杆菌菌株中的Southern-blot拷贝数鉴定,在C3-41pfk基因克隆的基础上进行pfk基因在大肠杆菌中的融合表达、序列分析和序列比对等方法进行研究。【结果】证明了球形芽孢杆菌pfk基因由960bp核苷酸组成,表达42kDa的PFK融合蛋白,有保守的底物结合域和ATP结合域,同时pfk基因重组表达质粒可以回复大肠杆菌pfk缺陷型菌株DF1020代谢糖的能力。【结论】杀蚊球形芽孢杆菌C3-41的pfk表达产物具有磷酸果糖激酶活性,为今后深入研究球形芽孢杆菌产能代谢机理奠定了基础。
参考文献：
[1]. 苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌主要杀蚊毒蛋白的克隆及表达[D]. 杨丽丽. 黑龙江八一农垦大学. 2014
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