江凌晓[1]2000年在《人微小病毒B19结构蛋白VP1/VP2区基因克隆及序列分析》文中进行了进一步梳理人微小病毒B19（human parvovirus B19，PVB19）是微小病毒科微小病毒属中目前已知的唯一致人类疾病的病毒，也是动物病毒中体积最小结构最简单的DNA病毒。现已证实该病毒同多种儿童及成人疾病有关，且随着检测手段的改进及研究的深入，其疾病谱还在不断扩大。 本研究应用巢式聚合酶链反应（Nest-PCR）对473例临床标本进行了检测，共发现17例阳性标本。其阳性疾病谱分别为过敏性紫癜1例，急性淋巴细胞白血病2例，急性非淋巴细胞白血病1例，再生障碍性贫血1例，肝癌术后1例，乙型病毒性肝炎4例，丙型病毒性肝炎1例，非甲-戊型肝炎2例，查体（无症状）2例，皮疹1例，脑炎1例。 17例阳性标本中有2例的临床资料完整而清晰，因此，为初步了解PVB19病毒广东分离株的基因变异情况，我们用加强聚合酶链反应（re-PCR）扩增了这2例阳性标本（一例为活动性肝硬化伴再生障碍性贫血患者，另一例为患急性淋巴细胞白血病的儿童）的PVB19病毒结构蛋白VP1/VP2区（2909-3806 nt）长约898bp的基因片段。该目的片段经TA克隆后进行核苷酸序列测定。测定序列与标准序列比较后发现：同一时间，在广东地区分离的PVB19病毒株核苷酸变异率有很大差别，两株病毒在该区段的核苷酸变异数分别为32和10，对应的氨基酸变异数分别为6和1。通过与Genbank中已有的该区段核苷酸序列进行种系发生树分析后发现PVB19病毒中国流行株属种系发生树分型的Ⅰ型且与欧美、日本、韩国流行株在进化速度上有很大差异。另外还发现PVB19病毒株种系发生树分型结果与感染PVB19后的临床表现关系不明确。
靳静[2]2006年在《郑州地区孕妇感染B19病毒的调查和分离株全基因克隆及序列分析》文中研究说明背景与目的：人微小病毒B19(Human Parvovirus B19)是目前已知的微小病毒科微小病毒属中唯一使人类致病的病毒，也是动物病毒中体积最小结构最简单的DNA病毒。主要经呼吸道和血液途径传播，可引起社区局部流行。自1990年首次证实我国存在该病毒感染后，陆续报告B19病毒是我国孕妇非免疫性流产、儿童急性再障危象、急性血小板减少性紫癜等疾病的重要病因之一。孕妇感染B19病毒者较容易通过垂直传播，导致胎儿水肿、自然流产及死胎。而在我国，多数妇女血清中缺少保护性抗体，易发生该病毒的感染。现在一般诊断B19病毒感染多采用PCR与ELISA抗体检测结合的方法。在郑州地区，孕妇感染人微小病毒B19的情况尚无人报道。而且，国内尚无B19病毒全基因序列的报道，对B19病毒序列分析也不多，我国B19流行株与国外B19病毒标准株基因差异的参考数据也不甚充足。因此，本研究应用ELISA与PCR方法分别检测血清B19 IgM抗体、B19 IgG抗体和B19-DNA，从而对该地区孕妇感染人微小病毒B19做出判断。同时，从B19病毒感染流产的孕妇血清中，用PCR方法扩增并克隆出病毒全基因，进行序列分析，为国内B19病毒序列分析提供该地区的数据资料。方法：将收集的29例不明原因流产或死胎孕妇的血清设为观察组，237例正常孕妇血清作为对照组。使用ELISA方法分别检测血清标本中的B19 IgG和IgM；提取血清标本DNA，以其为模板进行PCR检测病毒感染情况。并利用统计学软件对所得结果进行统计学分析。根据GenBank发表B19的全基因序列(NC_000883)设计7对重叠序列引物，所设计合成的重叠引物对应扩增序列的总合囊括了参考序列的全序列；利用PCR和分子克隆技术，从B19阳性的流产感染者血清标本中分别扩增出预期B19病毒的7个互相重叠的区段；将其分别与pGEM-Teasy载体连接，转化入JM109大肠杆菌中，利用氨苄青霉素抗性、蓝白筛选筛选出阳性克隆，并以PCR方法对阳性菌落进行鉴定，从而构建出含B19病毒全基因的T载体克隆，并送测序分析。结果：1．29例不明原因流产或死胎孕妇血清B19 IgG、B19 IgM阳性率分别为51.7％(15/29)、6.9％(2/29)，237例正常孕妇对照组血清B19 IgG、B19 IgM阳性率分别为30.4％(72/237)、6.9％(2/29)。2．29例不明原因流产或死胎孕妇血清中B19-DNA PCR检测阳性率为13.8％(4/29)；对照组检测阳性率2.5％(6/237)。3．分别成功构建含有B19病毒7个互相重叠的片段的T载体重组克隆质粒。4．郑州市B19病毒分离株与GenBank NC_000883比较显示仅有10个核苷酸的不同，可导致2个不重要编码氨基酸的改变。结论：血清中B19 IgG、IgM、B19-DNA阳性率与国内外报道基本一致。郑州地区孕妇中存在人微小病毒B19的感染。郑州株B19与GenBank中B19基因序列NC_000883比较具有极高的同源性，仅存在10个核苷酸的变异，都是碱基变化，未发现碱基的插入或缺失现象，并且只有2个碱基变化导致氨基酸的改变。这与国外研究结论一致，即不同的B19病毒株之间基因变异很小。
李志宏[3]2007年在《人细小病毒B19 VP1表达蛋白的纯化及免疫活性的研究》文中认为人细小病毒B19(human parvovirus b19, PVB19)是细小病毒科细小病毒属中目前已知的唯一致人类疾病的病毒,也是动物病毒中体积最小结构最简单的DNA病毒。现已证实该病毒与多种儿童及成人疾病有关。1990年我科首次证实国内存在该病毒感染,随后的研究发现其是我国儿童急性再生障碍性贫血、急性血小板减少性紫癜、胎儿水肿及孕妇非免疫性流产等疾病的重要病因之一,并与先天性心脏病、类风湿关节炎(RA)发病相关。B19病毒是由5.6Kb核苷酸组成,编码一个非结构蛋白(NS1)和两个结构蛋白(VP1, VP2)。B19病毒壳蛋白主要由VP2蛋白组成,VP1蛋白不超过壳蛋白的10%,其独特区暴露在病毒的表面。B19病毒的抗原表位区集中在VP1独特区和VP1-VP2连接区。只有VP1独特区和VP1-VP2连接区基因编码的蛋白才能刺激机体产生保护性抗体。非结构蛋白NS和B19病毒毒力有关。VP1和VP2蛋白,特别是VP1独特区,对B19病毒的诊断和保护性疫苗的制备非常有意义。但是,由于B19病毒不能在传统的培养基上生长繁殖,使B19病毒抗原来源十分困难;加之XA株B19病毒VP1独特区在核苷酸水平和氨基酸水平上与标准株相比存在着显著的差异,故需要大量制备中国株B19病毒VP1蛋白作为抗原,为制备特异性诊断试剂和疫苗创造条件。研究目的:本项实验是在构建B19病毒VP1基因原核表达载体基础上大量表达VP1蛋白,进一步对VP1蛋白进行纯化,以纯化蛋白作为免疫原免疫动物制备其单克隆抗体,检测VP1蛋白的免疫原性及其单克隆抗体的免疫活性,为以后研究VP1蛋白的生物学功能,和B19病毒的防治奠定基础。实验方法:1.首先通过酶切、电泳鉴定我们已构建的VP1-PUC19质粒,将VP1片断连接质粒PQE30,用氯化钙法制备和转化大肠杆菌M15,送菌测序。2.运用IPTG诱导含有VP1-PQE30质粒的发酵培养菌株表达VP1融合蛋白,并通过SDS-PAGE和Western-blot技术分析蛋白表达情况及鉴定表达蛋白,利用AKTA explorer 100快速纯化系统纯化表达蛋白。3.以纯化的蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,末次加强免疫后3d取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经HAT选择培养,通过ELISA反复筛选阳性克隆,有限稀释法进行5次以上的亚克隆,得到的稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株后用Western-blot鉴定其特异性。实验结果:1.VPl-PUC19经BamHI和SalI双酶切可切出分子量约480bp的片段,与预期结果相符。转化后的大肠杆菌M15测序结果证实序列完全正确。2.含有VP1-PQE30质粒的菌株经诱导剂IPTG诱导,可表达分子量约为22KD的蛋白,经Western-blot鉴定,均可与6-His抗体结合,为VP1融合蛋白。3.经AKTA explorer 100快速纯化系统纯化表达的融合蛋白,收获复性蛋白75g,纯度达95%以上。4.反复筛选获得两株稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株:LI和ZH; Western- blot结果显示该单抗有较强的特异性。结论:1.成功构建了人细小病毒B19 XA株VPl基因的原核表达系统VP1-PQE30-M15.2.用发酵罐培养含有VP1-PQE30的大肠杆菌M15,可诱导B19病毒VP1蛋白大量表达。3.通过AKTA explorer 100快速纯化系统进行蛋白纯化,蛋白纯度达95%以上。4.首次在国内建立了可稳定表达的B19病毒VP1蛋白的杂交瘤细胞株,获高效价鼠抗B19病毒VP1蛋白单克隆抗体,为B19病毒VP1基因变异和B19病毒感染检测试剂盒的研究奠定了基础。
张学红[4]2009年在《细小病毒B19与人博卡病毒的基因检测及基因特异性探针的初步研究》文中指出细小病毒属于小DNA病毒,有的可以自主复制(如B19病毒、HBoV以及CPV、PPV),有的则需依赖其它辅助病毒才能复制(如AAV),可引起人类及动物多种疾病。自主细小病毒基因组序列有一些共同点,多数成员间核苷酸序列同源性较高。通常细小病毒具有宿主特异性,但是近年的一些研究结果表明,随着新的细小病毒突变株的出现及新的细小病毒的被发现,细小病毒的宿主特异性正在发生改变,在未来动物细小病毒有可能象SARS相关冠状病毒一样感染人类。目前我国儿童中主要存在B19病毒及HBoV感染,两者均可通过呼吸道传播。B19病毒可引起儿童第五病、急性再生障碍性贫血危象及急性血小板减少性紫癜等疾病,尤其是免疫功能低下或缺陷患儿可发生持续感染和慢性贫血,危及生命。HBoV是与牛细小病毒和犬极小病毒同属细小病毒亚科中的博卡病毒属,可引起儿童急性呼吸道感染。目前,国内外所建立的细小病毒检测技术是依据单株病毒或标准株的基因序列分析,不是一套各细小病毒株均可检测的快速生物检测系统,故大规模、快速检测细小病毒感染较困难。基因芯片技术为细小病毒的检测提供了一种快速、敏感、高通量、高效的临床诊断方法。因此有必要建立检测细小病毒的基因芯片,以便在细小病毒大规模流行时,最大限度地对所有可能成为传染源的细小病毒(包括插入变异的片段)进行检测。研究目的利用PCR技术制备B19病毒及HBoV等细小病毒特异性探针,在PCR循环过程中制备生物素标记的B19病毒及HBoV靶序列,为后续基因芯片的制备及检测奠定了基础。对B19病毒及HBoV的临床标本进行基因检测,对其临床特征进行分析,为B19病毒及HBoV感染的防治提供理论依据,并为细小病毒基因芯片的临床检测提供阳性样本。实验方法1.通过Genbank获得B19病毒、HBoV、CPV及PPV全基因序列及编码各蛋白的部分基因的基因序列号,针对上述基因分别进行BLAST及ClustalW分析,所得结果与相关文献对照,确定各细小病毒特异性基因区域。利用Primer Premier 5.0软件针对上述细小病毒基因组保守区域设计PCR特异性引物。2.利用PCR方法制备B19病毒、HBoV、CPV及PPV特异性探针,产物进行测序分析。3.以生物素标记的dNTP为底物,在PCR循环过程中制备生物素标记的B19病毒及HBoV靶序列。4.对2008年1月～2008年12月收集的252例以急性呼吸道感染住院患儿的血液标本和/或咽拭子、痰液标本进行了HBoV及B19病毒的检测,为细小病毒属基因芯片的特异性及临床检测提供阳性样本。5.分析B19病毒及HBoV呼吸道感染患儿的临床特点及流行病学特征。结果1.B19病毒、HBoV、CPV及PPV特异性探针及靶序列琼脂糖凝胶电泳检测时,均出现预期的明亮、单一条带。产物测序结果与标准株的变异小于1%。2.252份咽拭子及痰液标本中共检测到15份(6.0%)HBoV PCR阳性扩增产物,53.3%患儿合并有其它呼吸道病毒的感染,随机抽取1份HBoVNS1基因PCR阳性产物进行核苷酸序列测定,所测得的291bp核苷酸序列运用ClustalW软件与Genbank中的HBoV基因序列进行比较,结果显示:我们所获得的HBoV NS1测序的291bp与两个原型株HBoV Stockholml(stl,No.DQ00495)、HBoV Stockholm2(st2,No-DQ00496)和北京地区的2株流行株(No.DQ988934.2及No.DQ988933.1)的同源性大于99%。血液标本中未检出HBoV。3.在4例急性呼吸道感染患儿的咽拭子及痰液标本中B19病毒DNA检测阳性,其中有3例患儿伴有皮疹。结论1.针对简单、基因组较小的细小病毒,利用PCR技术制备细小病毒基因芯片的特异性探针及靶序列是一种快速、简单、低成本的实用方法。2.HBoV在15例以急性呼吸道感染住院患儿的咽拭子及痰液标本中检出,HBoV感染以下呼吸道感染为著,与其它呼吸道病毒有较高的合并感染,HBoV单独感染及其与其它呼吸道病毒的合并感染在临床特征方面无明显差别。血液标本中未检出HBoV。3.在急性呼吸道感染患儿的呼吸道标本中B19病毒DNA的检出率(1.6%)较低,但是这种使用非血液标本诊断急性B19病毒感染的方法值得尝试,尤其是对于儿童出疹性疾病的病原诊断。
参考文献：
[1]. 人微小病毒B19结构蛋白VP1/VP2区基因克隆及序列分析[D]. 江凌晓. 第一军医大学. 2000
[2]. 郑州地区孕妇感染B19病毒的调查和分离株全基因克隆及序列分析[D]. 靳静. 郑州大学. 2006
[3]. 人细小病毒B19 VP1表达蛋白的纯化及免疫活性的研究[D]. 李志宏. 第四军医大学. 2007
[4]. 细小病毒B19与人博卡病毒的基因检测及基因特异性探针的初步研究[D]. 张学红. 第四军医大学. 2009
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