务必论著栏目
巴戟天各炮制品及不同提取部位对小鼠的急性毒性比较初步探讨
魏颖婕¹ 史辑²
1大连市中医医院药剂科（大连116013）；2辽宁中医药大学药学院（沈阳110032）
国家自然基金青年基金，编号：81001635
[摘 要]：目的 为探讨巴戟天有无毒性、其毒性部位以及炮制对巴戟天毒性的影响，初步评价巴戟天的安全性，为其进一步药理研究提供参考，以期为巴戟天炮制减毒增效机理研究提供依据。方法 参照经典的急性毒性（LD50、MTD、MLD）试验方法
巴戟天主要的活性成分有蒽醌类、环烯醚萜类、多糖及低聚糖类以及有机酸类等化合物。近年研究发现，何首乌有小毒，其主要化学成分为蒽醌类，而巴戟天中亦含有大量的蒽醌类成分，但目前巴戟天是否有毒，其毒性成分尚不清楚，且研究较少。纵观历史，几乎所有的中药都要经过炮制加工过程，其目的是增强药效、降低或消除毒副作用，使其更适合临床用药要求。为探讨巴戟天有无毒性、其毒性部位以及炮制对巴戟天毒性的影响，本实验对巴戟天不同炮制品及不同提取部位进行小鼠急性毒性的比较研究，初步评价巴戟天的安全性，为其进一步药理研究提供参考，以期为巴戟天炮制减毒增效机理研究提供依据。
1 实验材料
1.1 实验动物
清洁级昆明种小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，合格证号SCXK (辽)2010-0001。于标准条件下饲养，适应环境1周后开始实验。
1.2 药物与试剂
巴戟天饮片：巴戟天生品、巴戟天木心、生拨巴戟肉、巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天、水煮巴戟天按照2010年版《中国药典》所载制备方法以及本课题组优化的工艺进行制备。（见表1-1）
表1-1 巴戟天生品与不同炮制品
品种 生品处理与炮制方法
巴戟天生品 取原药材，除去杂质及木心，洗净，晒干。
巴戟天木心 取净巴戟天药材，拨出木心，将木心剪成小段干燥。
生拨巴戟肉 取净巴戟天药材，拨出木心，切段干燥。
巴戟肉 取净巴戟天药材，置蒸器内蒸透，趁热除去木心，切段干燥。
盐巴戟天 取净巴戟天药材，用2％食盐水拌匀，闷润，待盐水被吸尽后蒸透，趁热除去木心，切段干燥。
制巴戟天 取甘草煎汤，去渣，取净巴戟天药材，加药材量6％甘草汁同置锅内文火煮至甘草汁被吸尽，趁热除去木心，切段干燥。
水煮巴戟天 取净巴戟天药材，加入与甘草汁等量的清水同置锅内文火煮至清水被吸尽，趁热除去木心，切段干燥。
巴戟天醇提液：分别称取巴戟天生品、巴戟天木心、生拨巴戟肉、巴戟肉、盐巴戟、制巴戟、水煮巴戟天，切成2-5mm左右的段，加入8倍量80%的乙醇溶液，回流提取3次，每次2 h，过滤，弃去药渣，收集滤液减压浓缩至无醇味，得浓缩液。浓缩液加适量蒸馏水成1.78 g/mL的巴戟天各炮制品提取液；另取一份巴戟天生品同法制得浓缩液，巴戟天生品浓缩液加适量蒸馏水混悬，依次用等体积乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次，回收溶剂，得乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位，各部位提取物分别加适量吐温-80和蒸馏水稀释至1.78 g/mL。
辅料甘草汁：将甘草饮片加12倍量水煎煮1 h，过滤，药渣再加12倍量水重复煎煮2次，3次所得煎煮液合并制成浓度为6.3 mg/mL的溶液。
巴戟天药材购自广西、甘草药材购自大连开发区阳光大药房，经辽宁中医药大学鉴定教研室翟延君教授鉴定，巴戟天为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的干燥根；甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎。加碘精制盐(大连盐业有限公司，批号：20110102)。
水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。
1.3 仪器
BS600-L电子分析天平（上海友声衡器有限公司）；腹腔注射器等。
2方法
2.1分组及给药
参照经典的急性毒性（LD50、MTD、MLD）试验方法[63]，进行巴戟天各炮制品及不同提取部位对小鼠急性毒性试验比较研究。经预试发现，各给药组无法测出半数致死量（LD50）和最大耐受量（MTD），故进行1日内最大给药量（MLD）试验。
将110只小鼠随机分为空白对照组和给药组(巴戟天生品组、巴戟天木心组、生拨巴戟肉组、巴戟肉组、盐巴戟天组、制巴戟天组、水煮巴戟天组、辅料甘草汁组、乙酸乙酯萃取组、正丁醇萃取组)，每组10只(雌雄各5只)。实验前禁食不禁水12 h，给药组1次灌胃给药15 mL/kg，3次/d；空白对照组给予等量的蒸馏水，11组小鼠连续给药7 d。
2.2 指标的测定
行为学观察：观察一般行为及饮食量和饮水量，隔日称1次体重。给药期间记录小鼠的体重变化和死亡情况。各组小鼠于第8天取血后断髓处死，立即解剖采集肝脏和肾脏组织，肉眼观察小鼠肝脏、肾脏等器官有无充血、出血、水肿或者其他改变，肝脏和肾脏组织样品用生理盐水冲净表面的血液和内容物后，装入福尔马林溶液中固定，HE 染色，显微镜20X倍镜下观察其病理切片结果。
3结果
3.1动物一般状况
各组小鼠在给药期间经 3d 内观察均未出现直接中毒死亡现象，但给药前后各组小鼠活动情况、饮食量、饮水量均有明显变化。空白对照组小鼠，皮发干爽顺滑，精神状态良好，反应、活动灵敏，饮食量、饮水量正常。巴戟天生品及各炮制品组小鼠于第 2d 均出现不同程度的腹泻，其中巴戟天生品组小鼠腹泻最为明显，体重增长缓慢，精神萎靡，饮食量、饮水量减少，喜蜷缩扎堆，有抱团发抖现象；第 4d 小鼠逐渐恢复正常；第 5-7d 小鼠活动正常，饮食量、饮水量正常；但第 4-7d 盐巴戟组、制巴戟天组、水煮巴戟天组和辅料甘草汁组有个别小鼠出现抽搐、呼吸困难、运动麻痹、发绀以及皮毛松散等一系列中毒症状，甚至死亡。
3.2实验动物数量分析
实验过程中因灌胃操作失误及所用药物损伤等原因引起盐巴戟组死亡1只，制巴戟天组死亡1只，水煮巴戟天组死亡2只，辅料甘草汁组死亡1只。共损失5只，最终进入实验结果分析为105只。小鼠死亡率见表1-2。
表1-2 巴戟天各炮制品及不同提取部位组小鼠死亡率比较
3.3实验动物体重变化分析
给药组小鼠隔日体重均与空白对照组进行组间 t 检验，急性毒性体重变化见图1-1。
图1-1 各组小鼠体重变化情况
3.4 病理组织学检查
3.4.1 肝脏病理学检查
从图中可知，空白对照组小鼠的肝脏组织形态、结构正常，肝细胞排列规整，肝细胞大小均匀，中央静脉大小正常规则，肝细胞形态结构清晰，核膜完整，核仁清晰可见。见图1-1-1。
巴戟天生品组小鼠的肝脏中央静脉周围及肝脏的边缘形成许多空泡、脂肪样改变，肝细胞排列层次排列紊乱，血窦可见散在少量的炎性细胞。见图1-1-2。
生拨巴戟肉组小鼠的肝脏组织结构有所改变，肝细胞排列层次较紊乱，中央静脉周围肝细胞形成空泡，血窦可见炎性细胞。见图1-1-3。
巴戟天木心组小鼠的肝脏组织结构有所改变，好于生拨巴戟肉组，中央静脉周围肝细胞排列层较好，肝细胞、血窦结构明显好转。可见炎性细胞减少。见图1-1-4。
巴戟肉组小鼠的肝脏组织形态、结构正常，肝细胞排列规整，肝细胞大小均匀，血窦间隙规则，中央静脉周围肝细胞形态结构清晰，细胞核膜完整，核仁清晰可见。见图1-1-5。
盐巴戟天组小鼠的肝脏组织形态、结构变化明显，脂肪样改变，中央静脉周围肝细胞形成空泡，肝细胞排列层次较紊乱，血窦可见大量的炎性细胞。见图1-1-6。
制巴戟天组小鼠的肝脏组织形态、结构正常，肝细胞排列规整、大小均匀，血窦间隙正常，肝细胞形态结构清晰，细胞核膜完整，核仁清晰可见。见图1-1-7。
水煮巴戟天组小鼠的肝脏组织形态、结构正常，肝细胞排列规则，肝细胞大小均匀，血窦间隙正常，中央静脉周围无异常改变，肝细胞形态结构清晰，细胞核膜完整，核仁清晰可见。见图1-1-8。
辅料甘草汁组小鼠的肝脏组织形态、结构有所改变，肝细胞排列层次较好，中央静脉周围及肝脏的边缘空泡明显好转，可见散在的炎性细胞。见图1-1-9。
乙酸乙酯萃取组小鼠的肝脏中央静脉周围及肝脏的边缘形成许多空泡，脂肪样改变，肝细胞排列层次排列紊乱，血窦可见散在少量的炎性细胞。见图1-1-10。
正丁醇萃取组小鼠的肝脏组织形态、结构有所好转，肝细胞排列层次不太规则，中央静脉周围及肝脏的边缘形成许多空泡基本消失，可见散在的炎性细胞。见图1-1-11。
3.4.2 肾脏病理学检查
从图中可知，空白对照组小鼠的肾小球结构、形态、大小正常，血管球、与肾小球囊腔的比例正常，近端小管与远端小管的管壁薄厚均匀、管腔大小正常，少量炎性细胞浸润。见图1-2-1。
巴戟天生品组小鼠的肾小球结构、形态大小近似于正常，血管球充盈，肾球囊腔增大有所改变，近端小管与远端小管的管壁薄、管腔稍大，可见少量浸润的炎性细胞。见图1-2-2。
生拨巴戟肉组小鼠的肾小球形态结构、大小均匀，肾球囊腔变小，比例失调，近端小管与远端小管的管壁薄厚、管腔变小，有炎性细胞浸润。见图1-2-3。
巴戟天木心组小鼠的肾小球结构、形态、大小不均匀，肾球囊腔变小，近端小管与远端小管的管壁变薄，管腔增大，可见浸润的炎性细胞。见图1-2-4。
巴戟肉组小鼠的肾小球结构、形态、大小正常，肾小球与肾小球囊腔的比例正常，近端小管与远端小管的管壁薄厚均匀、管腔大小正常，无炎性细胞浸润。见图1-2-5。
盐巴戟天组小鼠的肾小球结构、形态、大小有所改变，血管球萎缩，肾球囊腔变大，比例失常，近端小管与远端小管的管壁薄、管腔增大，有大量炎性细胞浸润。见图1-2-6。
制巴戟天组小鼠的肾小球结构、形态、大小正常，肾小球与肾小球囊腔的比例正常，近端小管与远端小管的管壁薄厚均匀、管腔大小正常，无炎性细胞浸润。见图1-2-7。
水煮巴戟天组小鼠的肾小球结构、形态、大小正常，肾小球与肾小球囊腔的比例基本正常，近端小管与远端小管的管壁薄厚均匀、管腔大小正常，有的部位可见到炎性细胞浸润。见图1-2-8。
辅料甘草汁组小鼠的肾小球结构、形态、大小接近正常，血管球较充盈，肾球囊腔有所增大，比例有所改变，近端小管与远端小管的管壁变薄、管腔稍有增大，有炎性细胞浸润。见图1-2-9。
乙酸乙酯萃取组小鼠的肾小球结构、形态、大小接近正常，血管球较充盈，肾球囊腔有所增大，比例有所改变，近端小管与远端小管的管壁变薄、管腔稍大，有炎性细胞浸润。见图1-2-10。
正丁醇萃取组小鼠的肾小球结构、形态、大小接近正常，血管球较充盈，肾球囊腔有所增大，比例有所改变，近端小管与远端小管的管壁变薄、管腔稍大，有炎性细胞浸润。见图1-2-11。
4讨论
本实验选用昆明小鼠雌雄各半，注意给药前 12 h 禁食不禁水，而给药后在观察期间应保障其有完全的膳食、充足的饮水及适宜的温湿度环境，以防止小鼠出现非中毒性死亡，影响实验结果。
本实验前期方案设计规定在给药前第 1 d，给药后第 7 d测定体重，但预实验中注意到如果在给药后的 7 d 内小鼠不出现死亡，药物引起的体重下降可能会恢复，在第 7 d 体重不可能与对照组有显著差别，故正式实验中增加体重测定的频率，在观察期间隔日称1次体重。
本实验利用电镜分别观察空白对照组和用药组肝脏、肾脏的差异，确定其对脏器的损伤部位和损伤情况，从而初步探讨了巴戟天对小鼠的急性毒性，评价实验动物中毒的表现及相应数据，为其进一步药理药效实验提供依据。
由病理切片结果显示，服药小鼠肝脏、肾脏出现不同程度损伤，故临床应用时必须根据毒性表现和数据严格控制药材使用量，或对药材进行炮制以达到减毒增效的目的。
该药虽然没有明显毒性，但服用后小鼠的体重在2 d内急剧下降，饮食量、饮水量也有所减少，结合病理切片研究结果，发现盐巴戟天组引起的此种现象更为明显，而巴戟肉组和制巴戟天组均未发现毒性表现。但至于其毒性发生机理还有待进一步研究。因此认为巴戟天还是有一定的副作用的，这与文献上巴戟天有小毒的记载相符合。
论文作者:魏颖婕¹,史辑²
论文发表刊物:《中国医学人文》2016年第1期
论文发表时间:2016/4/11
标签：巴戟天论文; 小鼠论文; 肾小球论文; 肝脏论文; 毒性论文; 见图论文; 形态论文; 《中国医学人文》2016年第1期论文;