黑龙江中医药大学附属第一医院 哈尔滨 150040
摘要：目的：探讨鸦胆子油乳及其联合顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞的生长抑制作用，并初步验证其作用机制。方法：采用MTT法测定鸦胆子油乳及其联合顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞的生长抑制作用，半定量RT-PCR、Western Blot分别检测人卵巢癌SKOV3细胞中Caspase-3、NF-κB/P65及Bcl-2的表达差异。结果：鸦胆子油乳及顺铂两者联合对SKOV3细胞的抑制作用显著高于两者单独应用。与对照组相比，鸦胆子油乳组、顺铂组、联合组NF-κB/p65、Bcl-2表达水平明显降低，Caspase-3表达量明显升高，各组与对照组差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论：鸦胆子油乳、顺铂及其两者联合均具有抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用，其抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖并诱导其凋亡可能通过激活Caspase-3诱导细胞凋亡并抑制NF-κB/P65 因子从而调控其下游凋亡相关因子Bcl-2的表达来实现的。
关键词：鸦胆子油乳；顺铂；卵巢癌；SKOV3
一、前言
中药鸦胆子油乳作为临床应用较广的一种抗肿瘤药物，在临床上多采用其作为逆转剂与常用抗癌药顺铂联合应用治疗肿瘤。本研究采用MTT法检测鸦胆子油乳、顺铂及其两者联合对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞的生殖抑制作用，并对其相关作用机制进行了初步探索。
二、材料与方法
1材料
人卵巢癌SKOV3细胞株，由哈尔滨医科大学附属第二医院提供。
2 试剂与仪器
鸦胆子油乳购自浙江九旭药业；顺铂购自山东齐鲁制药厂；兔抗人Bcl-2、Caspase-3、P65抗体均购自美国Santa Cruz公司；鼠抗人β-actin单克隆抗体购自贝西生物技术有限公司。
CO2恒温培养箱，透射电镜，酶标仪，PCR扩增仪，凝胶成像系统Bio-RAD。
3 实验方法
3.1 细胞培养
人卵巢癌SKOV3细胞株，培养于含10%小牛血清的培养液中，于37℃、5%的 CO2培养箱内传代培养。常规消化收集处于对数生长期细胞，并调整细胞浓度为（1~3）×107/mL。
3.2 MTT法检测细胞抑制率
药物分组处理如下：空白对照组、鸦胆子油乳组（鸦胆子油乳25μg/mL）、顺铂组（顺铂5μg/mL）、联合组（鸦胆子油乳25μg/mL加顺铂5μg/mL）。将稀释后的细胞接种于96孔板中，每孔加入200μL药物，对照组加入200μL培养液，分别培养24、48、72h后加入5mg/mL MTT 20μL及180μL培养液，置培养箱继续培养4h，弃上清，每孔加150μL DMSO，培养30min，摇床低速震荡10min，用酶标仪测定492 nm波长下各孔的OD值。细胞生长抑制率（%）=（1－实验组平均OD值/空白对照平均OD值）×100%，实验重复3次取平均值。
3.3 人卵巢癌细胞中相关基因的表达
（1）引物设计
Bcl-2 F：5’ – GGATCCAGGATAACGGAGGCTGG-3’
R：5’ – GGCATGTTGACTTCACTTG -3’
Caspase-3 F：5’ –ATGGAGAACAATAAAACCT -3’
R：5’ –CTAGTGATAAAAGTAGAGTTC -3’
NF-κB/p65 F：5’ –GGGCATGCGCTTCGGCTATA-3’
R：5’ –CAATCGCTTGGGGGTGAGGC-3’
β-actin F：5’ – ATCATGTTTGAGCCTTCAACA-3’
R：5’ – CATCTCTTGCTCGAAGTCC -3’
（2）RT-PCR
反转录反应体系：5×RT Buffer，2.0 μL；dNTP，1.0 μL；Oligo DT，0.5 μL；RNAse 抑制剂，0.5μL；总RNA 3.0 μL；无菌水，2.5 μL。混合液混匀后，37℃，5min。加入逆转录酶1.0μL，加水至终体积为20μL。6000rpm快速离心混匀，37℃，1h。95℃，10min，灭活逆转录酶。PCR反应体系：10×RT Buffer 4.0 μL；上、下游引物各1.0 μL；dNTPs 2.0μL；Taq聚合酶 4.0 μL；无菌水 37.0 μL。94℃ 变性1min，58℃ 退火1min，72℃延伸1 min，35个循环，最后一循环于72℃延伸7 min。以β-actin为内参，采用凝胶成像分析系统进行光密度扫描，计算待检测基因表达强度的相对系数。
3.3 人卵巢癌细胞中相关蛋白的表达
提取细胞裂解总蛋白，进行蛋白变性、电泳、转膜、免疫反应及曝光显影，并对胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
3.4 统计分析方法
采用SPSS19.0系统软件，对统计数据进行t检验与多组单因素方差分析。所有计量单位用（`x ± s）表示，视P＜0.05为具有统计学意义。
三、结果与分析
1 鸦胆子油乳、顺铂及其两者联合对SKOV3细胞的增殖抑制作用
相同作用时间下，鸦胆子油组、顺铂组及联合组对卵巢癌SKOV3的细胞抑制率逐渐增大，呈递增趋势；随着作用时间的延长，相同药物处理后的SKOV3 细胞抑制率逐渐增强（见图1）。
四、讨论
1 鸦胆子油乳及其联合顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞体外的生殖抑制作用
鸦胆子油乳对肿瘤细胞G0、G1、S、G2、M期均有抑制和杀伤作用，能明显抑制肿瘤细胞DNA复制、RNA转录及蛋白质的合成，干扰肽键的形成，降低肿瘤细胞分裂能力，抑制其增殖，促进细胞的凋亡[1]。据报道鸦胆子油乳对人膀胱癌细胞系BIU-87细胞有明显的杀伤作用，其主要是抑制DNA合成，阻止G0/G1期细胞向S期进展，提示鸦胆子油乳可能是一种S期特异性抗癌药物[2]。尹香菊等[3]研究表明鸦胆子油乳可以引起宫颈癌Hela细胞周期分布的改变，S和G2～M期细胞数量明显增加，G0～G1期细胞数量显著减少，表明鸦胆子油乳阻滞S期细胞进入G2～M期，降低肿瘤细胞分裂能力，抑制其增殖。贺大林等[4]报道鸦胆子油乳对体外培养的前列腺癌细胞生长和DNA 合成有明显的抑制作用。
2 Caspase-3、NF-κB/p65、Bcl-2与Bax与卵巢癌的相关性
Winter[5]等应用免疫组化法研究发现Caspase-3在前列腺癌中表达缺失，提示Caspase-3的高表达可能参与调解肿瘤细胞形成过程中逃避细胞凋亡，从而诱发肿瘤生恶性肿瘤中Caspase-3 的低表达可能抑制其细胞凋亡，导致恶性细胞不断增殖，最终导致癌症的发生。
Chen等[6]研究表明当NF-κB/p65过表达时，发生细胞凋亡抑制作用。Sasaki等[7]发现NF-κB/p65在胃癌中阳性表达与肿瘤大小、淋巴结侵犯等相关。也见报道发现NF-κB/p65在乳腺癌细胞和组织中表达水平升高。NF-κB/p65阳性表达与肿瘤生长、侵犯及转移相一致。Bcl-2与Bax均为NF-κB的下游因子，属于Bcl-2家族成员。正常组织内，Bcl-2/Bax蛋白的比例维持恒定，使细胞的分裂、增殖与死亡保持平衡；当Bcl-2/Bax蛋白的比例增大时，细胞凋亡受到抑制，导致细胞过度增殖，从而诱导肿瘤的发生[8]。
本研究以鸦胆子油乳、顺铂及其两者结合作用于人卵巢癌SKOV3细胞72h，检测各组Caspase-3、NF-κB/p65、Bcl-2与Bax的表达差异。结果表明鸦胆子油乳、顺铂及其两者联合抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖并诱导其凋亡可能通过激活Caspase-3诱导细胞凋亡并抑制NF-κB/P65 因子从而调控其下游凋亡相关因子Bcl-2、Bax的表达来实现的。
参考文献：
[1]肖培根.新编中药志[M].化学工业出版社.2002，2，506.
[2]刘悦，王禾，符庆吉，等.鸦胆子油乳对人膀胱癌细胞系的作用[J].临床泌尿外科杂志.2001，16（2）：86-88.
[3]尹香菊，栾和芝，安春丽，等.鸦胆子油乳对宫颈癌Hela细胞的抑制作用及其作用机制[J].中国肿瘤生物治疗杂志.2008，15（4）：393-395.
[4]贺大林，南勋义，刘文善.10%鸦胆子油静脉乳剂对前列腺癌细胞的影响[J].临床泌尿外科杂志.1994，9：60-62.
[5]Winter RN，Kramer A，Borkowaki A，et al.Loss of caspase-1 and caspase-3 expression inhuman prostate cancer[J].Cancer Res.2001，61（3）：1227-1232.
[6]Chen X，Kandasamy K，Srivastava RK.Differential roles of Rel A（p65）and c-Rel subunits of nuclear factor kappa B tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand signaling[J].Cancer Res.2003，63：1059-1066.
[7]Sasaki N，MorisakiT，Hashizume K，et al.P65 is constitutively activated in human gastric carcinoma tissue[J].Clin Cancer Res.2000，7：4136/ 4142.
[8]于冰，孙治君.凋亡相关基因bcl-2、bax、bad与乳腺癌[J].中国普外基础与临床杂志.2007，14（6）：739-742.
论文作者:赵楠,韩凤娟,杨雪,王桂媛
论文发表刊物:《健康世界》2015年15期
论文发表时间:2016/5/30
标签：鸦胆子论文; 细胞论文; 抑制论文; 作用论文; 卵巢癌论文; 凋亡论文; 肿瘤论文; 《健康世界》2015年15期论文;