周春权 曾雪爱
（福建省中医药研究院 福建 福州 350003）
【摘要】 目的：观察藤茶复方在体内外对肝癌Hepa1-6的影响作用。方法：采用皮下接种肝癌HEPA1-6实体瘤模型观察藤茶复方体内的抑瘤作用；应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法研究藤茶复方对肝癌HEPA1-6细胞体外增殖的影响。结果：藤茶复方对肝癌HEPA1-6有较强的体外增殖抑制作用，且剂量依赖性明显，抑制率随着药物浓度增大而增大，72h半数抑制浓度IC50为49.34μg/ml；藤茶复方能抑制肝癌HEPA1-6实体瘤小鼠的肿瘤生长，高、中剂量组抑制率分别为54.3%和48.8%。与模型对照组相比均有显著差异（P<0.01）。结论：藤茶复方在体外对肝癌HEPA1-6细胞有明显的抑制作用；在体内对肝癌HEPA1-6肿瘤的生长有明显的抑制作用。
【关键词】 藤茶复方；抗肿瘤；HEPA1-6；四甲基偶氮唑蓝
【中图分类号】R73-3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）26-0195-02
藤茶复方主要是由藤茶提取物和肿节风提取物组成，藤茶提取物是从葡萄科蛇葡萄属的显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz)W.T.Wang)中提取得到，本实验室经超声波提取后其蛇葡萄素含量达80.2%[1]，肿节风提取物是从金粟兰科植物草珊瑚（Sarcandra glabra(Thunb．)Nakai）的干燥全株提取得到，这两种药材均广泛分布于我国长江流域以南的省区，我省有丰富的植物资源[2]。为了更好的利用和开发我省的药物资源，本研究选用藤茶和肿节风的提取物组成复方，在前期的抗肿瘤研究基础上，我们又进行了藤茶复方在体内外对肝癌HEPA1-6抗肿瘤作用的实验研究。现报道如下：
1.材料与方法
1.1 试验药物
藤茶复方：由本实验室分别从藤茶和肿节风药材中超声提取得到提取物，藤茶提取物用高效液相色谱法测定其蛇葡萄素含量达80.2%，肿节风提取物用高效液相色谱法测定其迷迭香酸含量为0.0754%[3]，然后按一定比例混合组成。
1.2 动物和菌株
C57BL/6j小鼠，雄性 20～22g，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证编号：Scxk（泸）2012-0002。
瘤株：肝癌细胞Hepa1-6，购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。用含10%胎牛血清的DMEM（高糖）传代培养。
1.3 试剂
培养基：DMEM（高糖）、小牛血清（FBS）、 胰酶（含0.02%EDTA）、双抗（青霉素-链霉素）、96孔细胞培养板、细胞培养瓶均为美国Corning公司；磷酸缓冲溶液（PBS），杭州四季青公司；二甲基亚枫（DMSO），Sigma产泰京公司分装；噻唑蓝（MTT），上海生工。
1.4 仪器
HERACELL 150i型CO2培养箱（美国Thermo Scientific公司）；BCW-1000型生物净化工作台，BW-CJ-1K型空气净化器，（苏州华宏净化技术有限公司）；Multiskan MK3型酶标仪（芬兰Labsystems Dragon公司）；TS100型倒置光学显微镜（日本Nikon公司）； TD5Z型离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）； HHS214型恒温水浴器（上海医疗器械五厂）。WH—Z微型旋涡振荡器（上海泸西分析仪器厂有限公司）；BP211D型电子天平（美国Sartorius公司）；压力蒸汽灭菌器（上海医用核子仪器厂）。
1.5 方法
1.5.1 MTT法体外抗肿瘤实验
取处于对数生长期的肿瘤细胞，用胰酶消化，倒置显微镜下计数，用培养基稀释成细胞悬液,每孔加约1×104个细胞于96孔板。置37℃、5% CO2的培养箱中培养24h。然后加不同剂量的藤茶复方，37℃、5% CO2的培养箱中培养72h。最后每孔加入含 MTT的不完全培养基，37℃、5% CO2的培养箱中孵育4h,小心弃上清, 加入150ulDMSO, 充分振摇使甲瓒结晶溶解，用酶标仪于492nm波长处测定各孔光吸收值（OD），MTT法中结晶物的形成量与活细胞数和功能状态两者之间成正关系，因此用OD值大小来表示该活细胞数量的多少；并以下式计算细胞生长抑制率：
细胞生长抑制率%=（1-OD实验/OD对照）×100%
改良寇氏法计算IC50
计算公式为:Log10(IC50)=Xm-i(P-0.5)+i(1-Pm-Pn)/4
其中,Xm=Log10(最大剂量)，i=Log10（最大剂量/相临剂量），P=阳性抑制率之和，Pm=最大阳性抑制率，Pn=最小阳性抑制率。
1.5.2 体内抗肿瘤实验
1.5.2.1 藤茶复方对小鼠肝癌Hepa1-6实体瘤的影响
小鼠接种肿瘤后，随机分成4组，即模型对照组(生理盐水组)，藤茶复方低、藤茶复方中、藤茶复方高剂量组，剂量分别为0.075g/kg、0.15g/kg、0.30g/kg。各组灌胃0.2ml/10g体重，模型组给予等体积生理盐水，连续给药40天。末次给药24小时后，小鼠处死，剥离肿瘤，取脾和胸腺，分别称重，按以下公式分别计算抑瘤率、脾指数和胸腺指数
抑瘤率/%=（模型组平均瘤重—给药组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%
胸腺（脾）重量系数（mg/10g）= 胸腺（脾）重量/小鼠体重×10
2. 结果
2.1 MTT法体外抗肿瘤实验
2.1.1藤茶复方对肝癌Hepa1-6的增殖抑制作用
藤茶复方对肝癌Hepa1-6的生长有抑制作用，且剂量依耐性明显，抑制率随着药物浓度增大而增大（表1）。根据改良寇式法公式计算得，藤茶复方对肝癌Hepa1-6的72h半数抑制浓度IC50为49.34μg/ml。
表1藤茶复方对肝癌Hepa1-6增殖的抑制作用(x-±s,n=3)
2.2 体内抗肿瘤实验
2.2.1藤茶复方对肝癌Hepa1-6小鼠有抑制作用，且呈剂量依赖性，其中藤茶复方高、中剂量组对Hepa1-6肝癌的抑制率分别为54.3%和48.8%，与模型对照组相比有显著差异（P<0.01），藤茶复方低剂量组对Hepa1-6肝癌的抑制率为24.2%，但差异不显著，脾指数和胸腺指数与模型对照组比较无明显差异。结果见表2
表2 藤茶复方对肝癌Hepa1-6小鼠抑制作用的影响
(x-±s, n=8)
与模型对照组比较 ** P<0.01
3.讨论
近年来，恶性肿瘤的发病率呈现上升趋势。据有关数据显示，我国居民恶性肿瘤死亡率比70年代中期增加了83.1%。随着社会经济发展和人民生活水平提高，我国的疾病谱和死亡谱发生显著变化，慢性非传染性疾病已经成为导致死亡的主要原因。其中，恶性肿瘤是目前全世界的主要死亡原因之一，已经成为严重危害人类生命健康、制约社会经济发展的一大类疾病。因此,提高恶性肿瘤的治疗和预防水平,控制肿瘤向恶性发展尤为重要。
由于中药具有多靶点、多途径、抗肿瘤谱广、毒副作用轻等优势。中药在控制肿瘤、肿瘤放化疗减毒增效、改善患者生存质量，等方面都发挥着不可忽视的作用，因此对天然药物抗肿瘤作用的研究越来越受到研究人员的重视。本研究用藤茶复方仅观察了在体内、体外对肝癌Hepa1-6的影响作用，而其抗肿瘤的机制如何，是通过哪种途径抑制肿瘤的生长？这是我们今后进一步深入研究的方向。
【参考文献】
[1] 周春权，倪峰，林静瑜等.藤茶提取物的超声提取及含量测定. 中华中医药学刊,2011，29(10)：2312-2314.
[2] 中国科学院植物研究所．中国高等植物图谱补编(第二册)．北京：科学出版社，1983，242.
[3] 周春权，郭丹，倪峰.超声他和回流提取草珊瑚茎中迷迭香酸的比较.福建中医药大学学报，2012,22（1）:33-35.
基金项目:福建省卫生教育联合攻关课题(WKJ-FJ-06)，省属公益类科研院所基本科研专项（2013fjzyyk-3）
论文作者:周春权,曾雪爱
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第26期供稿
论文发表时间:2015/10/29
标签：复方论文; 肝癌论文; 抑制论文; 剂量论文; 作用论文; 提取物论文; 小鼠论文; 《医药前沿》2015年第26期供稿论文;