张建业[1]2002年在《银杏LEAFY同源基因的分离克隆及其相关基础研究》文中指出银杏(Ginkgo Biloba L．)，又名白果，着名的孑遗植物，被誉为活化石，是珍贵的食用、药用、材用、观赏用树种。银杏又是严格的雌雄异株，还没有发现雌雄同株现象，其雌雄株在染色体核型，过氧化物同工酶谱等都有较大差异。雌雄花形态也截然不同，有的专家还认为银杏有性染色体。银杏果实营养丰富，味道鲜美，遗憾的是银杏的童期很长，被称为公孙树，实生树的开花需要十几年，严重制约着银杏品种改良和经济利用。为缩短银杏童期，果树工作者进行了大量的研究，从栽培方式，传统育种方法进行了探索，但成效不大。 近年来模式植物拟南芥的开花机理研究取得了很大进展。至少有80个以上与拟南芥开花有关的基因和位点被识别出来。其中LEAFY(LFY)是一个花分生组织特征基因，控制着拟南芥营养分生组织向花分生组织的转变，也影响拟南芥的开花时间。LFY的过量表达可以促使拟南芥、水稻、欧洲山杨、柑桔提早开花。虽然银杏是较古老的裸子植物，但由于LEAFY基因的保守性，银杏LEAFY同源基因也可能调控着银杏开花的时间。同时，银杏的遗传转化研究极少，也需要加以研究。为此，本实验从银杏LEAFY同源基因的克隆入手，分析其雌雄株LFY基因结构差异，构建LFY基因的植物正义反义表达载体，建立矮牵牛遗传转化体系，以研究银杏LFY同源基因的功能，同时建立了银杏组织培养体系，为银杏的遗传转化和提早开花结果奠定基础。 1．常规的CTAB法提取的银杏基因组DNA呈黄色，不易被内切酶所消化，也不能作为PCR模板。我们将CTAB法稍做改良：研磨样品时加入适量的不溶性PVP，提高β-巯基乙醇在提取液中的比例，从而提取到了无色、可酶解、可作PCR模板的高质量的银杏基因组DNA。 2．首次用银杏栽培品种大佛手(Ginkgo biloba L．cv．Dafushou)雄株基因组DNA为模板，通过PCR扩增，获得两个银杏雄株LEAFY同源基因GinLFY和GinNdly基因。 结果分析表明，GinLFY DNA序列全长为3450个核苷酸。经同源性分析和DNA序列结构分析，推测该序列为银杏雄株LEAFY全长基因。该基因与文献报道的银杏雌株LEAFY基因相比，核苷酸序列同源性高达99％，蛋白质序列同源 浙江大学博士学位论文 摘要 性达99％，缺少了3个核昔酸，突变均在植物LEAF’Y基因的非保守区内。从内 含子边界特征和多种植物LEAFY基因同源性比较，确定了该基因的内含子位置。 该基因含 2个内含子，3个外显子。GinNap全长基因含 1493个核昔酸，也含有 2个内含子，3个外显子。与文献报道的银杏雌株 GinNap基因相比，碱基数少 了叁个，对应地少了一个丙氨酸，核昔酸同源性为99．7％，氨基酸同源性为99．3％。 与拟南芥LEAF’Y基因相比较，银杏GinLFY和G毗基因没有做为转录激 活区域的位于氨基酸序列中间的酸性区和位于N端的富含脯氨酸区，但这两个 区域均位于LEAFY基因的非保守区。银杏雄株GinLFY和GinNdly之间氨基酸序 列同源性为 60．2％，这小于被子植物拟南芥 LFY与金鱼草 FLO之间的同源性（7 ％）。另外，与拟南芥L厂Y同源性分别为50刀％和扔＊％：与辐射松＊＊FL L同源 性分别为80．3％和58．二％；与辐射松NEEDLY同源性分别为58二％和75石％。 3．利用p8I121和pCAMBIA1301两个植物表达双元载体质粒构建了心”以沙 基因的反义与正义植物表达载体PZJI 17、PZJlls、PZJllg、PZJ120等四个质粒。 pCAMBIA1301所带的报告基因GUS含内含子，使得GUS只能在真核细胞中起显 色反应。但它的多克隆位点旁侧没有启动子与终止子。构建 Gll7Ndl基因的植 物表达载体前，先给PCAMBIA1301加上了启动子和终止子，形成PCAMBIA1301 一 355—P帖质粒。然后利用限制性内切酶双酶切，构建成 PZJI 19和 PZJ120 质粒。PBI 121表达载体构建方法是酶切去除GUS基因，利用T4连接酶代之以 GinNdl基因，构建成PZJll7和PZJI 18。通过PCR检测和酶切验证，证明质粒 构建正确，并将之转入根癌农杆菌EHA105儿BA4404、GV3101和发根农杆菌15834 中。 4．利用叶片建立了矮牵牛遗传转化体系。培养基MS＋BAZ．0＋NAAO．4适于矮 牵牛叶片诱导愈伤组织，再生不定芽，每块愈伤组织上的不定芽数可达12个以 上，并且源源不断地发出不定芽来。经叶盘的农杆菌敏感性、抗生素耐受性实验， 建立了以叶盘为受体的矮牵牛遗传转化体系。利用含GinNdP基因的正义植物 表达载体质粒PZJI 17的根癌农杆菌EHA105转化矮牵牛，获得了一些抗卡那霉 素的抗性芽，经PCR检测证明，CinNdy基因己经整合到矮牵牛的基因组中。 5．银杏的组织培养银杏的子叶，胚轴，胚根，胚乳，茎段，叶柄，叶片， 根都可以诱导出愈伤?
郭长禄[2]2004年在《银杏再生体系建立和LEAFY基因表达、转化的研究》文中进行了进一步梳理银杏(Ginkgo biloba)又名白果、公孙树，新生代第四纪冰川期的孑遗植物，为我国独存的珍稀名贵树种。我国是银杏的故乡，银杏与大熊猫一样，已被世界各国公认为中国代表。银杏被称为“活化石”，植物学家常把银杏与“恐龙”相提并论，在生物的起源、进化等研究方面提供了理想的试材和有力证据，具有重要的科学研究价值。银杏的经济价值很高，随着银杏产业的发展，银杏在食品、保健、医药、木材、绿化等领域得到广泛的开发利用，然而银杏童期长，实生苗20-30 a才能开花结果，常规育种周期较长，严重影响了银杏的品种改良。目前LEAFY基因被认为是诱导植物开花的枢纽基因，其过量表达可以促进植物提早开花。研究银杏LEAFY同源基因的时空表达模式有助于我们初步认识LEAFY同源基因的功能。通过组织培养、遗传转化等方法从分子水平对其进行改良，可以开辟银杏育种新途径。 我们通过实验获得了以下研究成果： 1．裸子植物银杏组织培养分化特别困难，分别以银杏胚乳、胚、胚轴、子叶以及不同采收期的未成熟胚为外植体，研究了在不同培养条件下愈伤组织和胚状体的发生条件，建立了MK新型培养基配方，结果显示，只有未成熟胚及其胚轴、子叶能够产生胚状体。大于3mm的未成熟胚，在MK+NAA 1 mg/L+BA 1 mg／L培养基上胚状体诱导率最高，达到53.6％，最多的一块愈伤组织形成多达38个胚状体；胚轴最佳诱导条件为：MK+NAA 1 mg／L+BA 1 mg/L，诱导率为45.3％；子叶最佳诱导条件为：MK+NAA 1.5 mg／L+BA 1 mg／L，诱导率为12.9％。暗培养不利于胚状体的发生。不同采收期的未成熟胚愈伤组织和胚状体的诱导率不同。 2．在国内外首次把胚状体培育成苗，建立了银杏组织培养再生体系。利用银杏未成熟胚诱导的胚状体在无菌的条件下，接种在添加不同浓度的活性炭、蔗糖、椰汁的MK培养基上，胚状体可以发育成苗。其中在MK培养基上添加3 g／L活性炭，有10％胚状体生长成苗。在MK培养基上添加40 g／L蔗糖，有19.2％胚状体生长成苗。在MK培养基上添加10%椰汁对胚状体生长发育的促进效果最好，有34.5%的胚状体生长成苗。 3.通过对传统CTAB提取RNA的方法进行适当改良，建立了银杏等木本裸子植物RNA的提取方法。提高提取缓冲液中的p一琉基乙醇的含量，有效地去除了多酚类物质对银杏RNA提取的影响;在研磨过程中，适当加入聚乙烯毗咯烷酮 (PVP)，防止了酚类物质被氧化，从而获得了高质量的银杏RNA样品。经紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳分析，RNA完整性好、不降解、杂质少、纯度高，同时也适用于反转录、、RT一PCR和Northern杂交等研究，为银杏的分子生物学研究奠定了基础。 4.LEA那基因是调控植物开花的关键基因，裸子植物银杏童期长，也许是由LEAFy同源基因所决定的，我们利用同位素标记，制备Gin妙和Gin从梅两个特异探针，进行Northern分子杂交，对银杏还没有开花功能的幼树、已开过花的银杏成年雄株和雌株的根、茎、叶以及幼果、不同时期的雌花芽、雄花芽进行了LEA那同源基因的表达分析，发现银杏乙州Fy同源基因Gin势在各部位都有表达，属组成型表达，而另一个同源基因GinNdlJ笋只在银杏雌花芽、雄花芽和叶片中表达，属特异性表达。由此可知，银杏双拷贝乙别那同源基因中的GinN’lly基因与银杏开花关系更为密切，同时也与叶片的发育有关，这也许是银杏长期进化的结果。 5.进行了胚愈伤组织遗传转化的研究。通过卡那霉素筛选、PCR鉴定、Southern杂交分析，证明乙EAFy基因己成功的整合到银杏胚愈伤组织基因组中，进一步证明裸子植物银杏可以利用根癌农杆菌介导法进行遗传转化。研究了影响根癌农杆菌转化效率的因素。其中侵染的根癌农杆菌菌株、菌液浓度、共培养时间、抽真空时间以及添加乙酞丁香酮等，对愈伤组织转化效率都有影响。根癌农杆菌菌株EHA 1 05对愈伤组织的转化效率高于GV3lOI;根癌农杆菌菌株EHAIOS培养到对数生长期后，稀释10倍使用，共培养3天，可以获得较好的转化效果，转化率可达38%;加入300 p mol乙酞丁香酮，转化率可以升高到48%;而且浸泡5 min后，抽真空10min，再浸泡5 min比单纯浸泡20 min的处理转化效率局。
孙颖[3]2008年在《油桐LFY同源基因的克隆及花芽分化生理基础研究》文中研究表明油桐是我国特有经济林木,至少有千年以上的栽培历史,直到1880年后,才陆续传到国外。油桐独特的生物学特性使其具有成为经济林模式植物的潜力。本文以具有独特早花性状的对年桐为研究对象,分离克隆了油桐的LFY同源基因序列,为探索油桐成花阶段关键基因的表达和调控机制找到了突破口。同时,研究了油桐花芽初次分化时期的营养基础和解剖特征,为建立油桐成花关键时期的生理生化基础提供了依据。本研究,不仅为油桐的成花机理的研究提供了基础,也为其他经济林木的相关方面研究提供借鉴和新的思路。本文的主要研究结果如下。1、从油桐叶片的基因组中分离、克隆到LFY的同源基因Tung LFY的部分序列,将测序结果用生物学软件Vector NTI进行分析拼接后,得到一条长1037bp的序列。将其提交到NCBI网站上进行Blast分析后,发现与其他植物的LFY同源基因相似性较高,达到了88%以上,由此确认得到的片断为油桐LFY同源基因的部分片断。在此片断中有1个长638bp的内含子,两边有两个分别长273bp和126bp的外显子,共编码133个氨基酸,拼接位点与其他植物的LFY同源基因一致。2、以基因组的Tung LFY和其他植物的LFY同源基因为模板,设计引物。利用RT-PCR及RACE技术,结合TD-PCR技术扩增到一段大小为643bp序列片断,共编码146个氨基酸,含有TAA终止密码子和Poly A尾巴。3、对花芽初次分化各个时期的可溶性糖、可溶性淀粉、可溶性蛋白质叁个生理指标测定,发现在花芽分化初期可溶性总糖的含量较之后来的花序分化期有个明显的下降,随后即持续增长,到达雄蕊和雌蕊分化期时,含量达到最高。在花芽分化各个时期的叶片的淀粉含量变化的趋势基本一致,即随着花芽分化的推进,叶片中淀粉含量均先升高后降低,并在花瓣分化期达到最大值。蛋白质含量在整个生长过程中呈先上升后下降的趋势,尤其是在花芽分化初期到花萼分化期间迅速升高,并在花萼分化期达到最大值。4、采用石蜡切片法,研究了油桐花芽初次分化时期各阶段的解剖特征,并从解剖特征上明确了湖南地区对年桐花芽分化的具体时间。
王冬梅[4]2007年在《毛白杨花芽分化规律与开花调控的分子基础研究》文中认为毛白杨(Populus tomentosa Carr.)是我国特有的白杨派树种,是我国北方主要的行道树种和用材树种,具有速生、优质等特点并对美化环境,保持水土有重要的作用。但是,一方面,毛白杨的育种周期较长,有5-10年的童期;另一方面,在开花和结实季节,雄株会飞散花粉,雌株会产生白色的飞絮,这种情况不但污染了城市环境,而且给毛白杨的育种和推广工作带来了困难。因此,本文旨在通过分离毛白杨花发育关键的基因,并构建正反义表达载体和RNAi载体定向调控毛白杨的开花发育,为缩短育种周期、培育出高度不育的环保型毛白杨品种奠定基础。本文以毛白杨雄性无性系LM50和雌性无性系5082为研究对象,通过对其雌雄花芽形态发育规律的观察,建立了雌雄花芽的cDNA文库,研究了离体叶片再生条件、抗生素筛选条件以及根癌农杆菌介导的毛白杨遗传转化体系的优化,建立了高效的离体再生系统和遗传转化体系,并将从毛白杨中克隆的与开花相关的关键基因构建表达载体,分别转入模式植物烟草和毛白杨雌雄无性系中,对转基因烟草进行了分子检测及田间试验。主要的研究结果如下:1.定期采集两年内的毛白杨雌雄株花芽,石蜡连续切片,显微观察雌雄花芽器官分化,揭示了毛白杨雌雄花芽的分化规律和雄性不育的可能原因。2.以两年内采集的毛白杨雌雄花芽为材料,运用SMART[TM]cDNA文库构建的方法,分别构建了雌雄花芽的的cDNA文库。经测定,雌、雄毛白杨花芽文库的初始滴度分别为8.0×105和7.2×105 pfu/mL,扩增后滴度分别为2.60×108 pfu/mL、2.56×108 pfu/mL,重组率为90%,插入片段长度为0.4-2.5 kb,这些数据表明文库质量达到质控要求。3.根据毛果杨的AP3同源基因序列的保守区设计PCR引物,扩增出毛白杨开花关键基因PtAP3,序列分析表明,该基因全长1813 bp(包括引入的酶切位点),包括7个外显子和6个内含子,编码238个氨基酸。Southern杂交分析发现,该基因在毛白杨雄株中为双拷贝,而在雌株中则为单拷贝。4.建立了烟草和毛白杨雌雄无性系的再生和转化体系。比较了毛白杨无性系的叶片和茎段在不同时期、不同发育状态,不同部位的分化能力。确定了毛白杨叶片外植体不定芽诱导卡那霉素临界耐受浓度为20 mg/L,试管苗不定根耐受浓度为25mg/L。同时比较了头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Cb)对烟草和毛白杨不定芽和不定根诱导的影响及对农杆菌菌株的抑菌效果,结果表明,Cef对LBA4404和GV3101的抑菌效果比Cb好,适宜浓度为200-300 mg/L,生根时为200-600 mg/L。筛选出最佳烟草叶片分化不定芽的培养基为MS+6-BAl.0 mg/L+NAA0.1 mg/L;最佳毛白杨叶片分化不定芽的培养基为MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.1 mg/L,不定芽生根培养基为1/2MS+NAA0.3 mg/L。5.将毛白杨PtAP3基因和PtLFY基因融合CaMV35S启动子的pBll21质粒构建植物正反义表达载体和反向重复的RNAi载体,转入烟草,对筛选出的抗性植株进行PCR及PCR-Southem检测。结果表明,成功获得了转入PtAP3,PtLFY-IR和Ptap3基因的烟草植株。转基因烟草扩繁后移栽,在相同的条件下,转PtAP3基因的烟草与对照、反向重复PtLFY和反义Ptap3相比,具有明显的高生长优势,并且开花比对照提前一个月以上。反义Ptap3烟草和反向重复的PtLFY烟草开花均被抑制,未成花。收集对照及To代转PtAP3基因烟草的种子,播种,T1代,T2代表现稳定,均比对照生长旺盛,提前开花,说明转基因效果能够稳定遗传到下一个世代。6.选取毛白杨同龄同代的生根组培苗叶片作外植体,叶盘转化的最佳取材位置是自茎尖展叶始第1-3片叶;利用建立的遗传转化体系转化毛白杨雄性无性系LM50和雌性无性系5082,通过抗Kan筛选出转有毛白杨(LM50)正反义PtAP3和PtLFY-IR等基因的转基因植株,并进行了初步的PCR检测,结果表明已整合到毛白杨LM50的基因组中。目前移栽和进一步的检测工作正在进行。
丁焱[5]2009年在《DFL基因在甘菊中的转化与表达研究》文中研究指明菊花(Chrysanthemum×morifolium Ramat.)是我国十大传统名花和世界四大鲜切花之一。菊花大多数为秋季开花,但是市场上迫切需要周年开花或节日开花的菊花品种,为调整花期所进行的遮光和补光处理将耗费大量能源,不利于节能环保,也给企业和花农造成了经济负担。研究菊花成花机理,获得提前开花的、有自主知识产权的品种将对生产有重大的意义。LEAFY(LFY)基因在植物成花过程中意义重大,它不仅决定着花由营养生长向生殖生长的转变,它还接连GA成花途径和长日途径的信号继而诱导花分生组织的转变,同时还是活化花器官基因的关键基因。LFY基因超量表达可以使植物的花期提前。DFL是从甘菊中分离的LFY同源基因,与金鱼草和拟南芥LFY基因氨基酸序列相似性分别为70%和63%,它的初步研究暗示DFL基因在甘菊成花的发育中起着重要作用。分析甘菊LFY同源基因表达模式,不仅是对目前LFY基因资源的补充,进而对进行转基因育种,达到能人为控制花期的目的,具有重要的理论和实践意义。甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium(Fisch.ex Trautv.)Makino)是菊科菊属甘菊系多年生草本。它是菊花起源的重要亲本之一,遗传背景简单,开花期与菊花一致,属于典型的短日照植物,是菊属植物中分子生物学研究的理想模式植物,也有一定园林应用价值。如对其进行培养、观察、分析研究,可以对绝大部分为多倍体、非整倍体、遗传背景复杂的菊花的研究有很大的借鉴作用。目前已经有不少菊花栽培和遗传转化的研究,但还没有甘菊栽培和应用的相关报道。建立栽培体系,能为再生和转化培养提供有效材料,也为今后菊科分子机理研究和基因工程育种研究提供坚实的基础。本研究进行了甘菊的引种栽培和转基因研究,获得了花期提前的转化植株。主要研究结果如下:1.研究了甘菊种子不同储藏时间和不同条件下的萌发率,认为采收后当即播种和次年春季播种萌发率较高,不应该储存超过17个月。通过对甘菊生长环境因子和生长情况的研究,获得了盆栽和光照培养室栽培甘菊的合适方法,甘菊能够正常进行营养和生殖生长并获得后代。2.研究了甘菊对卡那霉素的敏感性,确定了试管苗不定芽诱导卡那霉素临界耐受浓度为5mg/L,试管苗不定根耐受浓度为20mg/L。3.本实验选择羧苄青霉素(Carb)作为遗传转化中的脱菌剂,合适的浓度为300-500mg/L。将由35S启动DFL基因的正反义表达载体(载体中同时包含有由另外两个35S启动的潮霉素筛选基因和GUS组织化学染色基因),使用农杆菌(菌株为EHA105)转化甘菊。取组培苗的叶片进行2d的预培养,OD_(600)为0.4—0.6的农杆菌侵染叶盘5min,转入共培养培养基暗培养2d,转至延迟培养基上,光培养2d,再将叶片转接至5mg/L潮霉素或卡那霉素、并添加500mg/L羧苄青霉素筛选培养基上,25℃光培养。以后每20d继代,期间观察其分化生长情况。待抗性芽长出,在添加3mg/L潮霉素或20mg/L卡那霉素的生根培养基中培养。4.对筛选出的抗性甘菊植株进行GUS、PCR、PCR-Southern检测,结果表明,成功获得6个转入DFL基因的甘菊植株株系。转基因植株扩繁后移栽培养,观察生长发育情况,同样栽培条件下,转基因植株与对照相比有明显高生长优势,并且开花提前可多达17d。收集对照和T_0代转DFL基因的甘菊种子在培养基中栽培,转基因T_1代种子通过抗生素筛选和PCR筛选,初步说明转基因效果能够稳定遗传到下一代。
李创[6]2010年在《荷花LFY、AP1基因片段的克隆与分析》文中指出本研究以碗莲品种‘红霞满天’为材料,采用RT-PCR方法,克隆出LFY基因和AP1基因的片段。为今后获得LFY基因和AP1基因的全长以及了解荷花的成花分子机理和花期调控奠定了必要的基础。研究结果如下:(1)建立了较为完善的荷花样品总RNA提取和纯化方法。通过比较改良Trizol、CTAB-LiCl法、改良CTAB-LiCl法叁种RNA提取方法,总结出适合荷花样品RNA提取的方法—改良CTAB法。并通过此方法获得了较为纯净的、完整的总RNA,可以直接用于后续的RT-PCR反应。(2)采用RT-PCR技术克隆了荷花LFY基因cDNA片段。克隆得到的LFY基因片段长为431bp,编码143个氨基酸。序列分析结果表明,该片段推导的氨基酸序列与红叶藜、苹果、葡萄、烟草、矮牵牛、甘菊等植物的氨基酸序列一致性分别为95﹪、95﹪、94﹪、94﹪、94﹪、93﹪。系统进化树分析表明,荷花与苹果和枇杷亲缘关系最近。(3)采用RT-PCR技术克隆了荷花2个AP1基因cDNA片段,分别命名为NeAP1-1和NeAP1-2。NeAP1-1和NeAP1-2基因片段核苷酸长度均为216bp,编码72个氨基酸。运用DNAMAN软件,对NeAP1-1和NeAP1-2的核苷酸和氨基酸序列进行分析,其同源性分别为89.35﹪和88.89﹪。序列分析结果表明,NeAP1-1和NeAP1-2的氨基酸序列与其它植物的AP1氨基酸序列同源性均在62﹪以上。系统进化树分析表明,荷花与白屈菜的亲缘关系最近。(4)对NeAP1-1和NeAP1-2的氨基酸序列进行保守结构域预测,NeAP1-1第1个至第21个氨基酸为MADS-box结构域,第53个至第72个氨基酸为K-box结构域,NeAP1-2的第1个至第22个氨基酸为MADS-box结构域,第45个至第72个氨基酸为K-box结构域。
王正加[7]2006年在《山核桃分子标记与开花基因CcLFY及其启动子克隆的研究》文中指出山核桃(Carya cathayensis Sarg.)是我国特有干果和木本油料树种,主要分布在浙皖交界天目山系29°～31°N, 118°～120°E,浙西北山区近7万农户从事山核桃生产经营,70%以上的收入来源于山核桃。研究山核桃分子标记和克隆开花相关基因及其启动子,为其良种选育提供新的理论基础和途径,为培育缩短童期提早开花结实的新品种奠定分子育种基础,对该重要经济树种改良具有重要理论和实际意义。本文利用RAPD分子标记技术分析中国山核桃属6种植物间亲缘关系、5个山核桃和3个大别山山核桃天然种群遗传多样性;利用AFLP技术分析山核桃与薄壳山核桃杂交F1代的遗传变异;以常规分子生物学技术和锚定PCR技术分别克隆山核桃开花基因CcLFY及其启动子,并在GenBank注册,主要结果如下:1、中国山核桃属6种植物间亲缘关系研究表明:20个引物共扩增检测到317条谱带,平均每个引物扩增15.58条,其中271条谱带表现出多态性,占总带数的85.5%。POPGEN32软件分析显示:山核桃属6种植物间,遗传距离最小为0.2216,存在于山核桃和湖南山核桃之间,表明二者亲缘关系最近;遗传距离最大为0.5440,存在于湖南山核桃与薄壳山核桃之间,表明两者亲缘关系最远。5个山核桃树种天然群体和3个大别山山核桃天然群体RAPD分析表明:20对10bp随机引物扩增共检测到252条和238条谱带,其中多态带为168和162条,占66.7%和68.1%。遗传多样性分析结果显示:Shannon多样性指数为0.4102和0.4761,说明60.32%和58.18%的变异分布于群体内,而种群间变异占39.68%和41.82%,表明种群内有较丰富的遗传变异;这为良种选育提供了理论依据。2、利用AFLP技术对山核桃与薄壳山核桃授粉子代进行了分析,结果表明:父本与母本和子代之间有明显的差异,但母本与子代之间没有存在任何差异。3、我们根据已注册的开花调控关键基因LEAFY(LFY)同源基因的保守序列设计特异性引物,克隆到山核桃LFY同源基因片段基础上,以3’和5’RACE克隆获得山核桃LFY同源基因CcLFY全长cDNA,1442bp,已在GenBank注册,注册号为DQ989225。其中,开放阅读框(ORF) 1158 bp,编码385个氨基酸(包括起始密码子ATG)和一个终止密码子TAA,推测其分子量为43.5KD。cDNA序列中包含有脯氨酸富集区、中央酸性域、亮氨酸拉链结构及由赖氨酸和精氨酸残基形成的碱
王利琳[8]2003年在《黄瓜离体子叶节花分化的生理和分子基础研究》文中研究说明关于成花机理的研究一直是植物发育生物学中的热点问题，也是生物学中的一个基本理论问题。成花过程包括花的诱导、花原基与花器官原基的形成以及花器官的发育等阶段，本文研究的重点是花原基与花器官原基的分化形成。本实验以黄瓜为材料，开展了黄瓜子叶离体培养物直接成花实验系统的建立和优化、成花的形态变化时程、成花的生理生化变化、运用RNA原位杂交技术分析CFL基因在花芽分化中的时空表达以及开花基因工程等方面的研究。主要研究结果如下： 1．试验了在不同pH值培养基上连续培养和预培养对离体黄瓜子叶直接形成花芽的影响。连续培养时，以pH6.5时花芽形成百分率最高，为55.0％；pH预培养时，以pH7.0预培养2d的效果最好，花芽分化率可达71.4％，并使花芽形成高峰期提前20d左右。 通过切去1/2子叶和不同长度下胚轴、调节培养基中激素配比及浓度、采用子叶节培养等进一步的试验发现，叁碘苯甲酸(TIBA)和多效唑(PP333)极显着地协同促进完全切除下胚轴的黄瓜离体子叶节直接成花，TIBA与PP333相配合的最适浓度为1.0～1.5mg/L，直接成花率高达90％。这一实验系统操作简单、周期短、成花率高、重复性好，为后续研究奠定了基础。 2．对黄瓜0～7d幼苗及去顶后在诱花和诱芽培养基上培养0～8d的子叶节进行了系统的石蜡切片观察，未发现0～7d幼苗的子叶叶腋存在明显的潜伏芽。去顶后1～2d在子叶叶柄基部与切口之间的表皮下细胞分裂形成突起，去顶后6d诱花与诱芽的突起表现出形态差异，诱花子叶节突起的上端变钝，而诱芽子叶节突起的上端成尖锥状。去顶后8d诱花子叶节分化形成完整的花芽。扫描电镜观察证实，去顶后3d可见原基突起，4d原基出现二次突起，6d时即可区分出花芽和营养芽之间的形态差异。通过上述观察，明确了黄瓜子叶节花芽分化的形态时程。 3．通过在有Ca~(2+)和无Ca~(2+)培养基上进行转换试验，发现黄瓜子叶节离体培浙江大学博士学位论文中文摘要养物花分化过程中存在C扩+敏感期。子叶节在无C扩+培养基中分别培养。、1、2、3、4、5、6d后，转入含6llun。比CaC12的培养基中培养24h，再转回到无c扩干培养基继续培养。结果表明在无caz+培养基中培养冬3d后，进行24 h Caz+脉冲处理显着增加子叶节的花芽分化率，其中以无C扩+培养4d后C扩+脉冲处理的效果最为明显，花芽分化率达34.3%。认为黄瓜子叶节离体培养O碑d是花分化的c扩+作用敏感期。 用高效液相色谱法(HPLC)测定了黄瓜子叶节花芽分化期(0一6d)内源激素及多胺的变化。结果显示，子叶培养O一Zd生长素(IAA)、赤霉素(GA3)、玉米素(ZT)、脱落酸(ABA)等4种内源激素均明显下降，4一sd略有上升，表明O~2 d IAA、G与和ABA的剧降有利于花原基形成，3一sd较高的ZT含量有利于花器官原基的形成。除腐胺(Put)外，精胺(Spm)、亚精胺(spd)、尸胺(Cad)在O一ld均下降，1碎d上升，4一sd再下降，Put在0-ld急剧上升，而后持续下降，表明高水平的内源多胺总量和Put可能有利于花原基分化，Zd后Spm含量上升有利于花器官原基分化，而Cad含量变化可能是区别花芽和营养芽分化的特征之一。 4.首次利用RNA原位杂交技术，研究了LFY同源基因—C万艺基因在黄瓜花芽分化和营养芽分化及形成中的表达模式。结果显示:去顶培养3d后，CF艺基因首先表达于原基顶端;4d后表达增强，表达范围扩展到原基中心区域:sd一6d，CF’L基因强表达于整个花原基、花器官原基或叶原基;7d后，CF’L基因仅表达于花瓣和雄蕊，或叶腋原基和最幼嫩叶原基，表达强度也减弱:在成熟组织中没有检测到CF艺基因的表达。结果说明CF艺基因在黄瓜营养性分生组织、叶原基、花分生组织和花器官原基形成之初发挥重要作用，在花原基和花器官原基形成时表达最强;仅靠CF艺基因的杂交信号不能确认原位组织具有花属性，但是，花分生组织属性的获得、花器官原基的启动确实需要有CFL基因的表达。 5.通过基因工程方法将C万Z基因异源导入大岩桐，期望得到提早开花的转基因新品种，为控制重要的粮食作物和名贵花卉的开花时间提供实验依据，国内外还不多见。利用pBC KS十质粒载体上的Smal和Sacl酶切位点，将CFz基因成功克隆到表达载体pBI 1 21(含CaMv35S启动子)上，命名为pBI一cfl。通过根癌农杆菌 EHA105介导，叶盘法转化大岩桐，经过抗性压力筛选、诱浙江大学博士学位论文 中文摘要导分化后，共获得45株再生植株。经过PCR检测、DNA点杂交和PCR一Southern杂交表明，目的基因已经整合到大岩桐基因组中。目前，对转CFL基因再生植株的Northern杂交、开花性状表现、生理生化分析和后代遗传行为的观察和研究正在进行之中。
郭天玮, 苏江, 阮维程, 季孔庶[9]2015年在《马尾松FLO/LFY基因的克隆及其功能分析》文中研究指明FLO/LFY及其同源基因是控制花分生组织形成和开花时间的基因之一。本研究通过反转录PCR克隆技术和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从马尾松中分离得到了PmLFY和PmNLY两条FLO/LFY基因的cDNA序列。两条序列均包含完整的编码区与"5'端"和3'非翻译区,长度分别为1 555 bp和1 236 bp,对应的编码氨基酸长度是411 aa和310 aa。序列分析发现PmLFY和PmNLY两个蛋白均属FLO/LFY蛋白;分别有13和11个丝氨酸激酶位点。对PmLFY和PmNLY两个蛋白与其他物种的FLO/LFY蛋白构建进化树,发现PmLFY蛋白与辐射松最为接近,与加勒比松、挪威云杉等较为接近,属同一分支;PmNLY蛋白只存在于裸子植物之间,与辐射松,华山松等松科关系较近,但与PmLFY分化较明显;裸子植物之间LFY-like与NLY-like分化十分明显,裸子植物的NLY蛋白与被子植物的FLO/LFY更为接近。通过组织特异性分析发现,PmLFY和PmNLY主要集中在冬芽中表达,且在侧芽的表达量高于顶芽,分别相对于顶芽表达量的1.8和1.3倍。研究结果为进一步分析马尾松FLO/LFY的功能和开花作用机制奠定了基础。
王凤华[10]2003年在《龙眼体细胞胚胎发生过程中的基因差别表达》文中指出龙眼胚性愈伤组织的体细胞胚胎发生与合子胚的发育过程基本相同，依次经过愈伤组织、球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚以及成熟胚等阶段。通过对2，4-D浓度及生长发育时间的控制获得了高度同步化的各发育阶段体胚材料。 采用SDS法、CTAB法、LiCl沉淀法均可从龙眼胚性培养物提取高质量的DNA。LiCl沉淀法简便、快捷、经济且提取的DNA较前两者质量更高，是适合用于胚性培养物DNA提取的一种方法。采用RNA抽提试剂盒提取的RNA适合mRNA差别显示分析。 本试验首次建立了龙眼胚性培养物的mRNA差别显示技术，并利用此技术对龙眼体细胞胚胎发生整个过程中的mRNA变化进行分析，结果获得了30条差异cDNA片段，经Northern和反Northern杂交获得阳性片段5条(longan1、longan2、longan3、longan4、longan4’)，其中longan1在龙眼体胚的胚性愈伤组织和球形胚阶段表达；longan2为组成型表达，即存在于整个体胚发生过程中；longan3在球形胚和鱼雷形胚阶段特异表达；longan4、longan4’在子叶形胚阶段特异表达。 碱基序列分析表明，longan1在3’端存在一个开放阅读框(ORF)，longan2、longan3分别在5’端存在一个开放阅读框，longan1在3’方向，longan2、longan3在5’方向均没有终止密码子，所以可能往相应的方向延伸仍为各自的ORF，因此可以通过RACE或者筛选cDNA文库的办法来获得它们的全长cDNA。登陆Genbank进行同源性比较发现longan2、longan3、longan4、longan4’均没有同源基因，而longan1与番茄apx基因具有较高的同源性(92％)，推测longan1可能是龙眼体细胞胚胎中存在的apx基因。 龙眼体细胞胚胎发生过程中不仅mRNA的种类和数量存在明显变化，而且蛋白质的种类和数量也存在显着变化。采用蛋白质水平双向电泳技术研究龙眼体胚发生过程中的蛋白质变化，获得13个特异蛋白；分析发现这些特异蛋白的等电点与龙眼体细胞胚胎发育进程相关，随着发育进程的推进，特异蛋白的等电点呈降低趋势。推测龙眼体胚的发育与特异蛋白的酸碱性相关。 分析mRNA差别显示的结果和蛋白质双向电泳结果，发现龙眼在胚性愈伤组织和球形胚阶段，差异表达的mRNA多于后期阶段(子叶形胚和成熟胚阶段)，但蛋白质却较后期少。推测胚性愈伤组织阶段和球形胚阶段某些基因正处于转录mRNA或以mRNP的形式存在，为以后体胚发育作准备，此后由于mRNA翻译产生大量特异蛋白，促使了特定阶段体细胞胚胎的发生与发育。
参考文献：
[1]. 银杏LEAFY同源基因的分离克隆及其相关基础研究[D]. 张建业. 浙江大学. 2002
[2]. 银杏再生体系建立和LEAFY基因表达、转化的研究[D]. 郭长禄. 浙江大学. 2004
[3]. 油桐LFY同源基因的克隆及花芽分化生理基础研究[D]. 孙颖. 中南林业科技大学. 2008
[4]. 毛白杨花芽分化规律与开花调控的分子基础研究[D]. 王冬梅. 北京林业大学. 2007
[5]. DFL基因在甘菊中的转化与表达研究[D]. 丁焱. 北京林业大学. 2009
[6]. 荷花LFY、AP1基因片段的克隆与分析[D]. 李创. 河南农业大学. 2010
[7]. 山核桃分子标记与开花基因CcLFY及其启动子克隆的研究[D]. 王正加. 北京林业大学. 2006
[8]. 黄瓜离体子叶节花分化的生理和分子基础研究[D]. 王利琳. 浙江大学. 2003
[9]. 马尾松FLO/LFY基因的克隆及其功能分析[J]. 郭天玮, 苏江, 阮维程, 季孔庶. 分子植物育种. 2015
[10]. 龙眼体细胞胚胎发生过程中的基因差别表达[D]. 王凤华. 福建农林大学. 2003
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