张秀丽[1]2002年在《冷冻与甘油保存鼠坐骨神经异体移植再生效果的对比研究》文中研究表明目的：各种原因造成的周围神经缺损，其修复与重建是当前周围神经领域的一大难题。自体神经移植是修复周围神经缺损的最佳方法，但自体神经移植不可避免的造成供区感觉丧失，且来源有限。于是许多学者致力于同种异体神经移植的研究，试图降低异体神经移植的排斥反应以提高再生效果。降低排斥反应的方法集中于对移植神经进行预处理或者对受体进行免疫抑制两个方面。对移植神经进行预处理的方法中，以液氮冷冻和甘油处理两种方法较简便，且产生了较好的再生效果。本实验通过比较液氮冷冻和甘油处理两种方法保存大鼠坐骨神经进行异体移植的效果，探索出一种较好的进行异体神经移植的方法。 方法：取40只成年雄性SD大鼠，体重250g±20g，随机分为4组，每组10只。A组(移植物供体组)：切取大鼠的双侧坐骨神经，其中10根于-196℃下保存3周，移植前在37℃生理盐水中复温。另外10根坐骨神经在37℃条件下依次浸泡于50％、70％和85％的甘油溶液中，每次3小时，然后分装于盛有85％甘油溶液5ml的小瓶中，密封置5℃条件下保存，6周后行异体神经移植，移植前用生理盐水浸泡30分钟。B组(液氮冷冻组)： 中文拍要冷冻保存的坐骨神经作为桥接物进行异体移植＊组（甘油处理组＊以甘油保存的坐骨神经作为桥接物进行异体移植。D组（对照组）：以生理盐水浸泡30分钟的新鲜自体坐骨神经再植组，切取0．scm长坐骨神经移植物来修复缺损。各组均用11刀尼龙线缝合神经外膜，将神经移植物与神经断端做端端吻合，术后不用任何药物，喂养条件、室温及管理条件完全一致。术后分别于4周、8周和16周对移植神经行大体和光镜观察，术后16周行电镜、电生理、轴突图像分析等检查，并对甘油和液氮冷冻两种方法处理后的异体神经桥接物行光镜和电镜观察。 结果：3组中以自体神经再植组再生效果最好，异体神经移植组中，甘油处理神经移植组神经再生倩况优于液氮冷冻组，但较自体再植组差，经统计学处理，神经电生理结果和轴突图像分析有显着性差异。 结论屏体神经用甘油处理后，进行移植能够更有效的促进神经再生．
苗存良[2]2004年在《普乐可复（FK506）结合冷藏大鼠坐骨神经同种异体移值再生效果的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：临床上，周围神经长段缺损行自体神经移植是首选方法，但是自体神经来源有限，并给供区造成一定的功能障碍，况且，神经生长速度为1mm/d，也是需要迫切解决的问题。目前解决神经缺损的方法集中在二个方面，一方面尝试肌桥、静脉管、硅胶管、组织工程等，但这些替代物的研究都处于实验阶段。另一方面即是用同种异体神经移植来进行修复，但存在免疫排斥反应问题，对同种异体神经预处理降低其抗原性的方法有化学法、冷冻法、干燥法、照射法等，都能降低其抗原性，还有应用免疫抑制剂、皮质激素，或同时应用都取得较好效果。周围神经损伤后其再生速度为1mm/d,是影响功能恢复的主要因素。肌肉长时间失神经支配后，肌纤维出现萎缩、变性和纤维化，彻底丧失功能恢复的可能。因此加速神经再生的速度，由现在的1mm/d提高到2-3mm/d,一直是基础和临床周围神经研究工作者的目标。因此，周围神经长段缺损需解解决二个问题：一为如何桥接神经缺损，二为如何加速神经再生。而新型免疫抑制剂FK506的问世，给加速神经再生提供了技术支持，FK506是从链霉菌属中分离出来的大环内酯类抗生素，英文名tacrolimus,常译为他克莫司或他克雷姆，商品名为普乐可复，FK506为实验室命名。它的主要作用（1）抑制器官移植排斥反应的作用,（2）促神经再生作用,（3）神经保护作用。临床上异体<WP=4>手移植发现，应用FK506可加速神经再生速度达3mm/d。故本实验设计（1）冷藏同种异体神经移植神经再生是否优于新鲜同种异体神经移植神经再生，（2）冷藏同种异体神经移植联合应用FK506神经再生是否优于单纯冷藏同种异体神经移植再生，（3）冷藏同种异体神经移植神经再生FK506的合适剂量，基于此我们设计了本实验。来探索出一种较好的进行同种异体神经移植的方法。方法：取75只雌性Winster大鼠做为受体，体重150—200g，按手术先后随机分为5组，每组15只，A组：新鲜同种异体神经移植组，B组：冷藏保存同种异体神经移植组，C组：冷藏保存同种异体神经移植组同时应用FK506剂量为2mg/kg/d，D组：冷藏保存同种异体神经移植组同时应用FK506剂量为0.5mg/kg/d，E组：新鲜自体神经移植组。另取30只SD大鼠，取其双侧坐骨神经共60根作为供体，其中15根用生理盐水浸泡30分钟直接移植于A组，其余45根依次浸泡于50%、70%、和85%甘油溶液中，每次3小时，然后分装盛有85%甘油溶液的无菌密闭瓶中，置于5°C条件下保存1周，移植前用生理盐水浸泡30分钟,分别移植于B、C、D组。各组均用11-0无创缝合线缝合神经外膜，将神经移植物与神经断端作端端吻合，术后A、B、E组不用任何药物，C组应用FK506剂量为2mg/kg/d灌胃8周，D组应用FK506剂量为0.5mg/kg/d灌胃8周，喂养条件、室温及管理条件完全一致。术后分别于8、10周对移植物行大体和光镜观察及轴突图像分析、比目鱼肌湿重比较、患肢坐骨神经电生理检查，于8周行移植神经电镜检查。对肌电图结果（传导速度、波幅、潜伏期）、比目鱼肌肌湿重、有髓神<WP=5>经纤维再生恢复率的原始数据采用SAS统计软件进行单因素方差分析，P<0.05提示有统计学意义。结果：术后8、10周时，通过对各组大体观察结果、显微解剖观察、光镜观察结果、电镜观察结果、电生理检测结果、比目鱼肌肌湿重结果的分析，3组中C、E组神经生长最好，D组神经再生好于A、B组，A、B组比较，A组较B组差。经过对肌电图、有髓神经纤维再生恢复率、肌湿重的统计学分析，有显着性差异(p<0.05)。结论：本实验结果说明，冷藏同种异体神经移植联合应用FK506组2mg/kg/d神经再生效果最好，与正常相似。冷藏同种异体神经移植联合应用FK506组0.5mg/kg/d神经再生效果次之，冷藏同种异体神经移植联合应用FK506组优于不用药组，而新鲜同种异体神经移植组神经再生效果最差。联合应用FK506和冷藏保存预处理同种异体神经可以加速同种异体神经移植后的神经再生及功能恢复。
陈增刚[3]2009年在《川芎嗪玻璃化液保存同种异体周围神经的实验研究》文中指出第一部分川芎嗪玻璃化液对大鼠坐骨神经雪旺细胞凋亡及其相关基因的影响目的:探讨不同浓度的川芎嗪玻璃化保存液对大鼠坐骨神经中雪旺细胞凋亡及相关基因的影响。方法:选择成年清洁级SD雄性大鼠24只,在骨盆口以远5mm处切断双侧坐骨神经,向远端游离约15mm切断,共获得48条神经,按玻璃化保存液中川芎嗪的浓度随机分为1个对照组(不含川芎嗪—A组)及3个实验组(100mg/L—B组,200mg/L—C组,400mg/L—D组),-196℃液氮保存,3周后分别进行HE染色光镜检测、Bcl-2、Bax免疫组化检测、细胞凋亡TUNEL检测。结果:C、D组坐骨神经中雪旺细胞凋亡数量明显少于A、B组,C、D组坐骨神经的Bcl-2阳性表达率均明显高于A、B组,Bax阳性表达率均明显低于A、B组,差异均有统计学意义(P<0.05);C、D组间无统计学差异。第二部分川芎嗪玻璃化液对大鼠异体坐骨神经免疫反应的影响目的:探讨不同浓度的川芎嗪玻璃化保存液对异体神经免疫反应的影响。方法:选择成年清洁级SD雄性大鼠24只,切取双侧坐骨神经,共获得48条神经,按玻璃化保存液中川芎嗪的浓度随机分为A、B、C、D 4个实验组,-196℃液氮保存3周后,选择成年清洁级Wistar雄性大鼠48只随机分为相应的4组作为受体,在其背部皮下植入经过含川芎嗪的玻璃化液保存的SD大鼠的坐骨神经;另外选择成年清洁级Wistar雄性大鼠12只作为对照组,植入新鲜自体神经。术后2周进行大体观察、组织学和免疫学检测。结果C、D组CD4+和CD8+淋巴细胞的侵润程度明显轻于A、B组,神经组织较好保持原形态,周围仅见极少量淋巴细胞侵润,与E组无明显差别。第叁部分川芎嗪浓度对大鼠异体坐骨神经玻璃化保存后再生的影响目的:探讨不同浓度的川芎嗪对玻璃化保存的大鼠异体坐骨神经再生的影响。方法:选择成年清洁级SD雄性大鼠48只作为供体,切取双侧坐骨神经,制成15mm神经段,按玻璃化保存液中川芎嗪的浓度随机分为A、B、C、D 4个组,-196℃液氮保存3周。3周后选择成年清洁级Wistar雄性大鼠96只作为受体,做成坐骨神经缺损10mm的模型,并随机分为4组。神经段复温后移植给相应组的受体。术后分别于4周、8周和16周进行大体观察以及移植神经的光镜、电镜、电生理、轴突图像分析等检查。结果:4组中以C、D组再生效果最好,B组其次,A组最差。经统计学处理,神经电生理结果、轴突图像分析以及运动终板计数差异显着(P <0.01)。第四部分-20℃川芎嗪玻璃化液保存大鼠异体神经对再生的影响目的:探讨不同时间段-20℃川芎嗪玻璃化液保存大鼠异体坐骨神经对再生的影响。方法:-20℃川芎嗪玻璃化液(川芎嗪浓度为200mg/L)(A组)保存成年SD雄性大鼠坐骨神经,时间分别为1周、2周,然后选择成年Wistar雄性大鼠坐骨神经缺损模型作为受体,神经段复温后移植给受体,术后分别于4周、8周、16周进行大体观察以及移植神经的大体、光镜、电镜、电生理、荧光逆行示踪、运动终板等检查;并分别与-20℃玻璃化液(不含川芎嗪)(B组)和-196℃川芎嗪玻璃化液(川芎嗪浓度为200mg/L)(C组)保存的坐骨神经进行比较。结果:保存1周时-20℃川芎嗪玻璃化液组与-196℃川芎嗪玻璃化液组再生效果无统计学意义(P>0.05),与20℃玻璃化液组的差异有显着性(P<0.01);保存2周以后3组中以-196℃川芎嗪玻璃化液组再生效果最好,-20℃川芎嗪玻璃化液组其次,-20℃玻璃化液组最差。结论:1.含川芎嗪的玻璃化保存液能够通过调节Bcl-2和Bax的表达而有效抑制雪旺细胞的凋亡。2.同种异体神经在川芎嗪玻璃化液中深低温保存后,抗原性可以明显降低。3.玻璃化保存液中加入一定浓度的川芎嗪可改善大鼠同种异体神经再生效果。4.玻璃化保存液中加入川芎嗪可提高大鼠同种异体神经的保存温度值,-20℃时可保存大鼠周围神经1周。
王冠军[4]2007年在《化学去细胞异体神经促神经再生及趋化性生长实验研究》文中指出研究背景：周围神经损伤的修复是临床上的难题，目前修复手段依然以自体神经移植为标准手术，但由于自体神经来源有限且造成供区较多的并发症，故多年来医学界不断寻找能够替代自体神经移植的生物材料。在众多的替代材料中，去细胞异体神经移植物显示了良好的应用前景。为了最大限度地去除异体神经免疫原性物质，同时较完好地保存神经内部结构和细胞外基质的活性成分，本课题对化学去细胞神经的制备方法进行了改良，并修复大鼠坐骨神经缺损，评价其再生效果。为了促进神经趋化性再生，最终提高神经修复效果，本课题研究了去细胞异体神经移植对神经轴突趋化性生长的影响，并建立大鼠脊髓背根神经节切除动物模型，为周围神经趋化性再生的定量评价提供有效的研究方法，并对化学去细胞异体神经移植物的促神经趋化性再生作用进行了定量评价。方法：(1)综合应用萃取剂Triton X-200、SB-10和SB-16对大鼠坐骨神经的化学处理方法进行改良，并与Sondell方法(应用萃取剂Triton X-100和脱氧胆酸钠)进行比较，从细胞、髓鞘的去除、结构完整性保存等方面综合评价制备物的质量。(2)将两种方法制备的去细胞异体神经及自体神经桥接大鼠坐骨神经缺损，从坐骨神经指数(SFI)、神经电生理、运动终板染色、再生神经纤维计算机图像分析等方面评价神经移植后的再生效果。(3)解剖研究大鼠坐骨神经的解剖组成及脊髓背根神经节的位置；背根神经节切除后3周，取双侧坐骨神经及其胫神经、腓神经、腓肠神经3分支行髓鞘染色，观察各神经中感觉纤维的溃变情况，行半薄切片甲苯胺兰染色，病理切片计算机图像分析计数，评价模型的可靠性。(4)去细胞异体神经及自体神经桥接大鼠坐骨神经缺损后3个月：部分实验动物行脊髓背根神经节切除术，术后3周取其腓肠神经行病理染色，病理切片计算机图像分析计数，并计算错接率，定量评价去细胞异体神经的促趋化性再生作用；不行脊髓背根神经节切除术的实验动物，取其腓肠神行乙酰胆碱酯酶和碳酸酐酶染色，定性或半定量评价去细胞异体神经的促趋化性再生作用。结果：(1)两种方法制备的移植物去细胞效果均较好。与Sondell法相比，改良法对髓鞘的去除较彻底、对神经结构的破坏较小、对基底膜素的保留较多、综合质量评分较好。(2)移植后神经再生效果：改良法SFI测量结果优于Sondell法，运动神经传导速度较快、腓肠肌萎缩较轻、再生运动终板较多、神经纤维平均直径及髓鞘平均厚度较好，基本上达到了与自体神经移植相当的效果。(3)DRG切除术后，腓肠神经(纯感觉神经)中有髓神经纤维髓鞘完全溃变，坐骨神经、胫神经、腓神经中部分有髓神经纤维发生溃变。(4)乙酰胆碱酯酶、碳酸酐酶染色定性评价：同自体神经移植组比较，去细胞异体神经移植组中腓肠神经乙酰胆碱酯酶染色棕色颗粒较少，碳酸酐酶染色黑色颗粒较多。脊髓背根神经节切除定量评价：去细胞异体神经移植组中，腓肠神经发生溃变的神经纤维较多，未溃变的神经纤维较少。去细胞异体神经移植组和自体神经移植组腓肠神经中运动纤维的错接率分别为2.27％和7.65％，有明显的统计学差异。结论：(1)综合运用萃取剂Triton X-200、SB-10和SB-16的化学萃取方法，是一种较为理想的异体神经移植物制备方法，能够制备出免疫物质清除完全、神经结构保存较好的去细胞异体神经移植物。(2)DRG切除模型可靠性好，能够较好地定量评价周围神经的趋化性再生效果，可作为不同修复材料和修复方法促趋化性再生效果的定量评价方法。(3)化学去细胞异体神经移植物，具有明显的促神经趋化性再生作用。(4)化学去细胞异体神经移植物不但在桥接修复神经缺损中起到支架、支撑作用，还具有其它人工合成材料所不具备的、较强的促神经趋化性再生作用，化学去细胞异体神经移植物是一种理想的神经移植物，有望替代自体神经移植。
腾飞[5]2010年在《二氧化碳氧气混合气干燥保存周围神经的实验研究》文中认为目的：通过对大鼠坐骨神经在CO2/O2中干燥保存的效果和移植后神经再生的情况的研究,探索CO2/O2中干燥保存法在周围神经保存中的应用价值。方法：将F344大鼠坐骨神经15mm分别通过不同方式处理后移植到F344大鼠坐骨神经12mm缺损处。分组：A：将供体神经不做任何处理,取出后即刻移植；B(干燥保存组)：将供体神经保存在CO2/O2混合气(P CO2=100hPa,P 02=900hPa)中；C：将供体神经置于UW液中；D(干燥保存组)：将供体神经保存在纯02(PO2=1000hPa)中,B、C、D组4℃保存3周后移植。移植前,电镜评估移植段神经纤维横断面结构；移植后12周,通过电生理、肌肉湿重、肌纤维横截面积、神经免疫荧光染色、神经纤维计数、神经纤维圆当量直径计算、神经横截面电镜形态学观察、统计学分析等方法评估神经再生情况。结果：移植前电镜形态学观察移植段神经显示B组Schwann细胞和髓鞘仅轻度变性,接近于A组正常神经纤维结构,明显优于C、D组。移植术后12周,通过以上指标评估神经纤维再生效果,B组与A组相近,并显着优于C、D组。结论：CO2/O2干燥保存法可成功应用于周围神经组织的保存,CO2在保存过程中发挥了重要作用。
孔凡宾, 陈克明, 刘兴炎[6]2008年在《同种异体神经移植研究中降低免疫排斥反应的进展》文中进行了进一步梳理周围神经缺损,无论在平时或战时,都十分常见。缺损后,临床上首选自体神经移植,但自体神经来源有限,并给供区造成一定的功能障碍。目前,解决神经缺损的研究主要集中在两个方面:一方面是研究采用肌桥、静脉管、硅胶管、组织工程等替代物,前叁种的结果都不如人意,而后者
李智[7]2008年在《重组腺病毒介导人肝细胞生长因子基因修复周围神经损伤的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景:周围神经缺损的修复以自体神经移植效果最佳。但可供移植的自体神经来源有限,且切取后有供区麻木、疤痕、神经瘤等并发症,故难以满足粗大、长段神经缺损修复的需要。化学去细胞同种异体神经是新型生物组织工程材料——免疫源性低、内部天然结构保留完整,可以引导宿主许旺细胞迁移并促进轴突再生,已逐渐成为自体神经移植较理想的替代物。目前比较棘手的难题是神经缺损修复后,神经再生的质量和速度不尽人意。周围神经损伤修复后,能否成功再生主要取决于是否具有适合其生长的微环境条件。包括肝细胞生长因子(HGF)在内的神经营养因子(neurotrophicfactors,NTFs)是再生微环境中的重要因素,对再生神经的生长和走向起重要的营养和诱导作用。外周神经系统损伤后,内源性HGF表达的增加可以保护神经元,加快轴突的生长,促进神经纤维的修复。但是由于其存在时间及浓度有限,加之外源性的HGF重组蛋白纯化困难,半衰期短——都不能完全满足神经再生的需要。基因技术是提供神经营养因子的良好工具,它可以将目的基因提供给受损部位并持续表达,促进神经生长。本研究将腺病毒载体介导的人肝细胞生长因子基因局部注射,通过骨骼肌细胞的转染,持续表达目的蛋白(HGF)——观察其在周围神经损伤修复中的可行性及对神经生长的作用,为进一步的临床试验提供依据。方法:(1)检测携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad-HGF)体外对小鼠骨骼肌细胞的转染效率以及转染细胞对目的蛋白的表达。以不同感染复数(M.O.I)(0、50、100、200、400)的Ad-GFP(携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒)感染骨骼肌细胞,48小时后用流式细胞仪检测转染效率。Ad-HGF(MOI=400pfu/cell)转染小鼠骨骼肌细胞,每48h收集培养上清,对照组转染Ad-GFP,ELISA法检测上清中HGF的表达,持续至第14天。(2)化学去细胞同种异体神经修复Wistar大鼠坐骨神经10mm缺损后,近、远端吻合口附近肌肉分别注射腺病毒介导的人肝细胞生长因子(异体神经+HGF组),与自体神经移植组和无HGF作用异体神经组(异体神经组)对照,通过步态分析、肌肉湿重测定、轴突生长速率测定、神经电生理、计算机图像分析等指标评价神经移植后再生效果。(3)以Wistar大鼠坐骨神经挤挫伤(Crush)为动物模型,神经损伤局部肌肉注射腺病毒介导的人肝细胞生长因子(Crush+HGF组),与无注射HGF组(Crush组)对照,通过步态分析、肌肉湿重测定、计算机图像分析等指标评价神经损伤后再生效果。(4)借鉴Hudson发明的异体神经化学萃取方法(简称Hudson法),综合应用萃取剂Triton X-200、SB-10和SB-16对犬坐骨神经的化学处理方法进行改良,并与Sondell发明的异体神经化学萃取方法(简称Sondell法)(应用萃取剂Triton X-100和脱氧胆酸钠)进行比较,从细胞、髓鞘的去除,结构完整性保存等方面综合评价移植物的质量,建立一种新型的神经萃取方法。(5)按照第四部分建立的神经萃取方法制备犬去细胞异体神经,修复犬坐骨神经5厘米缺损;近、远端吻合口附近肌肉分别注射腺病毒介导的人肝细胞生长因子(异体神经+HGF组),与自体神经移植组和无HGF作用异体神经组(异体神经组)对照,通过神经电生理、组织学观察、计算机图像分析等指标评价神经移植后再生效果。结果:(1)在Ad-GFP转染骨骼肌细胞48h时,GFP的表达明显增强,荧光显微镜观察可见绿色荧光。流式细胞仪检测转染效率:随着MOI的增大,转染效率明显提高。骨骼肌细胞转染HGF后,ELISA法定期检测其表达。48h时,HGF的表达与对照组相比明显增加,可达131ng/mL。随着时间的推移,表达量开始降低,第8d明显降低,随后维持一个相对稳定的水平。(2)术后16周同自体神经移植对比,去细胞异体神经可以修复大鼠周围神经缺损。在步态分析、肌肉湿重测定、轴突生长速率测定、计算机图像分析等指标评价中,异体神经+HGF组与异体神经组的差异具有明显统计学意义,异体神经+HGF组与自体神经移植组的差异没有统计学意义。神经移植体内新生血管面积与移植物横截面积比例的比较,异体神经+HGF组与异体神经组和自体神经移植组的差异分别具有明显统计学意义。(3)术后4周,在步态分析、肌肉湿重测定、轴突生长速率测定、计算机图像分析等指标评价中,Crush+HGF组与Crush组的差异具有明显统计学意义。(4)通过组织学观察和综合质量评分比较,改良Hudson法组制备的犬去细胞异体神经,可以在去除许旺细胞、髓鞘等免疫源性物质的同时较好地保留基底膜管结构。(5)尽管采取石膏、假肢固定等保护措施,仍不能避免动物自虐,舔食患趾。因不能观察患肢功能恢复,提前宰杀术犬5只,仅剩余一只。术后6月神经电生理和组织学观察表明,再生神经纤维已经通过近远端吻合口。结论:(1)携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad-HGF)的构建是成功的,体外实验显示了其生物学活性,为基因治疗的临床应用提供了实验依据。(2)复合肝细胞生长因子的化学去细胞异体神经能促进神经轴突生长速度,显着增加移植物内新生血管,满意修复一定长度周围神经缺损,可以成为一种有效的周围神经组织工程修复材料。(3)肝细胞生长因子能促进大鼠坐骨神经损伤后的有髓纤维再生和功能恢复,是一种有效的治疗周围神经损伤的神经营养因子。(4)综合运用萃取剂Triton X-200、SB-10和SB-16的化学萃取方法,是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法,能够制备出免疫物质清除彻底、神经结构保存较好的犬去细胞异体神经移植物。
张建[8]2008年在《紫外线B照射的供体脾细胞预输注对异体神经移植影响的研究》文中研究指明背景和目的:长期以来,周围神经损伤的修复对于骨科医务工作者都是一个难题。临床上,用于治疗周围神经损伤尤其是长段损伤或缺损的方法中,自体神经移植术仍是最可靠的治疗手段,但是供区神经功能损失及可供缝合神经长度及直径有限是不可克服的缺点。硅胶管等各种合成材料和自体骨骼肌、静脉等生物源性材料可引导神经再生,但其结构与神经基底膜不同,轴突再生欠佳,临床应用价值不大,同种异体神经移植可克服上述缺点,但存在排斥反应问题。本研究旨在:通过尾静脉预输注经紫外线照射的供体脾细胞及同种异体坐骨神经移植后,测定大鼠外周血T淋巴细胞亚群,探讨周围神经缺损修复的可行性。为修复周围神经缺损提供一种新的方法。研究方法:选用成年雄性供体SD大鼠,消毒后无菌摘取脾脏,即制成单细胞悬液。用中波紫外线荧光灯照射,强度剂量为12000 J/m2,用0.2%台盼蓝染色计数细胞活率大于95%。以尾静脉方式给予Wister受体鼠,总量2.5×107个细胞的供体SD鼠脾细胞。根据周围神经移植方法的不同,将Wister大鼠随机分为3组,每组10只:Ⅰ组为自体神经移植组、Ⅱ组为异体神经移植组、Ⅲ组为尾静脉预输注经紫外线照射的供体脾细胞异体神经移植组,桥接Wistar大鼠坐骨神经1.0cm的缺损。7天后移植供体鼠坐骨神经。术后7、14天免疫学检查外周血T淋巴细胞亚群,术后8周、12周进行小腿叁头肌湿重、神经电生理学、电镜组织学检测。结果:术后7、14天免疫学检查示,应用单因素方差分析对叁组进行统计学分析。结果显示:坐骨神经移植术后7天,外周血T淋巴细胞亚群检查中,Ⅲ组较Ⅱ组的CD8T淋巴细胞的百分率高、CD4T淋巴细胞的百分率低、CD4/CD8比值大,差异有统计学意义(P<0.01)。Ⅰ组与Ⅲ组间差异有统计学意义(P<0.05)。坐骨神经移植术后14天,外周血T淋巴细胞亚群检查中,Ⅲ组较Ⅱ组的CD8细胞的百分率增加、CD4细胞的百分率减少、CD4/CD8比值变小,差异有统计学意义(P<0.05)。这表明尾静脉预输注经紫外线照射的供体脾细胞减弱了近期内(2周内)的特异性免疫反应。术后8周,小腿叁头肌湿重、运动神经传导速度, III组优于Ⅱ组,差异有统计学意义(P<0.01),Ⅰ组和III组差异有统计学意义(P<0.05)。术后12周,小腿叁头肌湿重、运动神经传导速度, III组优于Ⅱ组,差异有统计学意义(P<0.01),Ⅰ组和III组差异有统计学意义(P<0.05)。术后12周,透射电镜观察结果显示:Ⅰ组可见神经纤维内有大量再生的髓鞘及轴突,许旺细胞功能活跃,新生轴突内微丝密集排列,线粒体较大,轴膜清晰可见,有髓神经纤维较粗,髓鞘厚,板层清晰可见,雪旺氏细胞增生明显。Ⅱ组可见大部分神经纤维脱髓鞘崩解,轴突消失,未见再生的神经纤维。Ⅲ组可见大量的再生神经纤维,轴突内微丝密集排列,线粒体嵴电子密度增高,雪旺氏细胞包绕再生轴突形成有髓神经纤维,神经纤维排列规则紧密,结缔组织少。结论:尾静脉内注射去抗原的异基因脾细胞经抗原呈递细胞(主要是树突状细胞)处理呈递,诱发免疫耐受的发生。外周静脉耐受是导致机体免疫耐受的重要方法,外周静脉异基因脾细胞亦可以诱导器官移植耐受。所以经外周静脉紫外线B照射去抗原的异基因脾细胞可以诱导对异体神经移植的特异性免疫耐受。可诱导对异体神经移植的特异性免疫耐受。移植效果接近自体神经组。
柯于海[9]2010年在《不同时段应用FK506纳米微球缓释颗粒促进同种异体神经移植再生的实验研究》文中研究表明外周神经损伤的修复一直是基础和临床应用研究的一个热门课题,许多学者从不同材料的外周神经桥接到构建组织工程化的外周神经移植修复、药物促进轴突再生等方面进行了不懈的努力,但研究重点大多仍是从自体神经移植和药物促进轴突再生等方面入手。自体神经移植存在着供体来源受限、以及遗留供区感觉功能障碍等缺点。由于免疫抑制剂的使用,异体神经移植得到了很大的发展,目前在实验阶段新型免疫抑制剂FK506被公认为是该领域的首选药物。本实验选择FK506和聚乳酸-叁亚甲碳酸酯共聚物P(DLLA-co-TMC)共聚物为材料制作成P(DLLA-co-TMC)/ FK506纳米微球,在同种异体神经移植的条件下,探讨FK506纳米微球对神经再生的促进作用和最佳给药时机。【目的】1. P(DLLA-co-TMC)/FK506纳米微球的制备与性能研究。2.探讨同种异体移植后P(DLLA-co-TMC)/FK506纳米微球促进神经的再生作用及最佳使用时间。【方法】1.采用单乳化-溶剂挥发法(O/W)制备P(DLLA-co-TMC)/FK506纳米微球,精确称取100 mg P(DLLA-co-TMC)和一定量的FK506溶于4 ml二氯甲烷,搅拌下用注射器缓缓将聚合物溶液注入40 ml 2% PVA(w/v)(聚乙烯醇)水溶液中,室温减压搅拌下挥发溶剂4～6 h,将所得微球离心分离,用蒸馏水洗数次,尽量除去微球表面的PVA。冷冻干燥(ALPHA2-4冷冻干燥机,CHRIST)48 h,得到白色粉末状P(DLLA-co-TMC)载药微球,室温下干燥器中储存备用。2.同种异体移植SD大鼠胫神经0.6cm,分别于术后即刻、24小时、3天将P(DLLA-co-TMC)/FK506纳米微球局部放置于神经吻合口周围,按释放率1㎎/㎏/d释放30天,于术后不同时间点观察局部反应及结蒂组织包裹情况。测定患侧小腿叁头肌湿重,以了解肌肉萎缩及运动功能恢复情况。3.对移植神经段进行HE染色,光镜下观察神经的生长情况及测定有髓纤维数目。4.于取材前5天在移植神经远端以远5㎜的神经里注射真蓝(true blue)逆行标记神经元,在荧光显微镜下观察,测定标记的神经元胞体的总数。5.将右侧胫神经以外的所有坐骨神经分支均在起始部切断,用Medtronic肌电图分析仪的记录电极置于小腿叁头肌的肌腹中,用针灸针插入大鼠尾部并接地,将刺激电极置于胫神经的远近端进行刺激,分别得出患侧的神经传导速度和各自的健侧对比。【结果】1. P(DLLA-co-TMC)/为包封材料,采用O/W制备了负载FK506的聚合物微球,考察了药物浓度对负载率的影响,确定聚合物与药物质量比为100:10。2. FK506纳米微球可以抑制同种异体移植的排斥反应,改善了移植段胫神经的局部微环境。3.术后8、12周立即使用FK506纳米微球组和24小时给药组促使小腿叁头肌恢复的效果相似,好于3天给药组和未给药组,有显着性差异,而3天给药组和未给药组差异有统计学意义。4. FK506纳米微球促进了雪旺细胞的增殖,术后4、8、12周测定的有髓神经纤维数立即给药组和24小时给药组明显多于3天组和未给药组;而3天组和未给药组有显着性差异。5. FK506纳米微球对神经元有保护作用,能促进其恢复,术后4、8、12周true blue标记的运动神经元数立即给药组和24小时给药组明显多于3天组和未给药组;而3天组和未给药组有显着性差异。6. FK506纳米微球促进电生理的恢复,术后12周胫神经的传导速度较未给药组大大增快,而立即给药组和24小时给药组快于3给药组,差异有统计学意义。【结论】1. P(DLLA-co-TMC)/FK506纳米微球最佳质量比为100:102. FK506纳米微球降解吸收好,释药速度符合神经损伤后再生的规律。3.局部使用FK506纳米微球促进神经再生作用明显,而且所需剂量少。4.早期(24小时内)使用FK506促进神经再生作用更加明显,延迟3天后作用减弱。
于晋辉[10]2005年在《普乐可复（FK506）缓释膜应用于同种异体神经移植的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:长期以来,周围神经损伤的修复对于临床医务工作者都是一个难题。临床上,周围神经长段缺损行自体神经移植是首选方法,但是自体神经来源有限,并给供区造成一定的功能障碍,况且,神经生长速度为1mm/d,也是需要迫切解决的问题。国内外学者为了解决这两个问题进行了诸多研究。近年来许多学者的研究重点聚于同种异体神经移植,异体神经来源广、容易获得,有着广阔的临床应用前景。同种异体神经移植成功与否,主要取决于如何减轻神经移植体与宿主之间的免疫排斥反应。对同种异体神经预处理降低其抗原性的方法有化学法、冷冻法、干燥法、照射法等,都能降低其抗原性,还有应用免疫抑制剂、皮质激素,或同时应用都取得较好效果。周围神经损伤后其再生速度为1mm/d,是影响功能恢复的主要因素。肌肉长时间失神经支配后,肌纤维出现萎缩、变性和纤维化,彻底丧失功能恢复的可能。因此加速神经再生的速度,由现在的1mm/d提高到2-3mm/d,一直是基础和临床周围神经研究工作者的目标。新型免疫抑制剂FK506 是从链霉菌属中分离出来的大环内酯类抗生素,英文名tacrolimus,常译为他克莫司或他克雷姆,商品名为普乐可复,FK506 为实验室命名。它的主要作用有(1)抑制器官移植排斥反应的作用,(2)促神经再生作用。临床上异体手移植发现,应用FK506 可加速神经再生速度达
参考文献：
[1]. 冷冻与甘油保存鼠坐骨神经异体移植再生效果的对比研究[D]. 张秀丽. 河北医科大学. 2002
[2]. 普乐可复（FK506）结合冷藏大鼠坐骨神经同种异体移值再生效果的实验研究[D]. 苗存良. 河北医科大学. 2004
[3]. 川芎嗪玻璃化液保存同种异体周围神经的实验研究[D]. 陈增刚. 重庆医科大学. 2009
[4]. 化学去细胞异体神经促神经再生及趋化性生长实验研究[D]. 王冠军. 中国人民解放军军医进修学院. 2007
[5]. 二氧化碳氧气混合气干燥保存周围神经的实验研究[D]. 腾飞. 复旦大学. 2010
[6]. 同种异体神经移植研究中降低免疫排斥反应的进展[J]. 孔凡宾, 陈克明, 刘兴炎. 中国矫形外科杂志. 2008
[7]. 重组腺病毒介导人肝细胞生长因子基因修复周围神经损伤的实验研究[D]. 李智. 中国人民解放军军医进修学院. 2008
[8]. 紫外线B照射的供体脾细胞预输注对异体神经移植影响的研究[D]. 张建. 山西医科大学. 2008
[9]. 不同时段应用FK506纳米微球缓释颗粒促进同种异体神经移植再生的实验研究[D]. 柯于海. 广州医学院. 2010
[10]. 普乐可复（FK506）缓释膜应用于同种异体神经移植的实验研究[D]. 于晋辉. 河北医科大学. 2005