冯学[1]2007年在《苏云金芽胞杆菌新基因的克隆及杀虫蛋白生物活性的研究》文中进行了进一步梳理每年，农业虫害在全球范围内对农作物造成的损害，是农作物减产的最主要因素之一。由于苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringensis)对大多数农业害虫都具有特异的杀虫活性，并且，对人畜安全，不污染环境。目前，已成为世界上产量最多、应用最广泛的微生物杀虫剂。特别是，随着植物基因工程的发展，利用转基因植物来防治害虫已经进入到实际运用阶段，其中，在抗虫转基因植物方面，Bt杀虫基因得到了最为普遍的应用。本研究在克隆新的cry基因的基础上，用Cry2Ab、Cry2Aa、Cry1Ca、Vip3Da或Vip3Af杀虫蛋白对水稻二化螟、大螟的杀虫活性进行了生物活性分析；改良了培养Bt菌株的传统牛肉膏蛋白胨培养基。1．本文从实验室自行分离的C006菌株中，经PCR扩增鉴定、酶切分析和构建质粒DNA文库的方法，获得了含有10kb阳性片段转化子，对其进行亚克隆，经测序分析发现该片段含有2种cry基因，其中一个是新的cry1类基因，与己知的cryl类基因的同源性低于80％，并在GeneBank中登记，序列注册号为EF550989。另一个基因核苷酸序列与cry1Ab13一致。2．将crylGb2全长基因分别插入Bt和E coli表达载体，在大肠杆菌BL21和苏云金芽胞杆菌HD73~-中分别表达出133kDa的Cry蛋白，并且在Bt无晶体突变株中能形成典型的双锥体型晶体。这种新蛋白对小菜蛾进行生物活性测定，具有很强的毒力，LC_(50)为7.48μg／mL。3．针对水稻重要鳞翅目害虫二化螟和大螟，从本组已有的基因中选用15种，分别进行单一蛋白杀虫活性筛选，结果表明对水稻二化螟幼虫具有活性的Cry2Aa、Cry2Ab、Vip3Da蛋白，它们的致死中浓度LC_(50)分别为：27.59、13.88和10.29μg／g；毒蛋白组合Cry1Ab与Cry2Aa、Cry1Ab与Cry2Ab、Cry1Ab与Vip3Da、Cry1Ca与Cry2Aa、Cry1Ca与Cry2Ab、Cry1Ca与Vip3Da对二化螟LC_(50)分别为：0.39、0.43、0.15、0.79、0.64和3.39μg／g，不同毒蛋白的协同增效作用显著。4．对夜蛾科害虫大螟的杀虫结果表明：Cry1Ca对水稻大螟具有较显著的活性，Cry1Ca对水稻大螟的LC_(50)为4.28μg／g，Vip3Aa为16.64μg／g，Vip3Af为57.54μg／g，Vip3Da为13.93μg／g。5．对几种不同的Bt培养基进行优化，获得了最佳的配方：含有50mMTris-HCl、pH为7.2的牛肉膏蛋白胨培养基，能获得最大产量的蛋白晶体，该培养基稳定的缓冲能力，减少了晶体在培养过程中的溶解，有效地抑制了Bt菌株内源蛋白酶对晶体蛋白的降解。6．对造成中国林木严重危害的黄斑星天牛的饲养与生物测定方法进行了筛选和探索，建立了饲养和生测方法：同时也筛选到两株对天牛有毒杀活性的菌株，这将为以后对天牛具有杀虫活性的Bt基因的筛选奠定基础。
龚钰华[2]2011年在《比较蛋白质组学揭示苏云金芽胞杆菌YBT-1520不同生长期代谢变化与杀虫晶体蛋白合成的翻译调控间关系》文中研究表明苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一种产生杀虫晶体蛋白的革兰氏阳性芽胞杆菌。它产生的杀虫晶体蛋白在国内外的各种害虫防治上得到了广泛应用。在研体内杀虫晶体蛋白能够积累到细胞干重的20-30%。这种芽胞杆菌体内大量表达蛋白并形成晶体的机制受到研究者的广泛关注。虽然杀虫晶体蛋白在转录调控上的机制研究的比较透彻,但是在翻译以及翻译后修饰的研究上还很欠缺。为了更加清楚地了解这个机制,我们使用了蛋白质组学方法来研究Bt杀虫晶体蛋白在翻译水平的调控与细胞代谢之间的关系。本研究通过2-DE和MALDI-TOF-MS方法建立了苏云金芽胞杆菌YBT-1520在合成培养基不同生长时期的比较蛋白质组研究。首先我们对不同pH值范围(pH4-7、pH5-8、pH3-10、pH7-11)的苏云金芽胞杆菌全细胞蛋白的双向电泳条件进行了摸索,发现pH4-7为最适蛋白分离pH范围。使用pH4-7的双向电泳分离条件,我们完成了苏云金芽胞杆菌YBT-1520在合成培养基中生长的三个时间点：对数中期(17h)、稳定期前期(20h)和稳定期后期(26h)全细胞蛋白的双向电泳分离并进行了考马斯亮蓝G-250染色。双向电泳胶上分离的蛋白数量为800-900之间,同时对三个不同生长期分离的蛋白胶进行比较分析发现不同生长期间表达差异超过2倍的蛋白在120-205之间。选取101个高丰度差异表达蛋白进行了MALDI-TOF-MS的质谱鉴定,有72个蛋白质得到了鉴定。对这些鉴定蛋白进行功能分类发现80%的蛋白都在与代谢相关。而对不同功能分类蛋白总表达量分析发现氨基酸代谢和蛋白翻译合成相关蛋白总表达量变化最为显著。接下来我们着重分析了Bt不同生长期细胞内代谢变化和杀虫晶体蛋白翻译调控之间的关系。并通过实时荧光定量PCR方法研究了糖酵解和TCA循环的关键酶基因的转录水平。通过分析我们发现从对数期到稳定期细胞内代谢途径发生了明显的改变：1)糖酵解途径中间产物向磷酸戊糖途径和丝氨酸合成途径转移；2)TCA循环受到了严重抑制；3)PHB被认为是重要的碳源和能量的载体；4)蛋白酶表达量的上升和氨基酸合成途径的抑制暗示着细胞内有大量的蛋白质降解为氨基酸,为杀虫晶体蛋白的合成提供前体；5)翻译相关因子：EF-Tu、GroEL和GatB表现出上调而核糖体抑制因子YfiA表现出下调,这说明了细胞在翻译水平上积极的响应杀虫晶体蛋白的合成。本研究首次建立了苏云金芽胞杆菌YBT-1520在合成培养基中生长的不同生长期的比较蛋白质组研究。我们发现B,细胞代谢在不同生长期发生了显著的改变,这些改变为杀虫晶体蛋白的大量合成提供了物质和能量基础。同时翻译相关因子的表达变化也说明了研细胞为杀虫晶体蛋白的大量合成进行了翻译水平的调控。这些研究结果给研杀虫晶体蛋白高表达机制提供了新的可操纵和调控的位点,为今后杀虫晶体蛋白的更高量表达和异源蛋白的高表达提供了新的理论基础。
张琼[3]2001年在《苏云金芽胞杆菌蛋白Aii及其对植物病原菌致病性的影响》文中指出本文围绕苏云金芽胞杆菌，从三个方面进行了研究，取得结果如下： 1．苏云金芽胞杆菌自身诱导物抑制蛋白Aii及其对植物病原菌致病性的影响 自身诱导物(autoinducer，以下简称AI)分子是一种广泛存在于革兰氏阴性植物病原菌的细胞间信号分子，与病原菌的致病性有着直接或问接的关系。对AI分子活性具有抑制作用的化学物质或细菌，对病原菌的致病性也将产生影响。 本研究经大量筛选，发现苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌的培养物可抑制酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserine-lactone，简称AHL)类AI分子的活性，其活性物质是一种蛋白质，称之为Aii蛋白。检测蛋白Aii及其编码基因aff在芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌不同亚种中的分布发现，除苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌外，枯草芽胞杆菌和球形芽胞杆菌有较弱的Aii活性。用PCR方法也检测到，在上述四种细菌中存在aii基因。而巨大芽胞杆菌的培养物没有Aii活性，Southern杂交结果表明无aii基因的存在。在苏云金芽胞杆菌不同亚种中均可检测到Aii蛋白活性和aii基因。在Southern杂交的基础上，将检测的43个菌株分组，对其中22个菌株的aii基因进行DNA序列测定，结果表明，不同菌株aii基因的DNA序列同源性为85.4％—100％；而Aii蛋白的氨基酸序列同源性为88.1％—100％。 研究中还发现，苏云金芽胞杆菌Aii蛋白是一种非分泌型蛋白。aii基因位于染色体上，在培养初期开始转录，一直延续到芽胞形成前期。该蛋白不仅可作用于多种提纯的AHL类信号分子，对细菌培养液中的AHL类分子的活性也有抑制作用。以胡萝卜软腐欧文氏菌菌株SCG1为例，当菌株SCG1的细胞浓度OD_(600nm)<0.55时，经苏云金芽胞杆菌菌株4D1培养物处理后感染马铃薯，在24小时内，可完全抑制软腐病斑，但随着培养时间的延长，其抑制作用逐渐减弱。当SCG1的细胞浓度OD_(600nm)>0.55时，4D1培养物不能完全抑制病原菌的致病性。由此推测，苏云金芽胞杆菌影响病原菌致病性的原因在于降低了病原菌细胞内AHL类信号分子的浓度，使其达不到激活毒素基因表达的水平。因此，利用Aii蛋白的活性，构建出转基因抗病植物，或提高苏云金芽胞杆菌发酵液Aii蛋白产量，研制出既杀虫又抗病的制剂，可在植物病虫害的防治上开辟出新的途径。 2．绿色荧光蛋白基因在苏云金芽胞杆菌中的表达 绿色荧光蛋白基因是一种容易检测的报告基因，可用于苏云金芽胞杆菌制剂施用后的环境监测，杀虫机理等方面的研究。 本研究利用苏云金芽胞杆菌cry3A启动子和BtⅠ-BtⅡ启动子，分别与gfp基因构成融合基因，以调控加基因在苏云金芽胞布「菌中的表达。将重组质粒pGI了PExp八(含cI，y了A]，]’(，召加融合基因)和pGFPExpB(含Bll-Blljl，。一肺融合基因)分别分入大肠杆菌和苏云金芽胞杆菌后发现，Btl-Btlj启动子不仅在苏云金芽胞杆菌中可驱动加基因表达出较强的绿色荧光，在大肠杆菌中也具有极强的启动墓因表达的能力。而cry了A启动子不能启动加基因在大肠杆菌中表达，在苏云金芽胞丰「菌中启动加基因表达的荧光强度也较弱。ILT一PCR实验从转录水平揭示了c理3A启动子驱动加基因在芽胞形成前期的转录水平较高，而Bll-Blll启动子驱动动，基因在芽胞形成前期和后期表现出两次转录高峰。而荧光检测结果表明，苏云金芽胞杆菌重组菌株分别在营养生长期和芽胞形成前期表现出较强的绿色荧光，表明脚基因在苏云金芽胞杆菌中的表达，还受其它调控系统或蛋白酶活性的影响。 本研究首次获得了表达GFP蛋白的苏云金芽胞杆菌重组菌株，在国内外文献中尚无报道。3.苏云金芽胞杆菌质粒pBMB9741的研究 苏云金芽胞杆菌含有丰富的质粒。由于检测手段的限制，许多质粒的功能和特性尚不清楚。通过克隆质粒分子，并对其进行DNA序列测定，在此基础上分析和研究其携带的基因，既可了解质粒的功能和特性，又也可为苏云金芽胞杆菌构建工程菌提供合适的载体。 本研究在构建苏云金芽胞杆菌质粒克隆载体pBMBI 105的基础上，克隆了菌株YBT一1 520的质粒，获得6.6kb的DNA片段。对其进行了限制性酶切图谱分析。经DNA全序列测定，发现该片段由6578个碱基组成，G+C百分比为32.4%。通过PCR确定该片段是一个完整的质粒分子，命名为pBMB9741。该质粒的DNA序列已被GenBank不11 Genome收录，序列号分别为AF 202532不11 NC 001272。 序列分析表明，该质粒包含两个开放阅读框架:口lfj(IO44bPs)和。嘴(1212bPs)。经BLAsT搜索，口rfI编码的蛋白质ORFI与许多细菌编码的复制蛋白同源。通过亚克隆和DNA缺失实验，确定orf]包含在与复制功能有关的2.2kb区段内，因此推断ol:fj基因编码的是该质粒的复制蛋白。BLAsT搜索结果表明，0嘴编码的蛋白质与一些细菌的重组蛋白或诱动蛋白同源。 对质粒pBMB9741在苏云金芽胞杆菌野生型菌株，以及不同亚种无质粒突变菌株和蜡状芽胞杆菌中的遗传稳定性进行了检测，发现该质粒在无抗性选择压力下，既使经过200个世代，仍可稳定遗传。表明该质粒经改造后，可用作苏云金芽胞杆菌构建工程菌的载体。
刘兴龙[4]2008年在《对鞘翅目害虫有活性Bt菌株的筛选及cry8Ea2基因的克隆、表达和活性研究》文中研究表明苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前研究最深入的杀虫微生物,其杀虫蛋白基因也是应用最广泛和最有发展潜力的抗虫基因,因此,深入发掘Bt新菌株、分离克隆新型的杀虫基因对害虫的防治具有重要意义。近年来,鞘翅目害虫尤其是金龟甲科害虫的危害日趋严重,由于其幼虫生活在土壤中,给防治带来很大的困难,本研究从山东省土壤中分离Bt菌株,结合本室保存的菌株,利用PCR-RFLP鉴定体系对其进行基因型鉴定,在此基础上分离克隆对金龟甲科害虫有效的新型杀虫蛋白基因,研究该基因的表达和杀虫活性,为构建高效广谱的Bt工程菌和培育转基因抗虫植物提供新型基因资源。本研究的主要内容和结果如下:1本试验从山东省各地采集土样750份,采用芽孢杆菌选择性培养基与晶体染色相结合的方法从中分离出Bt菌57株,Bt菌株的平均分出率为7.60%,这些Bt菌株的晶体形态包括菱形、方形、圆形和不规则形等形状。2利用已设计的保守区通用引物S5un8/S3un8和S5un3/S3un3对本试验分离的和本室保存的菌株进行PCR扩增,对所鉴定的菌株中B-DLL和B-JJX菌株扩增出阳性片段,说明B-DLL和B-JJX菌株中含有cry8类基因,SDS-PAGE分析表明B-DLL和B-JJX菌株的杀虫晶体蛋白主要为130 kD。3杀虫活性测定结果表明菌株B-DLL在浓度为6.0×10~8 cfu/mL时对暗黑鳃金龟和琉璃弧丽金龟一龄幼虫14天的校正死亡率分别为26.67%、33.33%;对柳蓝叶甲96小时的校正死亡率为33.33%;菌株B-JJX在浓度为6.0×10~8 cfu/mL时对柳蓝叶甲96小时的校正死亡率为30.80%,对其它几种试虫没有活性。4以菌株B-DLL质粒为模板,对GenBank中公布的cry8类基因进行分析,设计了一对cry8类特异性引物JJX5和JJX3,PCR扩增出3.5 kb的目的片段,将其克隆到载体pBluescriptSK(+),经测序分析表明,该基因的编码框由3495个碱基组成,编码的蛋白质由1164个氨基酸残基组成。通过比较,该基因编码的氨基酸序列与Cry8Ea1的氨基酸序列同源性最高达99.31%,其中在第452、526、527、537、542、752、907和975位等8个氨基酸不同。该基因的核苷酸序列已经在GenBank登录(Accession number:EU047597),提交国际Bt-δ-内毒素命名委员会并被确认为一个新的杀虫蛋白基因,正式命名为cry8Ea2。5将cry8Ea2基因插入到大肠杆菌表达载体pET-21b(+)中,构建了T7启动子控制的大肠杆菌重组表达质粒pET21b-cry8Ea,再将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达130 kD的蛋白。6 Cry8Ea2表达产物杀虫活性测定结果表明,该蛋白对暗黑鳃金龟、琉璃弧丽金龟和柳蓝叶甲等幼虫具有杀虫活性,在浓度为8.98μg/g土时对暗黑鳃金龟、琉璃弧丽金龟一龄幼虫14天的校正死亡率分别为46.67%、55.56%;在浓度为89.8μg/mL时对柳蓝叶甲三龄幼虫96小时的校正死亡率为33.33%。而对华北大黑鳃金龟、茄二十八星瓢虫、黄粉虫、棉铃虫、甜菜夜蛾、粘虫、粉纹夜蛾等幼虫均未发现有活性。
王奋山[5]2012年在《苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白Cry55Aa和Cry5Ba的毒性区确定与毒力改造》文中研究表明苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一类广泛存在于土壤中的革兰氏阳性细菌,能在形成芽胞的同时大量表达各种晶体蛋白并在胞内累积包装成伴胞晶体。苏云金芽胞杆菌产生的各种晶体蛋白对多种农业害虫有很好的毒杀效果,作为生物杀虫剂在全球广泛的应用于农林业生产,被认为具有潜在的转基因抗虫育种价值。本论文主要开展了苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白结构与功能方面的研究,研究内容主要涉及晶体蛋白杀线虫毒性区的确定、晶体蛋白溶解性和毒力的改造、晶体蛋白结构域中个别氨基酸残基的功能探讨等。同时本论文也包括了我在硕士期间的部分研究内容(见第四章)。本论文的主要研究内容和结果分列如下：1)苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白Cry55Aa毒性区的确定转基因抗虫育种被公认为极具潜力的控制农林害虫的措施。有许多的研究证明,苏云金芽胞杆菌的大部分晶体蛋白存在一个杀虫的毒性区,而不需要全长的蛋白序列,这些研究结果提示转基因抗虫育种研究可以用比全长小很多的毒性区序列。在本研究论文中,生物信息学分析显示晶体蛋白Cry55Aa在NCBI蛋白质数据库中没有与其同源的蛋白序列,表明晶体蛋白Cry55Aa是一个全新的杀线虫晶体蛋白,推测该晶体蛋白可能具有一个全新的杀虫模式,同时其毒性区也无法通过生物信息学分析来进行准确的预测。本研究构建了晶体蛋白Cry55Aa的一系列截短缺失突变体并在大肠杆菌中诱导表达,生物测定的结果显示所有截短的片段都失去了对线虫的毒性作用,其中包括从N端或C端截去30氨基酸残基的缺失蛋白。这一结果说明晶体蛋白Cry55Aa没有一个明显的非毒性区,这与苏云金芽胞杆菌的其他杀虫晶体蛋白有明显的不同。根据这一结果,我们建议转基因抗虫育种研究用全长的Cry55Aa蛋白序列。2)苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白Cry5Ba毒性区的确定研究发现,苏云金芽胞杆菌产生的大分子量(130-140kD)晶体蛋白在靶标害虫肠道中在寄主中肠酶的作用下截去N端的部分序列和整个C半段,形成一个小分子量(60-70kD)的核心活性蛋白。本研究对苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白Cry5Ba的生物信息学分析表明晶体蛋白Cry5Ba也是一个典型的大分子量蛋白,并预测其毒性区间为70-700氨基酸。基于这种预测,本研究通过大片段缺失,构建了晶体蛋白Cry5Ba的一系列缺失突变体,并分别在大肠杆菌和苏云金芽胞杆菌中表达。生物测定的结果表明,从晶体蛋白Cry5Ba的N端截去10个氨基酸残基的缺失突变体的杀线虫活性与全长的Cry5Ba无明显的差异,而截去21个氨基酸残基的缺失体蛋白对线虫的毒性明显的降低。这一结果说明晶体蛋白Cry5Ba的N端部分序列是其杀线虫必需的,这和苏云金芽胞杆菌的其他大分子量晶体蛋白有明显的不同。另外从晶体蛋白Cry5Ba的C端截去550个氨基酸的缺失突变体的杀线虫活性与全长的Cry5Ba没有明显的差异,说明Cry5Ba的C半段是非毒性区,这一点与其他的大分子量晶体蛋白类似。根据这些结果,我们建议在转基因抗虫育种研究中用Cry5Ba的整个N半段序列,即1-715氨基酸残基。3)苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白Cry5Ba的毒力改造苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白Cry5Ba是一个对线虫高毒力的蛋白,但是面临寄主潜在的抗性威胁。本研究通过生物信息学分析、结构域和活性区预测以及蛋白质三维结构模拟,在晶体蛋白Cry5Ba的结构域Ⅱ和结构域Ⅲ中潜在的与毒性相关的氨基酸进行了单个氨基酸的点突变,构建了晶体蛋白Cry5Ba的19个点突变体。生物测定的结果显示,在相同的蛋白浓度和相同的处理时间,突变体蛋白Y393A和N586A比野生型Cry5Ba更严重的抑制了秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的生长,说明这两个突变体蛋白增强了蛋白质的杀线虫活性。统计分析的结果显示突变体蛋白Y393A和N586A对线虫的毒力分别升高了3.72倍和5.58倍。同时晶体溶解性实验结果表明在偏酸性pH值环境下突变体N586A晶体比野生型Cry5Ba晶体的溶解性增强,我们推测这可能有利于突变体蛋白在寄主酸性肠道中的溶解和活化,从而增强了其杀线虫活性。4)穿刺巴斯德杆菌防治植物根结线虫的效果评价穿刺巴斯德杆菌是植物根结线虫的专性寄生细菌,其胞子可以特异性的粘附到敏感寄主线虫的体表,在寄主线虫侵入植物后细菌胞子开始萌发产生芽管,并在寄主线虫体内扩展蔓延,最后在线虫的卵巢内繁殖产生后代胞子,使寄主线虫失去产卵能力。为了评价穿刺巴斯德杆菌防治植物根结线虫的效果,本研究从国外引进了穿刺巴斯德杆菌的胞子,并对其侵染植物根结线虫的方式、部位、防治效果和寄主特异性进行了初步的调查和研究。结果显示在本研究调查的植物根结线虫群体中,大部分(72.08%)的植物根结线虫对引进的穿刺巴斯德杆菌胞子不敏感,25.53%的植物根结线虫对引进的穿刺巴斯德杆菌胞子特别敏感,说明穿刺巴斯德杆菌侵染植物根结线虫具有很强的寄主特异性。同时本研究表明穿刺巴斯德杆菌胞子粘附敏感植物线虫并没有部位选择特异性,在线虫的所有部位都发现有胞子的粘附。
刘廷辉[6]2009年在《苏云金芽胞杆菌菌株Bt11和GS8的研究》文中研究表明苏云金芽胞杆菌(Bt)是目前世界上应用最广的杀虫微生物,苏云金芽胞杆菌的杀虫活性主要取决于其在芽胞形成过程中产生的杀虫晶体蛋白,从Bt菌株中分离克隆杀虫基因,将有效开发利用我国丰富的杀虫基因资源,缩小国内外在Bt杀虫基因基础研究领域中的差距,为工程菌和抗虫转基因植物的构建提供新的基因来源。本论文在系统研究对鳞翅目害虫高毒力Bt菌株Bt11和GS8生物学特性的基础上,围绕cry1Ia、cry1Ib和cry9Ea基因的分离、克隆、表达载体构建、杀虫活性测定以及杀虫机理等方面进行了一系列的研究,主要内容包括:对本实验室分离保存的Bt菌株Bt11和GS8进行了生物学特性研究。Bt11和GS8的生长速率与标准菌株HD-73和4Q7相当,Bt11形成菱形、球形和方形晶体,而GS8则形成菱形、球形和不规则形晶体。SDS-PAGE分析表明,Bt11晶体主要由130kDa、80kDa、35kDa等蛋白组成,菌株GS8晶体主要由130kDa、81kDa、60kDa等蛋白组成。PCR-RFLP基因鉴定结果表明,菌株Bt11中含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ia、cry2Ab和cry9Ea五种基因类型,而菌株GS8中含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ib、cry2Ab和cry9Ba五种基因类型。琼脂糖凝胶电泳分析表明,Bt11菌株含有5种质粒,GS8菌株含有4种质粒。形态学和生理生化反应分析表明,Bt11菌株与库斯塔克亚种(B.t subsp.kurstaki)完全一致,GS8菌株与东北亚种(B.t subsp. tohokuensis)相同。利用全长PCR方法,以Bt11质粒为模板扩增了cry9Ea和cry1Ia全长基因,以GS8质粒为模板扩增了cry1Ib全长基因,完成了DNA序列测定。cry9Ea基因编码区全长为3453bp,与已发表的五种cry9Ea相比序列相似性为99.51%~99.86%,推测分子量为129.874kDa,等电点pI4.68,为弱酸性蛋白;cry1Ia基因编码区全长为2160bp,与已发表的13种cry1Ia相比序列相似性为96.94%~99.91%,推测分子量为81.202kDa,等电点pI5.955,为弱酸性蛋白;cry1Ib基因编码区全长为2160bp,与已发表的2种cry1Ib相比序列相似性为99.54%和99.77%,推测分子量为81.372kDa,等电点pI6.215,为弱酸性蛋白。cry9Ea、cry1Ia和cry1Ib基因序列已在GenBank中登记,Accession number分别为EU887516、EU887515和EU677422,提交国际Bt-δ-内毒素基因命名委员会后,分别被正式命名为cry9Ea6、cry1Ia14和cry1Ib3。分别构建了cry9Ea6、cry1Ia14和cry1Ib3基因的原核表达载体pET-9Ea、pET-1Ia和pET-1Ib,SDS-PAGE和Western blot分析表明,三者均在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达。蛋白可溶性分析表明,三种蛋白主要以包涵体形式存在。生物测定结果显示,Cry9Ea6对粉纹夜蛾和小菜蛾的初孵幼虫具有高毒力(LC_(50)值分别为0.0639μg/mL和4.574μg/mL),Cry1Ia14蛋白对粉纹夜蛾、家蚕和小菜蛾初孵幼虫具有高杀虫活性(LC_(50)值分别为2.0342μg/mL、0.0163μg/mL和0.0261μg/mL),对甜菜夜蛾和棉铃虫初孵幼虫具有较高杀虫活性(LC_(50)值分别为184.7727μg/mL和70.90μg/mL),Cry1Ib3对小菜蛾初孵幼虫具有高毒力(LC_(50)值为0.0763μg/mL)。将cry9Ea6、cry1Ia14和cry1Ib3全长基因分别插入E.coli-Bt穿梭载体pSXY422b,转化大肠杆菌SCS110和Bt无晶体突变株HD73(cry-),经抗性筛选、DNA酶切分析和PCR检测,证实获得了重组表达载体pSXY-9EA、pSXY-1IA和pSXY-1IB。SDS-PAGE分析表明,cry9Ea6基因在受体菌HD73(cry-)中能正常表达130kDa蛋白,而cry1Ia14和cry1Ib3基因在受体菌HD73(cry-)中未检测到表达蛋白。利用等电点法提取晶体蛋白,生测结果表明,Cry9Ea6对粉纹夜蛾和小菜蛾的LC_(50)值分别为0.0532μg/mL和1.2259μg/mL,高于E.coli中表达融合蛋白的生测结果(LC_(50)值为0.0639μg/mL和4.574μg/mL)。将cry1Ia14克隆于表达载体pQE30,在大肠杆菌M15中获得了高效表达,蛋白可溶性分析表明,Cry1Ia14蛋白主要以包涵体形式存在,通过亲和层析方法纯化了Cry1Ia14蛋白;提取并纯化了Cry9Ea6晶体蛋白,免疫家兔制备了Cry1Ia和Cry9Ea蛋白的多克隆抗体,经分析两抗体的最佳效价为1:10,000。经Trypsin消化的Cry9Ea6和Cry1Ia14对粉纹夜蛾初孵幼虫进行生物活性测定,结果发现Trypsin消化后的Cry9Ea6是原毒素杀虫活性的5倍左右,Trypsin消化后的Cry1Ia14是原蛋白杀虫活性的3倍左右。因此,推测消化后的65kDa和50kDa多肽是Cry9Ea6的活性毒素,38kDa是Cry1Ia14的活性多肽。Cry9Ea6和Cry1Ia14蛋白体内和体外分别处理围食膜,结果表明,Cry9Ea6蛋白能够降解粉纹夜蛾围食膜上44kDa和30kDa左右的蛋白,破坏了粉纹夜蛾围食膜结构的完整性,对甜菜夜蛾围食膜蛋白结构无明显的影响;Cry1Ia14蛋白对粉纹夜蛾围食膜和甜菜夜蛾围食膜结构的完整性均有一定破坏作用。以Cry9Ea6蛋白(5μg/头)饲喂粉纹夜蛾五龄幼虫,于6hr后围食膜降解,中肠结构变得不完整;而Cry9Ea6蛋白(5μg/头)饲喂甜菜夜蛾五龄幼虫,12hr后围食膜依然可见,中肠壁略变薄,无太大变化。以Cry1Ia14蛋白(5μg/头)饲喂粉纹夜蛾五龄幼虫,于6hr后围食膜降解,中肠结构变得不完整; Cry1Ia14蛋白饲喂甜菜夜蛾12hr后,围食膜降解,食物与中肠界线不清,中肠结构不完整。根据Mg/EGTA方法,利用差速离心成功分离了甜菜夜蛾和粉纹夜蛾中肠BBMV,CHAPS可以增加BBMV的溶解。经Western blot分析,发现Cry9Ea6和Cry1Ia14的活性多肽均不同程度地结合到了甜菜夜蛾和粉纹夜蛾中肠BBMV上。这些结果为进一步研究Cry蛋白的杀虫机理奠定了基础。
李林[7]1999年在《苏云金芽胞杆菌高频转化系统的建立及其性能》文中研究说明本研究通过筛选苏云金芽胞杆菌受体菌和对受体菌电脉冲转化条件的研究，建立了一种苏云金芽胞杆菌的高频转化系统。分别用溴化乙锭诱变处理、逐级升温培养以及用SDS处理等三种方法对苏云金芽胞杆菌无晶体(Cry~-)和无质粒突变株进行了筛选研究。用限量培养基和42℃培养9株野生菌株，结果筛选到9株Cry~-突变株；继续升温至44℃来培养其中的三个Cry~-突变株，得到内生质粒被进一步消除的突变株。然后进一步升温至46℃来培养突变株BMB170，并用SDS处理，最终筛选到1株无内生质粒的突变株BMB171。对出发菌株YBT-1463和其无质粒突变株BMB171的部分形态、生理生化和遗传学特性进行的比较研究的结果表明，突变株BMB171不形成伴胞晶体，但在个体形态与菌落特征、对红霉素等10种抗生素的敏感性、对葡萄糖等19种碳源和谷氨酸等12种氮源的利用能力及生长性能与出发菌株YBT-1463无明显差异。用pHT3101等5种供体质粒电转化BMB171的效率比电转化YBT-1463的效率显著提高，而转化导入的3种外源质粒在BMB171中的稳定性也明显高于出发菌株YBT-1463。 对用电脉冲法转化苏云金芽胞杆菌受体菌BMB171优化条件的研究结果表明，采用SG溶液作电脉冲缓冲液，用10.0 kV／cm的脉冲场强和1次电脉冲(4.6ms)，以及采用对数前期(OD_(650)约0.2～0.3)收获的受体菌，可以达到最高转化频率。转化频率随质粒pHT3101浓度的增加，在54.69pg／mL至3.50μg／mL范围内呈线性增加，随后达到饱和。 通过将苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Aal、cry1Ac10和cry1Ca转移至不同质粒载体上，分别构建了重组质粒pBMB121L、pBMB9821L和pBMB986L，并分别导入无质粒突变株BMB171，筛选得到携带相应ICPs基因的重组菌株。 研究了苏云金芽胞杆菌Cry~-突变株和无质粒突变株BMB171的转化性能和表达性能。用pHT3101、pBMB3305、pBMB1736、pBMB671、pBTL-1和pHV1249等6种外源质粒电转化无质粒突变株BMB171的转化频率，分别是Bt-4Q7、Bt-4D10和Bti．IPS．78／11等3种常用受体菌相应最高转化频率的2~3500倍。无质粒突变株BMB171表达cry1Ac基因的表达量高于Bt-407，略低于Bt-4D10和Bti．IPS．78／11，而表达cry1Ca和cry3Aa的表达量高于这3种对照受体菌。对小菜蛾3龄幼虫和甜菜夜蛾初孵幼虫的毒力测定结果表明，BMB171表达cry1Ac基因的杀虫毒力高于Bt-4Q7和Bt-4D10，略低于Bti．IPS．78／11；而BMB171表达cry1Ca基因的毒力高于这3种受体菌。 对转座子mini-Yn10在苏云金芽胞杆菌野生菌株YBT-1463及其无质粒突变株BMB171中的转座作用进行了初步研究。
张彦蕊[8]2012年在《苏云金芽胞杆菌HBF-18菌株毒力相关基因的克隆与活性研究》文中研究表明蛴螬是金龟子幼虫的总称，是地下害虫中最大类群，也是危害最大、造成损失最严重的种类。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是目前研究最多、应用最广的昆虫病原微生物。由河北农林科学院植保所分离的HBF-18菌株对大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）与暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）有较好杀虫活性，本实验室从中克隆了对暗黑鳃金龟与大黑鳃金龟都有活性的cry8Ga1基因。然而，cry8Ga1基因的表达产物杀虫活性与出发菌株（HBF-18）相比，有较大的差别，对大黑鳃金龟、暗鳃金龟的活性比出发菌株分别降低50倍与70倍。在本实验室克隆的其他对蛴螬有活性的cry8类基因则没有这种现象。由此推测HBF-18菌株中除了含有cry8Ga1基因外，还可能含有其他新的杀虫基因。但是通过传统的鉴定方法我们没有鉴定出来新的杀虫基因，本研究在菌株基因组测序的基础上，对HBF-18菌株中可能含有的新的杀虫基因进行发掘，克隆了3个新的基因，并对其表达产物进行了生物活性的测定和增效研究，具体进展如下：本研究在前期基因组测序的基础上，利用生物信息学分析，发现了三种新的杀虫基因。从HBF-18菌株中分别克隆了cry8-like、vip1、vip2基因。其中cry8-like基因长度2214bp，具有完整的阅读框架，编码738个氨基酸，与Cry8Db氨基酸序列相似性最高，达到51%，包含了完整的Cry毒素活性区所必需的三个结构域；在cry8-like基因上游存在SigA、SigD、SigE转录因子的结合位点及RBS序列，在其下游存在两个反向重复序列。该基因是一个完整的、不同于一般3.5kb的Bt cry8类基因。vip1全长基因2634bp，编码878个氨基酸，推导分子量为98.1kD，与Vip1Ba氨基酸序列相似性最高，达到76%，Vip1蛋白N端1-31位氨基酸为信号肽序列。vip2全长基因1386bp，编码462个氨基酸，推导分子量为52.6kD，与Vip2Ac氨基酸序列相似性最高，达到88%，Vip2蛋白N端1-30位氨基酸是其信号肽序列。vip2基因位于vip1基因上游，二者ORF间仅相差7个碱基；在vip2基因上游存在SigB、SigG转录因子结合位点，在vip1下游存在一个反向重复序列。反转录PCR结果显示上述基因在原始菌株HBF-18中能够正常转录。在大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株中成功表达了vip1、vip2、cry8-like基因，SDS-PAGE分析结果显示vip1基因表达约98kDa的蛋白，vip2基因表达约52kDa的蛋白，cry8-like基因表达约75kDa的蛋白。为了在Bt中表达cry8-like基因，本研究利用重叠PCR技术在cry8-like基因末尾加上了一段cry8Ea基因的3′末端序列，使其成为3528bp的杂合基因cry8X。将vip1、vip2、cry8X基因分别转化Bt无晶体突变株HD73-中，成功表达了三种蛋白，Vip1蛋白约80kD，Vip2蛋白约40kD，Cry8X蛋白约133kD。将构建的含有vip1、vip2、cry8X基因的Bt工程菌分别命名为HDVIP1、HDVIP2、HD8X；电镜观察结果表明HD8X可以形成球形晶体。分别测定了HD8X、HD8G、HD8X+HD8G、HDVIP1+HDVIP2、HDVIP1+HDVIP2+HD8G等菌株或菌株组合对暗黑鳃金龟幼虫的杀虫活性。结果表明，HDVIP1+HDVIP2及HD8X菌株对暗黑鳃金龟幼虫有杀虫活性，其LC50分别为3.51×1011和6.66×1011CFU/g土壤，二者杀虫活性都比HD8G及HBF-18低。HDVIP1+HDVIP2+HD8G菌株组合预期LC50与实测LC50的比值为4.15，具有协同增效作用，HD8X+HD8组合预期LC50与实测LC50的比值为1.86，属于相加作用。对不同的菌株和组合进行差异显著性检验，结果显示HDVIP1+HDVIP2+HD8G菌株组合对暗黑鳃金龟幼虫杀虫活性与HBF-18相比差异不显著。因此，HBF-18菌株杀虫活性比HD8G高的原因是该菌株中vip1、vip2、cry8X这些基因表达产物提高了Cry8Ga的杀虫活性。此外，Cry8X蛋白对铜绿丽金龟具有较好的杀虫活性，对小菜蛾没有杀虫活性。综上所述，本研究鉴定和克隆了三个新的杀虫基因vip1、vip2和cry8X，并揭示了只含有cry8Ga基因的表达菌株HD8G和原始菌株HBF-18之间杀虫活性有显著差异的原因。本研究为蛴螬的生物防治提供了新的基因来源。
周学永[9]2004年在《苏云金芽胞杆菌喷雾干燥工艺和杀虫蛋白纳米材料吸附剂型的研究》文中进行了进一步梳理系统研究了喷雾干燥塔进风口温度、出风口温度和喷头压力对苏云金芽胞杆菌芽胞和伴胞晶体含量的影响。芽胞和伴胞晶体含量均随干燥温度升高而降低，但二者对温度的敏感程度不同，进风口温度引起芽胞和晶体失活的拟Z值参数分别为250℃和740℃；出风口温度引起芽胞和晶体失活的拟Z值参数分别为72.7℃和270℃。根据出风口温度计算的结果，芽胞热失活活化能为112.24 kJ·mol~(-1)，晶体热失活活化能为123.88 kJ·mol~(-1)。喷头压力在0.10～0.25 MPa之间变化时，对芽胞和晶体含量的影响不显著，填料对芽胞和晶体具有一定的热保护作用。 通过正交试验确定了苏云金芽胞杆菌发酵液喷雾干燥过程中影响原粉收率、含水量、晶体蛋白含量、芽胞数和杀虫致死率的主要因素。方差分析表明，对产品收率的影响顺序为：喷头压力＞进风口温度＞进料速度；对含水量、晶体蛋白含量、芽胞数和杀虫致死率的影响顺序为：进风口温度＞进料速度＞喷头压力。建立了描述喷雾干燥工艺参数与产率、含水量、晶体蛋白含量、芽胞数和杀虫致死率之间关系的数学模型，该模型可以直观地发映出工艺操作参数对上述指标的影响趋势，调整这些工艺参数就可以达到控制产品性能的目的。根据数学模型确定的最佳操作条件为：进风口温度180℃，进料速度60 ml min~(-1)，喷头压力0.1 MPa。验证试验证实，所建立的数学模型具有可靠性。相关研究国内外未见公开报道。 研究了离心和微滤浓缩处理对苏云金芽胞杆菌发酵液芽胞数、晶体含量、效价和流变特性的影响。经离心和微滤浓缩处理后，发酵液密度、粘度和含固量增加，芽胞数、晶体含量和效价提高，但效价收率一般随浓缩倍数的增加而降低。上清液或浓缩上清液补加到浓缩发酵液中可以提高效价收率，就浓缩方法而言，微滤浓缩比离心浓缩更能保持浓缩发酵液的杀虫活性。浓缩发酵液喷雾干燥后，原粉的效价、晶体含量和芽胞数提高，但浓缩倍数超过2.5倍时，效价收率随浓缩倍数的增加而降低。发酵液加填料直接喷雾干燥可以保持较高的效价收率，是最大程度回收杀虫活性成分的有效办法。 苏云金芽胞杆菌发酵液中添加0.5％～1.0％(w／v)的适宜填料可以提高喷雾干燥产率，但当填料用量达到3％以上时，产品收率一般呈下降趋势。相关性分析表明，填料的松密度和振实密度与喷雾干燥产率呈高度负相关关系，即密度越大，产率越低；对同一种填料而言，颗粒越细，产率越高。填料的休止角与喷雾干燥产率低度相关。上述规律的发现对专业工厂筛选高效填料具有指导意义。 国内率先研究了68 kDa和130 kDa杀虫蛋白在纳米级土壤和矿物胶体上的吸附特性、解吸特性和杀虫活性。供试胶体在pH 9.0碳酸盐缓冲体系对苏云金芽胞杆菌68 kDa和130 kDa杀虫蛋白的等温吸附曲线均符合langmuir方程(R~2＞0.97)，对68扔a杀虫蛋白饱和吸附量的高低顺序依次为:蒙脱土>红壤胶体>针铁矿>高岭土>氧化锌>氧化硅;对130 kDa杀虫蛋白饱和吸附量的高低顺序依次为:蒙脱土>氧化锌>红壤胶体>氧化硅>高岭土>针铁矿。供试胶体在磷酸盐体系pH6一7的吸附量最高，在碳酸盐体系的吸附量随pH值升高而降低。与碳酸盐相比，磷酸盐具有抑制针铁矿、蒙脱土、氧化锌和红壤胶体吸附杀虫蛋白的作用。 杀虫蛋白很容易被供试胶体吸附，0.5一3h就能达到或接近最饱和吸附量。随着杀虫蛋白与胶体质量比例增加，胶体对杀虫蛋白的吸附量增加，而吸附百分率降低。1。一50℃内，温度对供试胶体吸附杀虫蛋白的影响不大。透射电镜分析表明，本研究所使用的土壤矿物胶体水中分散粒径在100 nm以下，吸附杀虫蛋白后粒径没有明显变化，仍属于纳米颗粒范畴。X-射线衍射分析显示，蒙脱土吸附杀虫蛋白后没有引起片层间距扩张。红外光谱分析证实，吸附的杀虫蛋白己结合在胶体上。 纯化毒素与供试胶体吸附的毒素对棉铃虫幼虫均具有杀虫活性，且后者的LC50低于前者。紫外光降解试验表明，蒙脱土和红壤胶体具有减轻紫外光对杀虫蛋白的降解作用，氧化锌和高岭土则起加速降解的作用。胶体一杀虫蛋白复合物冷冻干燥和喷雾干燥后，杀虫活性有较大程度下降。 被蒙脱土、红壤胶体、氧化硅、氧化锌、针铁矿和高岭土吸附的68 kDa杀虫蛋白经去离子水三次洗涤后，总解吸率分别为28.55%、32.38%、40.54%、24.66%、24.72%和31.10%;pHg碳酸盐缓冲液三次洗涤后的总解吸率相应为21.69%、18·43%·38·81%、15.37%、16.34%和24.64%，解吸能力低于去离子水。被上述胶体吸附的130 kDa杀虫蛋白去离子水三次解吸率为17.79卜64.90%，pHg碳酸盐缓冲液三次解吸率为16.61卜59.05%。
孙凯[10]2013年在《苏云金芽胞杆菌vip3Aa与cry1Ac融合基因的构建、表达与活性分析》文中认为微生物农药由于具有广泛的生产原料，防治对象不易产生抗药性，对环境友好等特点而逐步成为生物防治的支柱产业。其中苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis, Bt)是目前研究最多、应用最广泛的昆虫病原微生物。杀虫晶体蛋白(ICPs)和营养期杀虫蛋白(VIPs)是Bt的主要杀虫活性物质。Cry1Ac蛋白是苏云金芽胞杆菌在生长至稳定期时形成的伴胞晶体蛋白，对鳞翅目昆虫具有较高的杀虫活性。营养期杀虫蛋白Vip3Aa是Bt营养生长时期产生并分泌到细胞外的具有广谱杀虫活性的蛋白，Vip3Aa与Cry1Ac晶体蛋白没有序列同源性，作用机制不同，二者结合使用可以作为一种新型毒素应用于害虫防治。通过组建融合基因，一次发酵即可生产两种蛋白，缩减生产成本，改善Vip3Aa类蛋白分泌到细胞外给生产应用带来的不便，同时可以扩大Bt的杀虫谱、增强毒性，有效抑制害虫抗药性的产生。本研究通过重叠PCR构建了含有Vip3Aa11-GFP、Vip3Aa11-Linker16-GFP融合基因表达载体的Bt工程菌HD8E-VG和HD8E-VLG以确定连接肽(Linker)的作用，结果显示两种融合蛋白均能观察到荧光。从荧光强度来看，单独表达GFP蛋白的阳性对照菌株HD8E-GFP荧光比HD8E-VG和HD8E-VLG要强，而HD8E-VG和HD8E-VLG相比荧光强度并无明显区别。Linker的添加与否对Vip3Aa11与GFP融合蛋白的发光未显示出影响。为减少苏云金芽胞杆菌在产生融合蛋白时的能量消耗，以期提高杀虫蛋白产量，将Cry1Ac的N端杀虫活性区域单独表达来检测其杀虫活性并对其溶解性进行分析。结果显示，Cry1Ac N-terminal蛋白在Bt中高效表达，加入还原剂可以提高Cry1Ac N-terminal蛋白的溶解性，但生测结果表明其杀虫活性较全长Cry1Ac蛋白有所下降。本研究利用cry8E启动子指导的、能在Bt菌中高效表达的穿梭载体pHT315-8E21b，构建了vip3Aa11与cry1Ac全长基因的融合表达载体。为了保证Vip3A蛋白与Cry1Ac蛋白融合后的杀虫活性，构建了含有不同长度连接肽以及不同基因融合顺序的表达载体。SDS-PAGE和Western杂交分析显示出融合蛋白均成功表达。生测结果显示融合蛋白均表现出了较好的杀虫活性，Vip3A-Cry1Ac融合蛋白对小菜蛾的杀虫毒力是毒性较好的Cry1Ac蛋白的3.1倍，Cry1Ac-Vip3A的杀虫毒力与Cry1Ac相当。在对甜菜夜蛾的生测实验中，Cry1Ac-Vip3A融合蛋白对甜菜夜蛾的杀虫毒力是毒性较好的Vip3Aa11蛋白的2.5倍，Vip3A-Cry1Ac融合蛋白对甜菜夜蛾的杀虫毒力与Vip3Aa11相当。本研究首次将Cry1Ac蛋白与Vip3Aa11蛋白在Bt中融合表达，减少了一次性发酵成本，增强了Bt杀虫活性。初步探索了连接肽在构建融合基因时的作用，为融合蛋白的研究以及拓宽Bt杀虫谱和延缓害虫抗性提供了基础，为转基因植物提供了有价值的材料。
参考文献：
[1]. 苏云金芽胞杆菌新基因的克隆及杀虫蛋白生物活性的研究[D]. 冯学. 东北农业大学. 2007
[2]. 比较蛋白质组学揭示苏云金芽胞杆菌YBT-1520不同生长期代谢变化与杀虫晶体蛋白合成的翻译调控间关系[D]. 龚钰华. 华中农业大学. 2011
[3]. 苏云金芽胞杆菌蛋白Aii及其对植物病原菌致病性的影响[D]. 张琼. 华中农业大学. 2001
[4]. 对鞘翅目害虫有活性Bt菌株的筛选及cry8Ea2基因的克隆、表达和活性研究[D]. 刘兴龙. 河北农业大学. 2008
[5]. 苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白Cry55Aa和Cry5Ba的毒性区确定与毒力改造[D]. 王奋山. 华中农业大学. 2012
[6]. 苏云金芽胞杆菌菌株Bt11和GS8的研究[D]. 刘廷辉. 河北农业大学. 2009
[7]. 苏云金芽胞杆菌高频转化系统的建立及其性能[D]. 李林. 华中农业大学. 1999
[8]. 苏云金芽胞杆菌HBF-18菌株毒力相关基因的克隆与活性研究[D]. 张彦蕊. 中国农业科学院. 2012
[9]. 苏云金芽胞杆菌喷雾干燥工艺和杀虫蛋白纳米材料吸附剂型的研究[D]. 周学永. 华中农业大学. 2004
[10]. 苏云金芽胞杆菌vip3Aa与cry1Ac融合基因的构建、表达与活性分析[D]. 孙凯. 吉林大学. 2013