赵海霞[1]2004年在《植酸酶phyA基因活性中心密码子的改造及基因工程菌培养条件的研究》文中提出采用PCR技术对来源于黑曲霉N25植酸酶phyA基因表达片段进行定点突变，在不改变其所编码氨基酸的情况下，选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因最保守序列中81位和85位的Arg密码子进行同义突变，将突变基因克隆到puc18载体中，经序列测定确认后进一步构建了突变基因phyA~m的酵母表达载体pPIC9k—phyA~m，同时以未突变phyA基因的酵母表达载体pPIC9k-phyA作为对照，在同等条件下电击转化毕赤酵母，经诱导培养和产物的酶活测定，筛选出突变与未突变高酶活酵母转化子各2株。对这4株酵母转化子进行Southern blotting分析，结果表明phyA基因以单交换方式单拷贝整合到了酵母染色体DNA中；表达产物的SDS-PAGE分析表明，重组酵母中的植酸酶能有效分泌和表达，酶蛋白分子大小为70.15KD。酶活测定结果表明，经密码子优化的突变重组酵母酶活力明显高于未进行优化的重组酵母转化子，经密码子优化的突变重组酵母株pp-NP~m-8于麦芽汁培养基中诱导36h后酶活力可达47600U／ml，其活力比未优化重组酵母株PP-NP-2(23667 u／ml)提高了约1倍，比本课题组报道的PP-NP-5(22598 u／ml)提高了约1.1倍，连续传10代培养实验证实，该转化子具有良好的遗传稳定性。 对突变植酸酶基因工程菌PP-NP~m-8的培养条件进行了研究，确定了其最佳培养条件：将种龄为16h的工程菌液体种子，以3％接种量接种pH4.5的麦芽汁生长培养基中培养18h后换为pH值为5.0、甲醇终浓度为4％的麦芽汁高温浸提液诱导培养36h后该菌株产酶量可达85067U／ml，比未优化培养条件时提高了近一倍，比姚斌等报道的用BMGY／BMMY培养工程菌获得的15656u／ml提高了4.4倍。同时对突变株PP-NP~m-8与未突变株PP-NP-5用麦芽汁培养基培养时的培养基成本加以比较，PP-NP-5菌株的培养基成本与酶产量比价为0.0303元／100000U，突变株PP-NP~m-8培养基成本与酶产量比价为0.009元／100000U，与PP-NP-5菌株比较，使培养基成本降低了3.35倍，更比用BMGY／BMMY(培养基成本与酶产量比价为1.97104元／100000U)培养基成本降低了218倍，显着降低了生产成本，为基因工程菌的产业化生产奠定了基础。
陈惠[2]2004年在《基因突变技术提高phyA植酸酶在毕赤酵母中表达量及热稳定性的研究》文中提出植酸酶作为单胃动物的饲料添加剂,其使用效果已在世界范围内得到了确证。但是,目前植酸酶在饲料中的推广和应用还相当有限,主要原因在于:(1)植酸酶基因工程菌的产酶量有待进一步提高;(2)植酸酶的热稳定性欠佳不能完全满足饲料加工、贮藏的要求。目前,蛋白质工程技术已成为修饰和改造天然酶的有效手段,为植酸酶产量的提高和热稳定性的改善开辟了新的途径。本研究在对本课题组已注册的植酸酶phyA基因核苷酸序列及氨基酸序列分析的基础上,通过对phyA基因进行同义突变、定点突变以及结构延伸突变,获得在毕赤酵母中高效表达并且热稳定性良好的植酸酶,其结果主要如下: 1、对来源于本课题组自主分离的黑曲霉N25(Aspergillus niger China Strain)的植酸酶基因phyA(GenBank:基因注册号为AF218813,蛋白质序列号为AAF25481)进行PCR介导的定点突变。在不改变其所编码氨基酸条件下,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因保守序列中第81位和第85位的Arg密码子进行同义突变,构建了含正确突变的酵母表达载体pPIC9k-phyA~m。电击转化毕赤酵母GS115,经筛选培养基MM、MD平板筛选和产物的酶活性测定,筛选出突变的高酶活酵母转化子2株。这2株转化子的Southern blotting结果显示突变基因phyA~m以单交换方式单拷贝整合到酵母染色体DNA中;表达产物的SDS-PAGE分析表明,重组酵母中的植酸酶能有效分泌和表达,其酶蛋白分子大小为70.15kD;转化子酶活测定结果可知,经密码子优化的突变重组酵母的酶活力明显高于未进行优化的重组酵母转化子。密码子优化后的突变重组酵母株PP-NP~m-8于麦芽汁培养基中诱导36h后,酶活力可达47600 U·ml~(-1),比未优化重组酵母株PP-NP-2(23667 U·ml~(-1))提高了1.01倍,经十代传代实验汪实重组转化子遗传稳定性良好。 2、采用反向长距离PCR技术对上述重组酵母PP-NP~m-8的植酸酶突变基因phyA~m进行PCR介导的定点突变,即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y),将其354,358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(1354M,L358F),得到了两个突变体PP-NP~(m-1)(F43Y)及PP-NP~(m-2)(I354M,L358F)。含突变基因的重组表达载体pPIC9k-phyA~(m-1),pPIC9k-phyA~(m-2)在毕赤酵母GS115中表达,对表达产物
李春梅[3]2011年在《定点突变技术提高黑曲霉N25植酸酶热稳定性的研究》文中研究说明植酸酶是一种重要的工业用酶,被广泛的用作单胃动物的饲料添加剂,它的饲喂效果已在世界范围内得到了确证。但目前热稳定性差及酶活力低是植酸酶在生产应用中的一个瓶颈,因此通过蛋白质工程技术对植酸酶基因进行改造具有重要的科研和实用价值。本研究采用反向长距离PCR技术对来源于黑曲霉N25的植酸酶phyAm基因进行定点突变,即将植酸酶44位的异亮氨酸(ATC)替换为谷氨酸(GAA) (I44E),将252位的苏氨酸(ACC)替换为精氨酸(AGA) (T252R), I44E、T252R密码子替换均选用毕赤酵母偏爱密码子,并构建了叁个重组质粒pPIC9k-phyA44、pPIC9k-phyA252及pPIC9k-phyA44-252。将重组质粒线性化后电击转化巴斯德毕赤酵母,经筛选获得了突变植酸酶毕赤酵母基因工程菌株PP-NPm-44、PP-NPm-252及PP-NPm-44-252。将未突变和突变植酸酶毕赤酵母基因工程菌株经BMGY/BMMY诱导培养,并对表达产物进行了分离纯化及酶学性质研究。结果表明：(1)表达产物的SDS-PAGE分析表明,突变和未突变植酸酶的大小一致,均为70.15kD。(2)突变前后植酸酶的最适反应温度和最适反应pH未发生变化,分别为55℃和pH5.0。(3)突变体PP-NPm-44、PP-NPm-252及PP-NPm-44-252经BMGY/BMMY诱导培养4d,其酶活力分别达到70293 U/mL、72647 U/mL和81227 U/mL,分别是出发菌株PP-NPm-8(63667 U/mL)的1.1、1.14和1.28倍,比活力分别是出发菌株的1.09、1.04和1.27倍。(4)热稳定性研究结果表明：叁个突变体的热稳定性均有所提高,且突变体PP-NPm-44-252具有最好的热稳定性,分别在80℃和90℃处理10min后,突变植酸酶的剩余酶活力比未突变植酸酶提高了约36%和47%,酶蛋白解链温度提高了1.2℃。(5)金属离子对酶活力的影响研究表明：Cu2+、Zn2+、Ag+、SDS有一定的抑制作用,尤其是Cu2+可使酶活力降至46.24%;Mg2+、Mn2+、Co2+对植酸酶有明显的激活作用,而大多数金属离子对植酸酶活力影响不大。本研究通过定点突变技术,获得了在毕赤酵母中高效表达且热稳定性良好的植酸酶基因工程菌株,并通过对突变前后植酸酶结构预测分析探讨了植酸酶结构与功能关系,为进一步改造植酸酶基因和植酸酶基因工程菌投入生产奠定坚实基础。
廖燕[4]2012年在《定向进化技术提高重组突变黑曲霉N25植酸酶酶活及热稳定性的研究》文中提出植酸酶作为一种饲料添加剂可以提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染。利用蛋白质工程手段改造植酸酶分子是获得有实用价值植酸酶的有效手段。本研究采用易错PCR技术和DNA改组技术对黑曲霉N25的毕赤酵母基因工程菌PP-NPep-6A中植酸酶phyA6A基因进行改造。通过一轮易错PCR改造,96孔板高通量筛选后,获得了一株有较高活性和高热稳定性的产植酸酶突变基因工程菌PP-NPep-11C。Southern印迹结果表明,突变的植酸酶phyA11C基因以单拷贝方式整合进毕赤酵母染色体中。利用硫酸铵分级沉淀、DEAE-阴离子交换柱层析及葡聚糖G-100凝胶层析对突变酶进行纯化,表达产物的SDS-PAGE分析表明,突变体和PP-NPep-6A大小一致,均为70.15kDa。酶学性质研究表明：与出发菌株PP-NPep-6A所产植酸酶相比,其最适反应温度61℃,提高了1℃；最适反应pH未发生变化,为5.5；在70℃,80℃,90℃水浴处理10min,热稳定性分别提高20%,26%,19%;70℃条件下半衰期为9mmin,延长了3min；比活力提高58%,km降低44%,催化效率提高78%。测序结果显示,突变植酸酶phyA11c基因序列有12个碱基发生了突变,引起3个氨基酸位点发生改变,分别是195位的苏氨酸(Thr)突变为亮氨酸(Leu),368位谷氨酰胺(Gln)突变为谷氨酸(Glu),376位苯丙氨酸(Phe)突变为酪氨酸(Tyr)。本研究继续以PP-NPep-1lC中phyA11C基因并结合实验室前期构建的突变菌株PP-NPep-6A、PP-NPm-8, PP-NPm-44-252的植酸酶基因作为模板,采用DNA改组技术对突变植酸酶基因继续进行改造,经高通量筛选后获得了叁株具有有益突变的产植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-NPds-8F、PP-NPds-12D、PP-NPds-12G。Southern印迹结果表明,叁种突变的植酸酶基因(phyA8F、phyA12D、phyA12G)均以单拷贝方式整合进毕赤酵母染色体中。利用硫酸铵分级沉淀、DEAE-阴离子交换柱层析及葡聚糖G—100凝胶层析对叁种突变酶进行纯化,表达产物的SDS-PAGE分析表明,叁种突变体和PP-NPep-6A大小一致,均为70.15kDa。酶学性质研究表明：与出发菌株PP-NPep-6A所产植酸酶相比,(1)PP-NPds-8F、PP-NPds-12G的最适反应温度未发生变化,为60℃;PP-NPds-12D的最适反应温度为61。C,提高了1℃；(2)叁种突变酶的最适反应pH均未发生变化,为5.5；(3)PP-NPds-8F在70℃,80℃,90℃水浴处理10min,热稳定性分别提高15%,23%,13%,70℃条件下半衰期为7.9min,延长了1.9min；PP-NPds-12D在70℃,80℃,90。C水浴处理10mmin,热稳定性分别提高35%,40%,31%,70℃条件下半衰期为12.8min,延长了6.8mmin；PP-NPds-12G在70℃,80℃,90-C水浴处理10mmin,热稳定性分别提高17%,21%,15%,70。C条件下半衰期为8.4min,延长了2.4mmin；(3)PP-NPds-8F比活力提高54%,Km降低35%,催化效率提高60%；PP-NPds-12D比活力提高44%,Km降低21%,催化效率提高26%；PP-NPds-12G比活力提高66%,Km降低61%,催化效率提高97%；(4)测序结果显示,突变植酸酶phyA8F序列有5个碱基发生了突变,引起1个氨基酸位点发生改变,即172位的谷氨酰胺(Gln)突变为精氨酸(Arg)；突变植酸酶phyA12D序列有8个碱基发生突变,引起2个氨基酸位点发生改变,即172位的谷氨酰胺(G1n)突变为精氨酸(Arg),432位的赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)；突变植酸酶phyA12G序列有10个碱基发生了突变,引起2个氨基酸位点发生改变,即368位的谷氨酰胺(Gln)突变为谷氨酸(Glu),432位的赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)。为研究突变菌株中突变位点对植酸酶酶学性质的影响以及确定是否可以将通过定向进化产生的单个突变逐个添加到目标酶基因中以获得热稳定性或者催化效率均有所提高的更优突变体,以出发菌株PP-NPeP-6A中phyA6A基因为模板,利用定点突变技术构建叁种突变体PP-NPsm-M4(Q172R/K432R/Q368E)、PP-NPsm-M5(Q172R/K432R/Q368E/F376Y)、PP-NPsm-M6(Q172R/K432R/Q368E/F376Y/T195L)。利用硫酸铵分级沉淀、DEAE-阴离子交换柱层析及葡聚糖G-100凝胶层析对叁种突变酶进行纯化,表达产物的SDS-PAGE分析表明,叁种突变体和PP-NPep-6A大小一致,均为70.15kDa。酶学性质研究表明：(1)叁种植酸酶的最适反应温度均为60℃和最适反应pH为5.5,未发生变化；(2)PP-NPsm-M4在70℃,80℃,90℃水浴处理10min,热稳定性分别提高20%,25%,18%,70℃条件下半衰期8.8mmin,延长了2.8min;PP-NPsm-M5在70℃,80℃,90℃水浴处理10mmin,热稳定性分别提高22%,29%,21%,70℃条件下半衰期10mmin,延长了4min；PP-NPsm-M6的热稳定性无明显变化,70℃条件下半衰期5.8min；(3)PP-NPsm-M4植酸酶的比活力提高54%,Km降低30%,催化效率提高23%；PP-NPsm-M5植酸酶的比活力提高62%,Km降低25%,催化效率提高71%；PP-NPsm-M6植酸酶的比活力降低5.5%,Km增加11%,催化效率降低20%。通过以上研究,获得了在毕赤酵母中高效表达并且热稳定性、催化效率均有所改善的植酸酶。通过探讨植酸酶结构与功能关系以及突变位点对植酸酶功能的协同效应,为应用蛋白质工程技术改变植酸酶的理化性质提供实验依据,同时也为植酸酶基因工程菌投入生产奠定坚实基础。
彭远义[5]2004年在《植酸酶产生菌的选育及高表达工程菌的构建研究》文中进行了进一步梳理植酸酶是一类能催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的酶，它具有解除植物性饲料(或食品)中植酸的抗营养作用、提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率、促进生长发育、提高动物生产性能、减少粪便中磷的排放量、降低磷对环境的污染等多种功能，因而受到国内外的广泛关注。植酸酶主要存在于植物和微生物中，其中以微生物产生的植酸酶具有良好的开发前景，但微生物天然菌株产酶水平较低，加上天然植酸酶的某些性质不能完全适合饲料加工和养殖业的要求，从而限制了植酸酶在生产中的推广应用。通过植酸酶产生菌的筛选和基因克隆，并利用分子生物学技术构建基因工程菌，或在分子水平上改造植酸酶基因，以提高植酸酶产量或改变植酸酶酶学性质，从而降低生产成本，提高其使用有效性，己成为世界性的研究热点之一。 本研究的目的旨在通过从土壤中筛选酸性植酸酶高产菌株，并进一步通过诱变选育提高其产量，对高产突变菌株植酸酶基因进行克隆和分析，在此基础上，构建植酸酶高产基因工程菌，从而为植酸酶产品的工业化生产奠定基础。主要结果如下： 1 植酸酶高产菌株的筛选 利用植酸钙选择性子板培养基从土样中筛选出102株酸性植酸酶产生菌，从中挑选出透明圈较大的菌株32株，经分离纯化后分别进行摇瓶复筛，28℃、220r/min发酵5天后，在37℃、pH2.5或pH5.5条件下用钒钼酸铵法检测其酶活，结果发现有3株菌产酶活性较高且产酶性能较为稳定。其中编号为03214号的菌株在37℃、pH2.5时酶活性最高，达345U/mL发酵液；编号为041和0324号的菌株在37℃、pH5.5时酶活性最高，分别达285U/mL和250U/mL发酵液。根据产酶活性情况，选取03214号菌株作进一步鉴定和诱变选育的出发菌株。经初步鉴定，03214号菌为黑曲霉，编号为Aspergillus niger03214。 2 植酸酶高产菌株黑曲霉N14的诱变选育 以Aspergillus niger03214为出发菌株，通过紫外线诱变处理不同时间，经平板初筛和摇瓶复筛，获得一株产酶活性较高的突变株03214-3，酶活为373U/mL发酵液，比出发菌株提高了8％左右。以突变株03214-3为出发菌，经0.8mg/mL的亚硝基胍诱变处理不同时间，最终获得了产酶活性较原始菌株Aspergillus niger03214提高了22.3％，达422.3U/mL发酵液的突变菌株，编号为Aspergillus nigerN14。 将黑曲霉N14在PDA斜面上连续传7代，分别测定各代菌株酶活，结果其酶活稳定在410～430U/mL发酵液之间，说明突变株黑曲霉N14具有良好的遗传稳定性，可作为下一步基因工程研究的出发菌株。 3 黑曲霉N14基因组DNA的提取及植酸酶phyA基因的克隆，，画.‘，，妇..圈.翻‘通~ 以A，e啥1111”nigerN14为出发菌，采用改良氯化节法和斑迹抽提法提取基因组DNA，经紫外分光光度计测得DNA的ODZ曰心D翔均在1.80左右，表明这两种方法均适合提取黑曲霉基因组DNA。但在所用菌丝体重量相同的条件下，以氯化节法提取的pNA浓度较高。 根据曲霉菌属植酸酶基因具有高度同源性的特点，结合已报道植酸酶神州基因序列，自行设计一对特异性引物(上游引物:5，月队GGG叼℃八TGGGCG子巳n刃口，;下游引物:5，CAGC以六GCA阳心咙火CTCCGC3，)，采用乃仰七。t DNA聚合酶(高保真DNA聚合酶)，通过PCR方法从黑曲霉N14基因组DNA中扩增出了预期的约1.skb的特异性产物，将其与pMD18.T载体连接后，转化大肠杆菌Dll5Q，.经质粒抽提、五之口月111、tl双酶切鉴定和PcR鉴定，确认该目的基因已得到成功克隆。4黑曲霉N14植酸酶夕句以基因序列分析 DNA序列测定表明，本试验所克隆的目的基因片段含有植酸酶户州基因的完整序列(GeneBank AcceSSIOn:AY4269”)，夕句讨基因全长15仅无p，其中包含一段长102bp的内含子序列，编码467个氨基酸，5’端有拼编码19个氨基酸的信号肤序列。植酸酶活性位点序列CRvTEAQvLsRHGA即n红DsKCK位于氨基酸序列的+71~+93。黑曲霉N14植酸酶夕勺讨基因中G+仁含量达54.7%，密码子第叁位碱基的G+C含量高达67%。黑曲霉N14植酸酶助州基因与报道的产植酸酶活性最高的天然黑曲霉标准株N刊心乃135(来源于孟，己心iuus niger介uum夕va:a~ori)的尸句“基因(GeneBankA以尤SSion:M94550)及A.nigerN25PhyA基因(GeneBankA。戈SSion:AF21如13)、A.nigervar~夕句“基因(枷eBank Aa笼ssfon:ID2421)、A.niger5K-57夕hJ讨基因(G闭eBaDk八口戈SSion:川叨227(X))同源性分别为%.7%、%.8%、%.4%和91.7%，而编码的氨基酸序列同源性分别为98%、97.8%、%.7%和95.7%。进一步采用公pa叮IProtParam等软件对黑曲霉N14植酸酶夕句“基因编码氨基酸序列及编码的蛋白质二级结构预测进行分析，结果表明，黑曲霉Nl助h)“基因所编码氨基酸序列存在10个潜在的N-糖基化位点，与黑曲霉NRRU 135和黑曲霉N25的p勺讨基因所编码氨基酸序列上的N-糖基化位点个数及位置完全相同，而糖基化对微生物表达的植酸酶的生物合成和热稳定性至关重要;理论PI为4.95，分子量为5 n42.0，分子式为q6eH蝴3Ns990，消。;负电荷氨基酸残基 (As尹Glu)有51个，正电荷氨基酸残基(A犯+切s)有34个。实验结?
许钦坤[6]2005年在《植酸酶phyA基因密码子多点突变及在毕赤酵母中的表达研究》文中进行了进一步梳理本研究以本课题组构建的植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-NP~m-8为出发菌株,对植酸酶基因phyA基因进行PCR介导的定点突变,在不改变所编码氨基酸的情况下,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因第72位、146位、159位和165位编码精氨酸的两种密码子CGA、CGC进行定点突变,将4个位点的密码子突变成精氨酸高频使用的AGA,构建了突变基因phyA~(m-4)的克隆载体pUC18-phyA~(m-4)和酵母表达载体pPIC9k-phyA~(m-4),电击转化毕赤酵母,筛选获得了植酸酶毕赤酵母基因工程菌株PP-NP~(m-4)-2。 植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-NP~(m-4)-2酶活性测定结果表明,在BMGY/BMMY培养基中诱导36h后酶活力可达133800 u/ml,比出发菌株PP-NP~(m-8)的63667u/ml提高了1.10倍,在麦芽汁培养基中,诱导36h后酶活力达136900u/ml,比PP-NP~(m-8)的47600u/ml提高了1.87倍。 植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-NP~(m-4)-2表达产物的SDS-PAGE分析表明,酶蛋白分子大小为70.15KD。Southern blotting结果表明,phyA基因整合到酵母染色体DNA中。连续传10次培养实验证实,植酸酶毕赤酵母基因工程菌的遗传稳定。 本研究提高了植酸酶在毕赤酵母中的表达量,为基因工程菌的产业化生产奠定了基础。
曾民[7]2009年在《易错PCR突变提高植酸酶活力的研究》文中研究说明植酸酶是一种能将植物性饲料中植酸(盐)降解为肌醇和无机磷酸盐的酶类,其作为单胃动物的饲料添加剂,对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要作用。但目前酶活力和稳定性较低是植酸酶在生产运用中的一个瓶颈,因此通过基因工程和蛋白质工程技术对植酸酶进行改造具有重要的科学和实用价值。定向进化技术是在体外模拟达尔文自然进化过程,该技术已成为改造酶分子的一种有效策略,在农业、工业和医药等领域都展现了其巨大的潜力。定向进化技术改造植酸酶基因的过程中的一个关键是构建高通量的筛选方法。本研究在常规钼钒法测定植酸酶活性的基础上,进行微板法酶活微量测定研究,并在摇瓶培养基因工程菌的基础上进行微板上的微量培养研究,构建起一套针对植酸酶酶活力改造的高通量筛选方法。结果表明,酶活微量测定法和常规钼钒测定法的稳定性基本一致;无机磷的最低检出值前者为0.67μg/mL,后者为0.30μg/mL,两种方法灵敏度均较高;精确度前者为8.8%,后者为8.2%,两种方法的精确度差异不显着。无机磷浓度测定的线性范围前者为0.67μg/mL-48.14μg/mL,后者为0.30μg/mL-25.50μg/mL,微板法测定的线性范围略大于常规钼钒法;测定值的变异系数前者为12.1%,后者为10.5%,两种方法的变异系数差异不显着。并且微板法还可以大大提高工作效率、降低实验成本。微量培养所得样品酶液的酶活力低于用叁角瓶进行的摇瓶培养发酵所得样品酶液的酶活力,但是在高通量的初步筛选中,本研究关注的是突变菌株与原始出发菌株的比较,因此这种微量培养方法是可行的。本研究采用定向进化技术中较为成熟的一种方法——易错PCR对植酸酶基因进行改造。通过优化,易错PCR体系中Mn~(2+)浓度为0.1mmol/L,Mg~(2+)浓度为7mmol/L,dATP,dGTP浓度与dCTP,dTTP浓度比例为1:5。将易错PCR产物构建入pPIC9K载体质粒中,经线性化后转化毕赤酵母工程菌GS115,形成突变体库。利用高通量筛选方法进行筛选,获得了一株较高活性的产植酸酶突变基因工程菌PP-NP~(ep)-6A,其酶活力达到82034U/mL,较出发菌株PP-NP~m-8(63667U/mL)提高了29%。该酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH为5.6。经DNA测序分析表明PP-NP~(ep)-6A中突变植酸酶基因发生了9个碱基突变,并引起了4个氨基酸的变化,分别是Glu156Gly,Thr236Ala,Gln396Arg,Leu406Thr。经蛋白质二级结构预测发现,突变基因工程菌PP-NP~(ep)-6A表达的植酸酶二级结构与未突变一致,理化性质和等电点无明显变化。通过同源建模预测叁维结构发现,突变菌株PP-NP~(ep)-6A表达的植酸酶与未突变具有相同的多肽骨架,叁维结构一致,活性中心未见改变。而四个氨基酸突变可能使酶蛋白结构发生了微变化,增加了酶蛋白结构柔性,从而引起酶活力提高。本研究利用易错PCR的方法,在毕赤酵母表达载体pPIC9K上构建了突变体库,并筛选出酶活提高的突变株,为进一步通过定向进化改造植酸酶奠定了基础。
游丽金[8]2009年在《黑曲霉植酸酶基因的克隆、定点突变及高效表达》文中研究指明植酸酶作为一种重要的饲料添加剂和未来的食品添加剂,具有广阔的应用前景。但微生物分泌的植酸酶活力低是制约其的主要障碍。因此,研究和开发高活力植酸酶的制备技术意义重大。本研究在直接利用黑曲霉菌株NL-1制备植酸酶的基础上,对该菌株的植酸酶基因进行了克隆、定点突变,以及诱导表达条件的优化。主要结果如下:(1)以黑曲霉NL-1基因组DNA为模板,利用PCR技术成功克隆了黑曲霉NL-1植酸酶基因片段,大小约1,500bp。该序列与GenBank中已登录的黑曲霉植酸酶序列AY426977进行比对,核苷酸编码序列同源性为98.75%。(2)成功构建了毕赤酵母融合表达质粒pPICZαA-PhyA。采用电转化法将构建的表达质粒导入毕赤酵母GS115,筛选获得优良的转化子。诱导表达的结果表明,植酸酶基因在毕赤酵母中实现了较高水平的表达。适宜条件下,植酸酶的表达量为出发菌株的223倍。并首次从黑曲霉中克隆获得中性植酸酶。(3)在诱导产酶过程中,适宜的甲醇添加量为1%,适宜的甲醇添加时间为每隔36h添加1次,较佳的诱导产酶培养基为75%BMMY+25%麦芽汁。该条件下培养96 h后酶活力可达到142.82U/mL。(4)植酸酶最适反应温度、pH分别为50℃和5.0-7.0,在温度低于70℃、pH值为3.0-7.0范围内均能保持较好的稳定性。金属离子对植酸酶的活性也具有一定程度的影响。(5)在不改变氨基酸序列的情况下,对植酸酶基因序列中部分编码Arg的密码子进行同义突变,分别构建了3点和6点突变后的两种重组质粒,并成功转化到毕赤酵母GS115。通过筛选获得了表达量较高的重组菌。其中,六点突变的重组菌诱导表达5天后酶活力达到最高值149.31U/mL,比酶活为21.52U/mg,为突变前重组酵母的1.61倍。
刘生峰[9]2004年在《植酸酶基因在毕赤酵母中高效表达及工程菌培养基初步优化》文中研究指明植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的一类酶，将其添加到单胃动物植物性饲料中，可以释放植酸中的无机磷以及被植酸络合的Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)等矿物元素和一些蛋白质，从而解除植酸抗营养作用、提高动物饲料的营养价值，同时也减少了动物粪便中植酸磷的含量，降低了磷对环境的污染程度。研究表明，饲料中添加植酸酶可使其中磷利用率提高60％，粪便中磷排出量减少40％，还可以提高饲料转化率，改善动物的生产性能，因此对提高养殖业的经济效益及环境保护均具十分重要意义。 植酸酶主要存在于微生物和植物中，动物体内也有少量存在，但真正具有开发价值的主要是微生物产生的植酸酶，尤其是曲霉产生的酸性植酸酶。国外早在1991年就成功地利用DNA重组技术获得第一株酸性植酸酶的工程菌，并已投入商品化生产。目前已开始从事植酸酶的植物和动物基因工程的研究，已成功将植酸酶基因导入苜蓿、烟草、小鼠和猪的唾液腺中。国内对植酸酶的研究起步较晚，到目前为止，植酸酶野生菌株产酶水平低下的问题仍然没有得到彻底解决，目前市场上应用的植酸酶制剂多属进口产品，且价格昂贵。因此，提高植酸酶野生菌株产酶水平，降低其生产成本，对实现植酸酶产品国产化并获取自己专利具有十分重要意义。而提高野生菌株产酶水平的主要思路集中在通过基因工程手段克隆植酸酶基因或进行适当改造，然后将这些优良基因导入适当的宿主菌，进一步筛选出高产工程菌株，优化发酵工艺条件从而实现植酸酶基因的高效表达。 因此，本实验着力于将已构建的可进行诱导调控分泌表达的毕赤酵母整合型表达载体转化毕赤酵母受体菌，进而筛选出高产稳产植酸酶的工程菌，为植酸酶的规模化生产提供优良菌种，并对工程菌株的产酶培养基进行初步优化从而为规模化生产提供科学依据。主要实验结查如下：西南农业大学硕士学位论文 1、用乃aI酶切携带植酸酶基因表达片段的重组质粒pPICgK夕句)A，回收DNA，用GenePulser电击转化毕赤酵母，涂布MD平板，又用含不同浓度G418的YPD平板进行抗性筛选，得到98个可检测到植酸酶活力的阳性转化子，它们在MD、MM平板上均表现快速生长，说明其甲醇利用表型是Mut干。用特异性引物，对转化菌株进行PcR检测，扩增出了特异条带，表明外源基因整合进了宿主细胞。挑选转化子经过BMGY摇瓶培养、BMMY诱导发酵后，用钒铝酸按法测定了表达产物的酶活性，结果表明重组菌株可有效表达具有生物学活性的植酸酶。经摇瓶复筛后得到l株产酶活性为143958.3UZmL发酵液，并且具有良好遗传稳定性的高产工程菌株(E22)，其产酶活性是出发菌株酶活性(422U/mL)的341 .13倍。 2、重组酵母E一22在诱导培养168h之内，植酸酶的表达随时间的延长而增加，到144h接近高峰，之后基本保持稳定。菌体湿重在诱导培养72h之内有所增加，随后基本保持稳定。重组植酸酶部分酶学性质的研究结果表明:重组酶在pH值2.5一3.0和5.0一5.5时酶活性最高，且在pH4.5一6.5之间均有较高的酶活性，最适作用温度为55℃。sDs一PAGE的结果显示重组植酸酶的分子量介于70kDa~97kDa之间。重组植酸酶粗酶比活力为461575.8 u/mg。 3、用5因素的均匀设计试验对工程菌株的产酶培养基进行了初步优化，酵母提取物、甲醇、蛋白陈、YNB、生物素在培养基中的浓度分别取2%，4%，1%，0，0.0001%;在此条件下发酵液的酶活力达到108758.3 U/mL发酵液，高于均匀设计中各试验点的酶活力值，是使用BMMY培养基同条件(诱导培养96h，37℃测酶活)下酶活力(97666.7U/mL)的1 1 1.4%。
吴琦[10]2004年在《枯草芽孢杆菌植酸酶phyC基因的克隆及其表达研究》文中指出植酸酶作为一种绿色添加剂，已日益广泛使用于饲料工业中。研究表明，来源于芽孢杆菌的植酸酶属于中性植酸酶不仅具有较好的热稳定性，有助于抵抗饲料制粒或者膨化过程中引起的酶失活，而且其酶促反应的pH有效作用范围在6.5～7.5之间，适合用于消化道呈中性的鲤科鱼类，以及在单胃动物中pH值呈中性的肠道段中表现酶活力。目前，国内外尚无商品化的中性植酸酶投入市场。 本研究从已筛选获得的中性植酸酶产酶菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) WHNB02出发，根据GenBank上的芽孢杆菌，phyC基因序列设计了一对引物，采用PCR法获得芽孢杆菌植酸酶的全长phyC基因，并将其克隆到pUC18-T载体。序列分析表明，该基因全长1152bp，编码一个383氨基酸的多肽。通过与GenBank中登录的其他6个植酸酶基因的核酸序列和氨基酸序列进行比较，建立了系统进化树，结果表明：所有芽孢杆菌植酸酶具有较高的同源性，来源于7株芽孢杆菌的植酸酶在遗传上分为两大类。利用在线生物信息学数据库及生物软件对本基因进行了信号肽序列、N-糖基化位点、密码子偏爱性等分析，并对其二级结构、疏水区和叁维结构进行了预测。B．subtilis WHNB02植酸酶phyC基因序列及其氨基酸序列在GenBank中登录，登录号分别为AF220075和AA043434.1。 根据芽孢杆菌植酸酶phyC基因序列及大肠杆菌表达载体pET-30b(+)多克隆位点序列，采用PCR法获得不含有信号肽序列的植酸酶phyC基因的非融合和融合表达片段。经克隆及序列测定后，构建了带有T7lac启动子的大肠杆菌的植酸酶pET30NFphyC和pET30FphyC表达载体，并转入大肠杆菌BL21(DE3)，实四川大学博士学位论文现了有生物学活性的表达。研究了诱导温度、IPTG诱导浓度和乳糖诱导浓度对植酸酶非融合和融合表达的影响，并对表达目的蛋白的可溶性进行了分析。结果表明，非融合表达在37℃和30℃表达产物以包含体形式存在，无表观酶活，而25℃诱导的表观酶活最高:融合表达载体在37℃表观酶活较低，而30℃诱导的表观酶活最高。表明降低诱导温度有助于实现目的蛋白的可溶性表达。两种表达方式的工PTG最适诱导浓度为0.4mmol/L，乳糖最适诱导浓度为1%，但乳糖诱导表达的时间推迟1一2h，且表达量不及工PTG的诱导。SDS一PAGE分析表明，非融合和融合植酸酶的表达量分别约占菌体总蛋白的13%和15%，分子量分别为40.13KD和43.27KD。 为实现芽抱杆菌植酸酶助尹C基因的分泌表达，以及由酵母翻译后加工可能带来的酶学性质改善，首次进行了该基因在酵母中的表达研究。根据芽饱杆菌植酸酶ph一C基因序列及毕赤巴斯德酵母表达载体pPIC3.SK和pP工CgK多克隆位点序列，采用PCR法获得不含有信号肤序列的植酸酶ph了C基因胞内表达和分泌表达片段。经克隆及序列测定后，构建了重组表达载体pPIc3.SKphyC和ppICgKphyC，经Bgl 11线性化后，电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌Gs 115。经MD和MM平板筛选、PCR检测和酶活性测定，获得阳性重组酵母，首次在毕赤巴斯德酵母中实现了有生物学活性芽抱杆菌植酸酶的胞内表达和分泌表达。SDS一PAGE分析表明，胞内植酸酶表达量约占菌体总可溶性蛋白的24%，分子量为42.01KD;而分泌表达的植酸酶为53.SKD和50.gKD两种分子量的蛋白，去糖基化试验证明这是由于产物糖基化程度不同引起的糖蛋白。用麦芽汁半合成培养基对分泌表达重组酵母进行培养，经48h诱导酶活可达到2453U/ml，表达量为出发菌株的10.5倍。 将本研究获得的芽抱杆菌植酸酶的4种基因工程菌表达产物，即大肠杆菌表达的非融合植酸酶和融合植酸酶、酵母胞内表达的植酸酶和分泌表达的植酸酶，通过初步纯化后，对其最适反应温度、热稳定性和最适反应pH值进行了测定。结果表明，4种基因工程植酸酶的最适反应温度分别为55℃，75℃，70℃和65℃，与天然植酸酶相比，分别降低了5℃和增加了巧℃，10℃和5℃。热稳定性测定表明，经75℃处理时，4种基因工程植酸酶分别表现为酶活急剧下降，几乎没有损失，损失较小和几乎没有损失;在90℃水浴smin和10min后四川大学博士学位论文的残留酶活性分别为43.8%和35.5%，94.9%和75.7%，54.6%和42.2%，以及88.0%和78.2%，均比天然植酸酶的有所提高。4种基因工程植酸酶的最适反应pH分别为7.0，7.5，7.5和7.。，催化效率在70%以上的有效反应pH范围分别为pHS.5一8，pHS.5一9，pH6.5一9和pH6一8，比天然植酸酶的扩大了0.5一l个PH。关键词:枯草芽抱杆菌，植酸酶，助一‘基因，大肠杆菌，毕赤巴斯德酵母， 表达尹-
参考文献：
[1]. 植酸酶phyA基因活性中心密码子的改造及基因工程菌培养条件的研究[D]. 赵海霞. 四川农业大学. 2004
[2]. 基因突变技术提高phyA植酸酶在毕赤酵母中表达量及热稳定性的研究[D]. 陈惠. 四川农业大学. 2004
[3]. 定点突变技术提高黑曲霉N25植酸酶热稳定性的研究[D]. 李春梅. 四川农业大学. 2011
[4]. 定向进化技术提高重组突变黑曲霉N25植酸酶酶活及热稳定性的研究[D]. 廖燕. 四川农业大学. 2012
[5]. 植酸酶产生菌的选育及高表达工程菌的构建研究[D]. 彭远义. 西南农业大学. 2004
[6]. 植酸酶phyA基因密码子多点突变及在毕赤酵母中的表达研究[D]. 许钦坤. 四川农业大学. 2005
[7]. 易错PCR突变提高植酸酶活力的研究[D]. 曾民. 四川农业大学. 2009
[8]. 黑曲霉植酸酶基因的克隆、定点突变及高效表达[D]. 游丽金. 南京林业大学. 2009
[9]. 植酸酶基因在毕赤酵母中高效表达及工程菌培养基初步优化[D]. 刘生峰. 西南农业大学. 2004
[10]. 枯草芽孢杆菌植酸酶phyC基因的克隆及其表达研究[D]. 吴琦. 四川大学. 2004
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