岳阳县疾病预防控制中心 湖南岳阳 414100
【摘 要】目的 探讨实时荧光RT-PCR检测手足口病病毒核酸的临床应用价值。方法 采集县中医院2015年 3月-2016年3月收治的疑似手足口病患儿的咽拭子或疱疹液或粪便标本，共采集标本200份，从标本中提取病毒RNA，并采用实时荧光RT-PCR法进行检测，分析检测结果。结果 本组200份标本经实时荧光RT-PCR检测共检出阳性标本178份，阳性率为89.0%，阴性22份。阳性标本中CoXA16病毒占比72.5%，EV71病毒占比19.7%，其他肠道病毒占比7.3%。2015年 3月-2016年3月期间本地手足口病毒以CoXA16型为主。结论 实时荧光RT-PCR检测技术在手足口病病毒核酸检测中具有操作简单、快速、灵敏度高的优势，可作为手足口病早期诊断的首选检测方法。
【关键词】实时荧光RT-PCR；手足口病；病毒核酸
[Abstract] objective to investigate the clinical application value of hft-pcr in real-time fluorescence rt-pcr. Methods to collect county hospital in March 2015 - March 2016 suspected children with hand，foot and mouth disease in our hospital pharyngeal swab or herpes fluid or stool specimens，a total of 200 samples，the viral RNA extracted from the specimen，and USES the real-time fluorescent rt-pcr method for detection and analysis of test results. Results the samples of 200 specimens were tested positive for 178，and the positive rate was 89.0% and negative 22. The CoXA16 virus accounted for 72.5 percent of the positive specimens，and the EV71 virus accounted for 19.7 percent，while the other enteroviruses accounted for 7.3 percent. From March 2015 to March 2016，the local HFMD virus was dominated by CoXA16. Conclusion real-time fluorescent rt-pcr detection technique in the hand，foot and mouth disease virus nucleic acid detection has the advantages of simple operation，rapid，high sensitivity，and can be used as early diagnostic method of choice for hand，foot and mouth disease.
[Keywords] real-time fluorescent rt-pcr；Hand，foot and mouth disease；The virus nucleic acid
手足口病是临床常见传染性疾病，该病由多种肠道病毒及其他微生物感染引起，是儿童常见疾病。资料显示，婴幼儿是手足口病的多发人群，多数患儿症状轻微，多表现为手、足、口等部位疱疹或皮疹，少数患儿病情较重，出现高热、呕吐、恶心、寒颤等，可并发心肌炎、无菌性脑膜炎、脑炎等病，严重的可导致患儿死亡。研究发现，导致手足口病的肠道病毒有A组柯萨奇病毒（CoXA16）、肠道病毒71型（EV71）、埃可病毒（ECHO）等，且具有较强的传染性，易引起爆发或流行[1]，因此，快速、高效、准确的对肠道病毒进行检测具有极其重要的临床意义。有文献报道，实时荧光RT-PCR技术在检测病毒核酸方面有较高的灵敏度和特异性，且检测时间只需4-6h。为了进一步探讨该检测技术在手足口病病毒核酸检测中的应用价值，特开展本研究。
1资料与方法
1.1标本来源
本研究标本采集自县中医院2015年 3月-2016年3月收治的疑似手足口病患儿的咽拭子或疱疹液或粪便标本，共采集标本200份，标本采集后置入专用生物样品运送箱内，并尽快送入本区疾病预防控制中心进行实验室检测。
1.2方法
1.2.1 仪器及试剂盒
仪器采用7500Fast型（美国applied biosystems 公司提供）实时荧光定量PCR仪，人肠道病毒试剂盒采用中山大学达安基因股份有限公司生产的CoXA16、EV71荧光PCR测试剂盒，采用德国Qiagen公司生产的核糖核酸（Ribonucleic Acid，ＲNA）提取试剂盒。
1.2.2操作方法
（1）RNA的提取。标本RNA的提取严格按照德国Qiagen公司的核糖核酸提取试剂盒说明书操作，抽提结束后即刻进行ＲNA检测。（2）实时荧光RT-PCR检测。严格按照试剂盒说明书进行EV71、CoXA16等人肠道病毒检测操作：①PCR反应体系。总体积为25μl，其中包括15μl的 CoXA16（EV71）RT-PCR反应液，5μl的模板，3μl的Tag酶系，2μl的逆转录酶系。②反应条件。温度为40℃，逆转录25min1，1个循环，然后设置温度为94℃条件，进行3min变性，1个循环，再以93℃条件下15s’→55℃条件下45s’，进行40个循环。③ 质量控制。先进行基线调整，并进行阈值设定。以满足阳性对照FAM通道的Ct值≤35且同时DEPC-H2O通道显示无Ct值来控制实验的有效性。④结果判定[2]。严格按照试剂盒说明书所列参考值进行检测结果的判定，CoXA16病毒、肠道病毒、EV71病毒均以Ct值＞38.46判定为阴性，CoXA16病毒的Ct值＜35.86，同时具有典型扩增曲线，判定为阳性，EV71病毒的Ct值＜35.29，同时具有典型扩增曲线，为阳性；肠道病毒Ct值＜35.62，同时具有典型扩增曲线，为阳性。
1.3统计学分析
研究数据采用EXCEL2013整理分析，连续性资料采用均值±标准差进行描述；分类资料采用构成比（%）进行描述。
2结果
本组200份标本经实时荧光RT-PCR检测共检出阳性标本178份，阳性率为89.0%，另外22份标本为阴性。阳性标本中CoXA16病毒占比72.5%（129/178），EV71病毒占比19.7%（35/178），其他肠道病毒占比7.3%（13/178），见表1。可见，2015年 3月-2016年3月期间本地手足口病毒以CoXA16型为主。
3讨论
手足口病是一种世界性传染性疾病，多数国家均发生过该病的流行。该病病因复杂，多数患者由于肠道病毒CoXA16及EV71感染引起，感染该类病毒后，患者肠道黏膜腺体和全身循环系统均可出现神经系统受累表现[3]，不过，多数患者均有轻微表现，且可在1周内自愈，预后良好，而重症患儿则可引起明显的脑膜刺激，并可导致呼吸循环功能衰竭，威胁患儿身体健康及生命安全[4]。
研究者认为，早期诊断对手足口病患儿尤其是重症患者有极其重要的意义，不但可显著提高临床疗效，而且可提高重症患儿的生存几率。骆玲飞等[5]研究指出，手足口病流行时期，可通过观察幼儿的口腔、手足部位的皮疹分布来协助临床早期诊断。但部分患儿并无早期典型症状，而病原学检测需耗费2-4周的时间方可得到结果，临床应用受限。近年发展起来的荧光定量CPR技术以特异性荧光探针为显著特点，进行特异性较强的病原学检测，且该技术在手足口病病毒检测中具有耗时短、敏感性高的特点，可为临床早期诊断提供重要信息。余雄武等[6]研究结果显示，实时荧光RT-PCR技术可快速检测手足口病毒的CoXA16型和EV71型感染，尤其在早期检出EV71型病毒感染中具有较高的敏感性，对早诊断、早治疗、提高临床疗效有重要价值。本研究结果显示，本组200份标本经实时荧光ＲT－PCＲ检测共检出阳性标本178份，阳性率为89.0%，且以CoXA16病毒占较大比重，提示该研究期间手足口病毒以CoXA16型为主。同时，该技术具有高通量性优势，并不局限于临床检验，还可以应用于进行大规模流行病学的调查研究中
综上，实时荧光RT-PCR检测技术在手足口病病毒核酸检测中具有操作简单、快速、灵敏度高的优势，可作为手足口病早期诊断的首选检测方法。
参考文献：
[1]胡雪影，张玲.实时荧光定量RT-PCR 法检测安徽宿州市手足口病病原体结果分析[J].热带病与寄生虫学，2015，13（4）：208-210，218.
[2]方静霞，沈丽萍，吴捍卫.荧光定量PCＲ和酶联免疫吸附技术在手足口病肠道病毒快速检测中的应用比较[J].儿科药学杂志，2014，20（10）：1-3.
[3]李丽琴，钟婧，周林福，等．EV71、CA16 及通用型肠道病毒实时荧光定量PCＲ诊断试剂盒的研发［J］．中华实验和临床病毒学杂志，2013，27（3）：224-227．
[4]王美芬，陈韬，杜曾庆，等．2010年昆明及周边地区普通型与重型手足口病病原学分析［J］．中国实用医刊，2013，40（1）：30-32．
[5]骆玲飞，王小光，乔坤，等．多重荧光ＲT－PCＲ 在手足口病病原检测中的应用分析［J］．中国卫生检验杂志，2013，23（10）：2283－2292．
[6]余雄武，冯琳，潘虹，等.实时荧光ＲT－PCＲ 法检测手足口病病原体EV71 和CA16及临床特点分析[J].中国妇幼保健，2016，31（2）：408-410.
论文作者:黄琼
论文发表刊物:《中国蒙医药》2017年第8期
论文发表时间:2017/8/1
标签：病毒论文; 手足论文; 荧光论文; 标本论文; 肠道论文; 阳性论文; 实时论文; 《中国蒙医药》2017年第8期论文;