韩锋产[1]1998年在《幽门螺杆菌cagA基因的定量检测及其表达产物的应用性研究》文中认为幽门螺杆菌(Hp)在上消化道疾病的发生中起重要作用，Hp是慢性活动性胃炎的主要病原菌，是消化性溃病的主要致病因子，是胃癌发生的一个重要的协同致癌因子。根据Hp菌株是否产生细胞空泡毒素(VacA)将Hp分为毒性株与非毒性株两大类。产毒株Hp除产生VacA外，还往往含有细胞毒素相关蛋白基因A(cagA)，产生细胞毒素相关蛋白A(CagA)，CagA可能与VacA的转录、折叠、运转及功能等有关。cagA~+Hp菌株占Hp的50％以上，它与消化性溃病的发生密切相关，在胃癌组织中也有较高的感染率，因此诊断cagA~+Hp感染具有重要意义，而建立cagA~+Hp感染的有效检测方法十分必要。 目前，用常规PCR检测cagA基因已不能适应cagA~+Hp与疾病关系的深入研究。本研究利用重组PCR技术将乳糖操纵子中LacI蛋白的特异性结合序列(21bp)重组入cag A基因的PCR扩增片段(397bp)之中，并克隆入pUC19，获得竞争性
黄世腾[2]2010年在《幽门螺杆菌cag致病岛中cagL基因的鉴定与分析》文中研究指明目的:克隆并鉴定幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)NCTC 11637cagL编码基因;原核表达并纯化CagL融合蛋白;观察其融合蛋白对细胞株GES-1表达IL-8 mRNA能力的影响,并探讨cagL基因在H.pylori cag致病岛(cagpathogenicity island,cag PAI)编码的Ⅳ型分泌系统(typeⅣsecretion system,TFSS)中的作用,为进一步阐明H.pylori的致病机制奠定基础。方法:1.根据GenBank收录的H.pylori 22695全基因组序列,设计扩增cagL基因的引物,利用PCR技术从H.pylori NCTC 11637基因组DNA中扩增获取cagL基因,T-A克隆后进行序列测定;并对其序列进行生物信息学分析研究;2.构建PET-28a(+)-cagL原核表达载体,转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导阳性菌株表达后,SDS-PAGE法和Western Blot法鉴定目的蛋白,并用Ni~(2+)-NTA树脂分离纯化所表达的CagL融合蛋白;3.将融合蛋白CagL与弗氏佐剂充分乳化后,免疫家兔,制备抗CagL多克隆抗体;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中抗体效价;4.不同浓度的融合蛋白CagL与GES-1细胞作用一定时间后,提取细胞总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-8 mRNA的表达;5.收集H.pylori,重悬并裂解菌体,经高速离心分离得到各菌体组分蛋白,包括周质间隙蛋白、胞质蛋白及内外膜蛋白;利用Western Blot法检测CagL蛋白的亚细胞定位;6.将制备的CagL多克隆抗体按不同比例与幽门螺杆菌共孵育后,分别加入至细胞GES-1中,作用一定时间后;Western Blot法检测细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin-associated gene A,CagA)在抗体中和前后转运的影响;结果:1.PCR扩增获得的cagL基因全长为654 bp,编码217aa,(申请GenBank的登录号为GU937872)与GenBank公布的其它H.pylori菌株的基因序列同源性为96%～98%,氨基酸同源性为97%～99%,蛋白的相对分子质量Mr约为32KDa,软件预测显示有多个明显的具有抗原活性的结构域。2.成功构建了PET-28a(+)-cagL原核表达载体,确定IPTG终浓度1mmol/L,温度30℃,诱导时间4h为最佳诱导条件,经SDS-PAGE及Western Blot法鉴定有目的蛋白表达;通过Ni~(2+)-NTA树脂分离纯化目的蛋白,获得原核表达的CagL融合蛋白。3.获得CagL融合蛋白多克隆抗体,效价为1:3.2×10~5。4.CagL融合蛋白可诱导细胞GES-1表达IL-8 mRNA,并且该效应呈浓度依赖性。5.Western Blot结果显示CagL蛋白定位于菌体内外膜;经CagL多克隆抗体中和作用后,其菌体转运CagA的蛋白量随抗体量的增加而逐渐降低,表明抗体中和作用后能够抑制CagA蛋白的转运。结论:本研究通过克隆表达cagL基因,获得CagL融合蛋白;并且证实CagL可诱导细胞株GES-1表达IL-8 mRNA,该效应呈浓度依赖性;CagL蛋白定位于菌体内外膜,通过制备的CagL多克隆抗体中和作用后可抑制CagA蛋白的转运。
葛迪[3]2007年在《幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18与UreB414融合疫苗的实验研究》文中研究指明目的:幽门螺杆菌(H.pylori)的全球感染率超过了50%,它是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与肠型胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的发生密切相关。现有的根除H.pylori的手段主要是联合应用抗生素,但由于该菌感染的普遍性、耐药菌株的不断增加、较高的花费以及病人的低依从性等,限制了抗菌药物的疗效。因此,接种简便、成本低廉并易于大面积推广的H.pylori疫苗的研究十分迫切。在疫苗研究中,筛选有效的免疫抗原是关键性的环节。目前大多数疫苗采用的是与Hp致病相关的毒力因子作为抗原成分,如尿素酶(urease)、热休克蛋白(heat shockprotein,Hsp)、空泡毒素(vacuolating cytotoxin,VacA)、细胞毒素相关抗原(cytotoxinassociate antigen,CagA)、中性粒细胞激活蛋白(neutrophil-activating protein,NAP)等。革兰氏阴性细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性,这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标,可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用,是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。OMP18和UerB都是Hp的外膜蛋白成分,其编码基因具有高度保守性,也是Hp疫苗重要的免疫抗原。但一直令学者们遗憾的是每种抗原单独免疫动物时,获得的保护率均不是很高,而多种抗原联合免疫才能达到较好的效果。因此,本研究拟对上述二种保护性抗原基因进行克隆表达,并与分子内佐剂LTB串联得到多亚单位的融合蛋白,分别观察在小鼠体内诱导的不同免疫应答和保护作用,为筛选有效的H.pylori疫苗抗原奠定基础。方法:1、采用PCR方法从H.pylori临床分离株9806基因组中扩增OMP18基因片段并构建在原核表达载体pQE-30中,通过酶切、测序鉴定阳性重组子。应用生物信息学软件DNAssist和GenBank数据库对已公布的H.pylori OMP18基因序列进行相似性分析。将含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌M15中,经IPTG诱导表达,用AKTA-explore纯化仪纯化表达的重组蛋白rOMP18。应用Tris-Tricine方法对表达产物和纯化产物进行分析,用纯化的rOMP18免疫家兔,并采用Western blot和免疫扩散试验鉴定重组蛋白的免疫性。2、采用重叠延伸PCR的方法,分别以UreB414活性片段做为融合蛋白前端,与OMP18及粘膜佐剂LTB依次串联,和以粘膜佐剂LTB做为融合蛋白前端与OMP18依次串联,在片段间引入5个氨基酸的linker PQDPP进行连接;将融合基因构建在原核表达载体pET-28a中,经酶切及测序鉴定后,阳性重组子转化宿主菌E.coliBL21(DE3),IPTG诱导重组工程菌表达。Tris-Tricine电泳和免疫印迹鉴定融合蛋白,DNAssist软件分析融合蛋白理化特性,通过纯化条件摸索,AKTA-explore纯化仪纯化融合蛋白LTB-OMP18(LO)和UreB414-OMP18-LTB(UOL)。纯化后的融合蛋白分别与GM1神经节苷脂进行结合试验。3、将144只小鼠随机分为6组:PBS对照组、单亚单位分子内佐剂融合蛋白组(UreB414-LTB)、双亚单位分子内佐剂融合蛋白组(UreB414-OMP18-LTB、)单一亚单位分子内佐剂融合蛋白组(LTB-OMP18)、体外物理混合组(rOMP18+UreB414-LTB)无分子内佐剂单一亚单位蛋白组(OMP18)。分别于0、7、14、28天口服免疫,剂量为150μg/只/次。术次免疫后10天,每组取12只小鼠剖杀取样,ELISA检测口服免疫后血清特异性IgG、IgA,粪便、肠道冲洗液sIgA水平。每组余下12只口服10~8 CFU Hp小鼠适应株,30天后,取小鼠胃部标本通过Hp培养及特异性PCR检测,确定Hp感染率,并计算口服免疫后各组攻毒保护率。结果:1、经酶切鉴定和基因测序结果显示,H.pylori OMP18基因被正确克隆到pQE-30中。OMP18基因的核苷酸序列长度为540bp,与GenBank中序列比较,同源性为99%,氨基酸序列的同源性为100%。重组工程菌IPTG诱导,经Tris-Tricine分析,表达的目的蛋白分子量约为20KD,其表达产物占菌体蛋白的20%,为包涵体形式表达,经AKTA-explore 100蛋白纯化系统纯化,纯化后得到纯度＞85%的目的蛋白。以纯化蛋白为抗原加弗氏佐剂免疫家兔,制备兔抗rOMP18特异抗体,经免疫双扩散法检测,兔抗血清抗体效价为1:32,Western Blot结果也显示重组蛋白能被兔抗H.pylori血清所识别。2、经酶切鉴定和基因测序结果显示,成功构建了融合基因LTB-OMP18和UreB414-OMP18-LTB,将融合基因LO和UOL克隆到pET28a载体上,得到融合蛋白表达载体pLO和pUOL,DnaStra软件评价蛋白linker具有较好的柔韧性。将两个阳性重组子转化至E.coli BL21(DE3)后,37℃培养经IPTG诱导,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和免疫印迹分析显示分子量约为31KD和43KD。UVP扫描证实融合蛋白表达约占总蛋白的25%和20%。包涵体鉴定试验证实融合蛋白主要以包涵体形式表达,确定了采用亲和层析的纯化方法。纯化后得到纯度＞85%的融合蛋白。纯化后的两个融合蛋白分别能与GM1神经节苷脂发生结合反应,实验证实重组融合蛋白中LTB组分具有与GM1神经节苷脂结合的生物活性,说明融合蛋白保持了LTB的天然活性,具有粘膜佐剂活性。3、ELISA检测融合蛋白rLO和rUOL免疫小鼠后血清特异性IgG、IgA,粪便、肠道冲洗液sIgA水平与PBS组相比,升高明显,差异极显著(p＜0.001),与亚单位免疫组相比,差异显著(p＜0.05),与多亚单位蛋白物理混合组相比,差异不显著(p＞0.05)。免疫攻毒后,免疫保护率为:rLO组67%(8/12),rUOL组83%(10/12)。统计分析显示,多亚单位融合蛋白组免疫保护率与PBS组相比,差异极显著(p＜0.001),与rOMP18组相比,差异显著(p＜0.05),与rOMP18+UreB414-LTB组相比,差异不显差(p＞0.05)。结论:1、成功克隆了H.pylori OMP18基因,与GenBank已公布的H.pylori菌株基因序列具有高度同源性。纯化的重组蛋白rOMP18,具有良好的免疫原性和免疫反应性,可以作为H.pylori基因工程疫苗候选抗原。2、成功构建、表达融合蛋白rLO和rUOL,纯化后的融合蛋白保持各亚单位组分及佐剂的独立免疫反应性,融合基因间的Linker对融合蛋白的立体构象影响较小。3、小鼠体内特异性抗体水平及免疫保护效果都证明融合蛋白rLO和rUOL具有良好的安全性和免疫保护效果。
李滨[4]2013年在《不同佐剂下幽门螺杆菌UreB疫苗的Th表位优势应答研究》文中研究表明背景：幽门螺杆菌（Helicobacter pylori， Hp）是定植于人胃粘膜及十二指肠粘膜局部的革兰阴性杆菌。全球范围感染率超过50%，与慢性胃炎，消化性溃疡及胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤密切相关，已被世界卫生组织列为人类的一类致病因子。目前临床上主要通过联用多种抗生素与质子泵抑制剂对Hp感染患者进行治疗。但由此产生的抗生素耐药问题越来越突出，同时还存在患者依从性差及再次感染率高等问题，因此研发新的抗菌疫苗以预防或清除局部Hp已十分必要。目前针对Hp所设计的全菌疫苗，可诱导机体产生有效的保护性应答，但因其抗原成分复杂常导致较多的副反应发生。而通过重组表达某一抗原成分设计的亚单位疫苗不仅可诱导机体产生特异性免疫应答反应，而且安全性更高。然而在疫苗研发过程中发现，同一蛋白抗原分别采用不同佐剂或同一佐剂的不同免疫途径进行疫苗接种后，往往出现截然不同的免疫保护效果。Hp为一种胞外感染菌，可诱导机体产生强烈的CD4+T细胞应答，已经证实特异性CD4+T细胞免疫应答在机体抗Hp感染过程中发挥重要的免疫保护作用。而抗原所激发的特异性CD4+T细胞应答主要由抗原中的某一个或几个表位所诱导。因此我们推测基于同一保护性抗原的亚单位疫苗，辅以不同的佐剂或同一佐剂的不同免疫途径，所产生的免疫保护效果差异可能由于特异性CD4+T细胞对应显性表位应答的不同所造成。Hp尿素酶被证实与Hp的感染、定植密切相关，其通过分解尿素产氨以中和胃粘膜局部的H+，产生适于Hp定植的微环境。尿素酶包含两个亚基即A亚单位（UreA）和B亚单位（UreB）。其中UreB可诱导机体产生强烈的免疫应答，且核苷酸和氨基酸序列高度保守是目前公认的Hp保护性抗原。因此本课题选取UreB作为研究对象，分别辅以弗氏佐剂、CpG和AddaVax三种不同佐剂进行皮下免疫接种，以及CpG佐剂的皮下和滴鼻两种途径免疫小鼠，采用步移合成重叠肽方法和细胞内因子染色、流式细胞术等对特异性CD4+T细胞的显性表位应答特性进行分析。探寻不同佐剂或免疫途径下表位特异性优势应答的差异，揭示不同佐剂或免疫途径下免疫保护作用差异的内在原因。目的：以UreB为研究对象，通过对特异性CD4+T细胞的显性表位优势应答特性分析为同一保护性抗原的不同佐剂疫苗或同一佐剂疫苗的不同免疫途径所产生的保护效果差异提出新的解析，为基于表位设计的Hp疫苗研究提供候选分子和实验依据，也为Hp疫苗的保护性应答监测提供有效方法。方法：1、幽门螺杆菌培养。选择在BALB/c小鼠模型中定植量较高的幽门螺杆菌菌株B6进行培养。调整细菌浓度为109CFU/ml用于感染攻毒。2、小鼠免疫攻毒。分别采用CpG，AddaVax，弗氏佐剂联合UreB抗原皮下注射免疫小鼠。CpG分别采用皮下和滴鼻进行免疫。表位免疫均采用滴鼻免疫，佐剂选择CpG。末次免疫后1周行Hp攻毒。3、特异性抗体检测。采用ELISA法分别检测血清和胃粘膜局部的IgG抗体和IgA抗体。判断其体液免疫应答情况。4、胃粘膜Hp定植量检测末次攻毒后4周，提取小鼠胃粘膜局部DNA，采用实时定量PCR检测幽门螺杆菌16SrDNA。判断胃粘膜局部Hp定植情况。5、特异性T细胞扩增。收集免疫后小鼠的脾脏，研磨成单细胞悬液，经小鼠淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞，在白介素存在的条件下体外经抗原或肽刺激进行特异性T细胞的扩增。6、诱导小鼠骨髓源DCs与递呈实验。收集小鼠骨髓，制成单细胞悬液后裂解红细胞，剩余细胞在相应细胞因子的刺激下分化发育为DCs。成熟的DCs预负载抗原1h后与特异性细胞共培养，用于递呈实验。7、细胞内因子染色。在高尔基体阻断剂存在的条件下，采用合适的刺激物刺激特异性细胞合成细胞因子5h，之后用荧光抗体标记细胞表面分子及细胞内因子。最后进行流式分析。8、数据分析胃粘膜局部Hp定植量检测采用非配对T检验。其它数据均采用单因素方差分析。所有数据均采用平均数±标准差表示。p≤0.05视为有统计学意义。结果：1、UreB联合不同佐剂免疫小鼠可诱导产生有差异的免疫保护作用。CpG疫苗滴鼻组和弗氏佐剂疫苗皮下注射组小鼠胃粘膜幽门螺杆菌定植量较其它免疫组和PBS对照组显著降低（P<0.01），而其它免疫组与PBS对照组相比无显著差异，但CpG疫苗皮下组、AddaVax疫苗皮下组的Hp定植数量略低于PBS对照组。2、体外从抗原免疫组小鼠脾脏中成功扩增出抗原特异性CD4+T细胞，其比例可达到10%，而未免疫组即PBS对照组未见阳性信号。3、从UreB抗原中筛选到4个优势应答表位，AddaVax佐剂皮下免疫组优势应答表位为UreB485-497（AKYDANITFVSQA），而弗氏佐剂及CpG佐剂皮下免疫组均可诱导产生针对UreB317-329（MLMVCHHLDKSIK）和UreB409-421（YTINPAIAHGISE）的表位特异性细胞应答， CpG佐剂滴鼻免疫组优势应答表位为UreB373-390（ITRTWQTADKNKKEFGRL）。4、显性表位UreB317-329（MLMVCHHLDKSIK）、UreB373-385（ITRTWQTADKNKK）、UreB409-421（YTINPAIAHGISE）和UreB485-497（AKYDANITFVSQA）的应答均可被MHC-Ⅱ（I-A）单克隆抗体特异性阻断。5、对显性表位进行免疫保护性评估发现UreB317-329（MLMVCHHLDKSIK）、UreB373-385（ITRTWQTADKNKK）表位免疫组胃粘膜Hp定植量显著降低（P＜0.001），而表位UreB409-421（YTINPAIAHGISE）和UreB485-497（AKYDANITFVSQA）免疫组与PBS对照组相比无统计学差异。结论：1、针对同一保护性抗原应用不同的佐剂可诱导机体产生不同的表位特异性CD4+T细胞优势应答。2、针对同一保护性抗原，同一佐剂的不同免疫途径可激发机体产生不同的表位特异性CD4+T细胞优势应答。3、采用步移合成重叠肽法，从UreB中筛选鉴定出4个新的Th显性表位UreB317-329（MLMVCHHLDKSIK）、UreB373-385（ITRTWQTADKNKK）、UreB409-421（YTINPAIAHGISE）和UreB485-497（AKYDANITFVSQA），可通过MHC-Ⅱ（I-A）限制性自然递呈，并诱导Th1细胞优势应答。4、四个Th显性表位中UreB317-329（MLMVCHHLDKSIK）、UreB373-385（ITRTWQTADKNKK）具有显著的抗Hp感染的免疫保护作用。
参考文献：
[1]. 幽门螺杆菌cagA基因的定量检测及其表达产物的应用性研究[D]. 韩锋产. 第四军医大学. 1998
[2]. 幽门螺杆菌cag致病岛中cagL基因的鉴定与分析[D]. 黄世腾. 江苏大学. 2010
[3]. 幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18与UreB414融合疫苗的实验研究[D]. 葛迪. 第三军医大学. 2007
[4]. 不同佐剂下幽门螺杆菌UreB疫苗的Th表位优势应答研究[D]. 李滨. 第三军医大学. 2013
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