于丰彦1 黄绍刚3 张海燕3 王颖1 童金生1 黄怡1 翁一洁1 叶华4 郑学宝2
（1.广东医学院第二临床学院 广东 东莞 524023）
（2.广东医学院中医研究室 广东 东莞 524023）
（3.广东省中医院大学城分院 广东 广州 511495）
（4.广东医学院广东天然药物研究与开发重点实验室 广东 湛江 524023）
【摘 要】目的：探讨痛泻要方干预下IBS-D内脏敏感性模型大鼠GABAA受体和NMDA受体的中枢敏化的作用。方法：建立内脏敏感性IBS-D大鼠动物模型，并予以痛泻要方干预，观察其腹部撤回反射(AWR)评分和小肠推进率，通过PT-PCR法检测其NMDA受体和GABAA受体在其脊髓中的表达。结果：痛泻要方能显著降低NR1基因转录，提高GABAA受体基因转录。痛泻要方干预后压力提高明显，并同时能明显抑制正常大鼠的肠运动降低内脏敏感性IBS大鼠小肠推进速率。结论：痛泻要方可能对脊髓NMDA和GABA受体广泛的交互作用在内脏敏感性IBS大鼠中枢敏感化中发挥作用。
【关键词】内脏敏感性；IBS-D；痛泻要方；NMDA受体；GABA受体
【中图分类号】R365 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）8-0660-03
Tongxie yaofang in IBS - D model of visceral sensitivity in rats GABAA receptors and the role of central sensitization of NMDA receptor
FengYan Yu1,Huang Shaogang3, zhang haiyan3, Tong JinSheng1, Huang Yi1, Weng YiJie1,Ye Hua4,Zheng Xuebao 2
（1.The second clinical college of guangdong medical college, Dongguan city, Guangdong province, 524023）
（2.Guangdong medical college of traditional Chinese medicine research Dongguan city, Guangdong province, 524023）
（3.Guangdong hospital of university city branch Guangzhou city, Guangdong province, 511495）
（4.Guangdong natural medicine research and development key laboratory of guangdong medical college Zhanjiang, guangdong province, 524023）
【Abstract】Objective: To this project intends to study Tongxie yaofang intervened D-IBS visceral sensitivity model rats GABAA receptors and the role of central sensitization of NMDA receptor. Methods: Establish IBS visceral sensitivity - D animal model in rats, and Tongxie yaofang intervention, observe its abdominal withdrawal reflex (who runs AWR) score and small intestinal propulsion rates visceral sensitivity, such as through the PT - PCR method to detect the expression of NMDA receptors and GABAA receptors in the spinal cord. Results: The experiment at the eighth week of severe diarrhea can significantly reduce the NR1 gene transcription, increase GABAA receptor gene transcription. Model group and s intervention group carried on abdominal pain and arch back pressure compared with normal control group, with significant difference (P < 0.05). Tongxie yaofang pressure increase significantly after intervention, and at the same time can obviously inhibit normal rat intestinal movement reducing visceral sensitivity IBS rat small intestine propulsion rate. Conclusion: Tongxie yaofang effects spinal NMDA and GABA receptor can be a wide range of interactions in the visceral sensitivity IBS rat central sensitization.
【Keywords】visceral pain sensitivity, IBS, Tongxie yaofang, NMDA receptor, GABA receptors
肠易激综合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是临床最常见的胃肠功能性疾病，腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是IBS的一个主要临床亚型，约占所有IBS的60%左右，具有高发病率、反复难愈的特点[1]。IBS患者就诊的主要原因之一是腹部疼痛或腹部不适，内脏敏感性增高（VHL）始终是IBS的实验动物模型和临床患者必备的特征表现。已知脊髓背角作为脑－肠轴的“中继站”，是内脏敏感性调节和中枢敏化的关键部位[2]。近年来对IBS发病机制的研究显示，脊髓中枢对内脏感觉传入投射区域的敏感性升高是形成IBS内脏敏感性的重要机制[3-4]。N一甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-asnartate，NMDA)受体和r-氨基丁酸型(r-Aminobutyricacid，GABA)A型受体分别是中枢神经系统中重要的兴奋性和抑制性受体，对外周伤害性信息的传递和表达的调控起着主要作用[5]，NMDA和GABA A受体的交互作用在VHL中枢敏感化及慢性疼痛中起重要调控作用，能够为临床上研制治疗慢性病痛药物提供新的思路。本研究拟以内脏敏感性IBS-D大鼠为研究对象，予以痛泻要方干预，观察其腹部撤回反射(AWR)评分等内脏敏感性，通过检测其NMDA受体和GABAA受体的表达，探讨痛泻要方干预下IBS-D内脏敏感性模型大鼠GABAA受体和NMDA受体的中枢敏化的作用。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1动物
新生期SD大鼠, 清洁级, 出生后即进入实验, 建立新生儿母婴分离大鼠模型, 60d后大鼠成年, 体质量约200-300g, 实验动物由广东医学院实验动物中心提供。合格证号：SCXK(粤）2011-0017。
1.1.2药物：中药材由广东医学院附属医院提供，所有药材符合中华人民共和国药典规定。主要处方如下：痛泻要方：白术9g，白芍6g，防风3g，陈皮4.5g。处方比例取药材一定量，按1：10加入自来水煎煮，煮沸后30min后过滤出上清液，再按l：5加入清水，煮沸30min后过滤上清液，将两次所得的上清液混合搅均，用水浓缩到所需浓度，每毫升含生药2g，密闭保存于4℃冰箱中待用。根据陈奇主编的《中药药理研究方法学》，按照动物体表面积比率换算等效剂量法计算大鼠给药量，公式为：大鼠用量（g/kg）＝人原生药用量(g)×0.018×5。
1.1.3主要试剂
NMDA、GABAA多克隆抗体购于北京博奥森公司；兔抗人免疫组织化学试剂盒、鼠抗人免疫组织化学试剂盒及DAB显色剂试剂盒购于北京中杉金桥公司。Trizol试剂(美国Invitrogen)；SDS - PAGE仪( 美国BIO-RAD)；DY2CZ-40B 型电泳转移槽(北京市六一厂)；图像分析系统( 美国UVP)。RNA抽提按照试剂盒说明书常规提取RNA，采用UV一1601紫外分光光度仪测OD260。RT—PCR引物和内对照3一磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物由SANGON公司合成：组织RNA抽提试剂盒购自INVIRTROGEN公司：逆转录试剂盒购自PROMEGA公司；组织RNA保护液购自QIAGEN公司。严格按试剂盒的说明进行操作。
1.2 方法
1.2.1 模型建立: 用母婴分离方法建立大鼠模型[4], 实验方案得到广东医学院附属医院伦理委员会的批准。出生后第2-21天, 每天将新生期大鼠与哺乳期母鼠分离3h, 早上9:00始, 将哺乳期母鼠从笼中拎出, 将新生大鼠从笼中移出, 放至于另一个单独的笼中, 将此笼转移到隔壁房间中, 3h后, 将新生鼠放回最初笼中, 母子鼠团聚。饲养环境: 每周半量换鼠笼垫料, 新生鼠出生后第22天断奶, 30d分笼. 自由饮水、饮食, 室温控制(22℃±1℃), 湿度65%-70%, 光照周期12/12 h。IBS大鼠成年后(出生后约60 d)分为3组：正常对照组(control group)、模型组(model group)、痛泻要方组(Tongxie group), 每组10只, 正常对照组不予特殊处理, 模型组每天予以生理盐水3ml灌胃、痛泻要方组(100mg/kg)悬浊液约3ml灌胃, 1次/d, 第14天评价模型并取材。
1.2.2 腹部撤回反射(AWR)评分
禁食不禁水8～12 h，以减少粪便形成，并于实验前轻触肛门，使其排出残余粪便。从大鼠肛门置入扩张球囊，深度为6 cm，并将扩张球囊末端固定在大鼠尾巴上以防止其滑出。置大鼠于平台上，并限制其于一20cm x8 cm x8 cm透明塑料盒内，让大鼠适应15～20 min后进行CRD刺激和AWR评分。开始正式实验前，以上操作重复三次，以最大限度地减少应激因素对实验结果的影响。AWR评分是观察动物在清醒状态下，对不同分级的CRD所产生的腹部收缩等的反应定量评分，相应的评分标准参照Al—Chaer的方法[6-8]，具体如下：对CRD无行为反应，评为0分；给予刺激大鼠有动作停顿后并见短暂的头部运动行为，评为1分．刺激期间，见有腹部肌肉的收缩，评为2分；如有腹部抬起行为，评为3分；身体拱起，并抬起盆腔和阴囊者，评为4分。
1.2.3小肠推进率 完成直结肠扩张实验后，每只大鼠予印度墨汁0.3 ml 灌胃， 20 min 后，腹腔注射3%戊巴比妥( 40mg/kg) 麻醉，剖腹游离出小肠(十二指肠始端至回盲部) 平铺于白纸上，记录印度墨汁在小肠中移行距离及整段小肠长度，以印度墨水在小肠中移行距离占整段小肠长度的百分比值，作为小肠推进百分率来评价小肠推进运动情况。
1.2.4 切片制备各组大鼠实验前24h禁食不禁水，戊巴比妥钠腹腔注射(40mg/kg) 麻醉，将其固定后，将涂抹石蜡油的8F 导尿管插入实验大鼠结肠内，使气囊末端插入肛门内35mm，并在肛门外1.0cm 处将其固定在大鼠尾根部，使用注射器给气囊注入1.0ml蒸馏水［6］，刺激5min后，开胸经左心室至升主动脉插管，先以100 ml 生理盐水冲洗血液，随后用冷的(4 ℃) 含40g/L 多聚甲醛0.1mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)先快后慢灌流固定2h，取骶髓段置于300g/L 蔗糖溶液中(4℃) 直至组织沉底，恒冷箱切片机制备连续冠状切片，片厚30μm，而后将切片置于0.01mol/L PBS 中存放。
1.2.5 RT-PCR测定L6S1段脊髓和DCN脊髓NMDA NR1受体和GABAA受体mRNA的表达
Trizol(invitrogen)一步法提取总mRNA，M—Mulv逆转录酶催化合成第一链，RNA模板4uL，oligdT1uL，dNTPs2uL，RNAsin0.5uL，M—Mulv逆转录酶1uL，70°C 5 min，37℃反应60 min，90℃ 5 min。PCR扩增，逆转录产物2uL，上下游引物各1uL，2×PCRmix 12.5uL，调整总体积为25uL。扩增条件为95℃预变性5min，95℃ 变性30s，56℃ 退火30s，72°C延伸45s，最后72°C延伸10min。循环30次。引物设计如下，NR1上游引物为5’-AAGGAGTGGAACGGAATGAT一3’，下游引物5’-GCTTTACAGTTGcGTAGATGAA-3’； β-actin 上游引物5’-GTCACCAACTGGGACGATA-3’，下游引物5’-GAGGCATACAGGGACAACA-3’。 GABAA受体mRNA引物：上游引物5’-GCACAGACTGGATGGCTTAA-3’，下游引物5’-AAGGCAAGGATGCAGCAA-3’。NMDA NR1受体和β-actin的PCR产物分别为571bp和209bp。PCR产物于1.5％琼脂糖凝胶160V电泳30min。用凝胶图像分析系统(GDS8000，Gene Tools from Syngene software，英国)进行条带光密度分析，经β-actin校正得到相对光密度。
1.3 统计学处理
所有数据用SPSS16.0 for windoes 软件进行处理。全部资料用均数±标准差（x ±s）表示，先进行正态性和方差齐性检验。满足正态性和方差齐性者，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）；不满足正态性和方差齐性者，多组计量资料比较采用Krus?kal-Wallis H秩和检验，两两比较采用Wilcoxon秩和检验和Mann-Whitney U检验。
2 结果
2.1 痛泻要方对IBS大鼠的腹部撤回反射(AWR)评分的作用
实验分为三组, 正常对照组(N), 模型组(M), 痛泻要方干预组(TX), 正常对照组(N)11只大鼠，模型组(M)12只，痛泻要方干预组(TX)13只。结果显示, 在第六周时模型组和痛泻要方干预组在抬腹和拱背时压力分别为34.21±2.20mmHg，44.36±2.41mmHg；34.53±2.27mmHg，44.53±2.17mmHg；与正常对照组相比较，有显著性差异（P<0.05)，模型组和痛泻要方干预组在抬腹和拱背时压力之间比较没有显著性差异。在第八周时模型组和痛泻要方干预组在抬腹和拱背时压力分别为在32.24±1.75mmHg，45.63±2.72mmHg；45.63±2.72mmHg，56.12±2.78mmHg；与正常对照组相比较，有显著性差异（P<0.05)。模型组和痛泻要方干预组在抬腹和拱背时压力之间比较有显著性差异，痛泻要方干预后压力提高明显，差异有显著性差异(P<0.05)。
对数据进行统计学分析后发现，模型组脊髓腰膨大NR1受体mRNA相对光密度与正常对照组相比明显升高，GABAA受体mRNA相对光密度相比明显降低(P＜0．05)，说明1BS大鼠脊髓腰膨大部NR1受体基因转录水平明显升高，GABAA受体基因转录水平明显降低，而痛泻要方能显著降低NR1基因转录，提高GABAA受体基因转录。
3 讨论
肠易激综合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是临床最常见的胃肠功能性疾病，腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是IBS的一个主要临床亚型，约占所有IBS的60%左右，具有高发病率、反复难愈的特点[1]。IBS患者就诊的主要原因之一是腹部疼痛或腹部不适，内脏敏感性增高（VHL）始终是IBS的实验动物模型和临床患者必备的特征表现。现阶段，VHL在一定程度上已成为IBS的重要生物学标志，通过对IBS患者VHL的研究，将有助于完善和发展IBS机制，开发并评价治疗IBS新的药物以及判断IBS预后[9-10]。
痛泻要方组方出自《丹溪心法?卷二》，原方无方名，是最早提出治疗“痛泻”之病的专方，可以补脾胜湿而止泻，柔肝理气而止痛，使脾健肝柔，痛泻自止。目前以痛泻要方加减治疗IBS-D的报道及研究较多，在国际上也引起了人们的注意，荟萃分析也表明痛泻要方对IBS-D的有效率较高。痛泻要方的作用机制研究也成为近年的热点。研究显示[11]，其治疗1BS主要通过调节脑肠互动、镇痛、抑制平滑肌收缩、调节胃肠激素水平及抑制肠道高敏性等途径来实现。张涛等[12]通过建立脾虚肝郁型IBS大鼠模型及痛泻干预实验，证实了痛泻要方可能通过调节内脏敏感性阈值，改善肠道运动功能紊乱，发挥缓解脾虚肝郁型IBS大鼠症状的效应，推测内脏敏感性增高可以作为脾虚肝郁辨证的客观依据之一。
已知脊髓背角作为脑－肠轴的“中继站”，是内脏敏感性调节和中枢敏化的关键部位。而作为盆腔脏器初级传入信号的投射部位骶髓后联合核（DCN）核团中的神经元已被证实可以初步完成盆腔器官以及左半结肠产生的疼痛反应的调节与整和，可见脊髓背角和DCN在IBS内脏敏化中的作用不容忽视[14-15]。近年来对IBS发病机制的研究显示，脊髓中枢对内脏感觉传入投射区域的敏感性升高是形成IBS内脏敏感性的重要机制[16-17]。
N一甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-asnartate，NMDA)受体和r-氨基丁酸型(r-Aminobutyricacid，GABA)A型受体分别是中枢神经系统中重要的兴奋性和抑制性受体，对外周伤害性信息的传递和表达的调控起着主要作用[18]，NMDA和GABA A受体的交互作用在VHL中枢敏感化及慢性疼痛中起重要调控作用，能够为临床上研制治疗慢性病痛药物提供新的思路。
本研究以肝郁脾虚证内脏敏感性IBS-D大鼠为研究对象，以RT-PCR法检测脊髓腰膨大NMDA受体和GABAA受体mRNA的表达，并同时观察其内脏敏感性大鼠腹部撤回反射(AWR)评分及小肠推进运动，研究结果显示：模型组脊髓腰膨大NR1受体mRNA相对光密度与正常对照组相比明显升高，GABAA受体mRNA相对光密度相比明显降低，说明1BS大鼠脊髓腰膨大部NR1受体基因转录水平明显升高，GABAA受体基因转录水平明显降低，而痛泻要方能显著降低NR1基因转录，提高GABAA受体基因转录。实验第八周时模型组和痛泻要方干预组在抬腹和拱背时压力分别为在32.24±1.75mmHg，45.63±2.72mmHg；45.63±2.72mmHg，56.12±2.78mmHg；与正常对照组相比较，有显著性差异（P<0.05)。模型组和痛泻要方干预组在抬腹和拱背时压力之间比较有显著性差异，痛泻要方干预后压力提高明显，差异有显著性差异(P<0.05)。痛泻要方可以明显改善内脏敏感性大鼠腹部撤回反射(AWR)评分，同时能抑制正常大鼠的肠运动，能有效降低内脏敏感性IBS大鼠小肠推进速率。既往的研究发现在中枢神经,痛觉感受神经元同时接受抑制性GABAA能和兴奋性Glu能的突触支配，痛觉感受神经元构成了可供GABAA受体和NMDA受体相互作用的神经解剖学基础。相关电生理实验显示,脊髓GABAA能神经元去抑制，产生新的NMDA受体介导的突触后兴奋电流，可能是痛觉过敏形成的原因之一[19,20]。我们应用痛泻要方对内脏敏感性IBS大鼠的实验亦验证了以往对脊髓NMDA和GABA受体广泛的交互作用在VHL中枢敏感化的作用。
我们通过本项研究初探出痛泻要方干预肝郁脾虚型IBS-D大鼠脊髓NMDA和GABA受体广泛的交互作用在VHL中枢敏感化及慢性疼痛中作用机制。从分子生物学角度探讨肝脾失调在IBS-D中的作用机理及现代病理生理机制，深化我们对肝脾失调在IBS-D脑-肠互动VHL的中枢敏感化这一病机的认识，为肝脾失调的现代科学内涵提供新的依据。
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论文作者:于丰彦1,黄绍刚3,张海燕3,王颖1,童金生1,黄
论文发表刊物:《河南中医》2015年8月
论文发表时间:2016/6/1
标签：受体论文; 大鼠论文; 敏感性论文; 内脏论文; 脊髓论文; 引物论文; 模型论文; 《河南中医》2015年8月论文;