结论：黄皮新肉桂酰胺B抑制TNF-a形成并主要介导TLR4/MyD88/NF-ΚB信号通路中MyD88依赖信号通路抑制TNF-a形成。
关键词 黄皮新肉桂酰胺B；炎症因子；信号通路；RAW264.7细胞
支气管哮喘（简称哮喘）是由多种炎症细胞及生物活性介质参与的气道慢性炎症性疾病，是以淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润气道黏膜为特征表现为气道高反应性，伴有不同程度的上皮损伤、基底膜增厚、胶原沉积、平滑肌增生，进而引起急、慢性的气流受限和气道阻塞。气道炎症是哮喘的本质，哮喘的炎症反应是由多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子共同参与，其关系十分复杂。黄皮叶是芸香科植物黄皮属（Clausenalansium(Lour.)Skeels的干燥叶。《岭南采药录》中记载黄皮叶具有“疏风解表、除痰行气。治温病身热，咳嗽哮喘，气胀腹痛，黄肿，疟疾，小便不利，热毒疥癞的作用”[1]。相关研究[2-3]表明黄皮新肉桂酰胺B可通过调控Thl/Th2平衡达到减少炎症因子产生的作用，我们在前人研究的基础上探索其是否减少炎症因子TNF-a的产生，及其对TNF-a的调控作用是否通过LR4/MyD88/NF-ΚB/TNF-a信号通路，本研究探讨黄皮新肉桂酰胺B对炎症因子的调控作用及其调控分子机制，为黄皮叶的开发利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1仪器及试剂酶标仪: clontech公司，型号spectra max plus 384；ELISA试剂盒：上海杰泰生物技术公司；LPS:鼎国生物公司；培养基和胎牛血清：奥科生物公司；P-actin抗体购自奥科生物公司;TLR4抗体购自华美生物工程公司；NF-ΚB购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2药物的提取黄皮叶采自广西各地，经长沙医学院附属第一医院药剂科鉴定为芸香科植物黄皮属（Clausenalansium(Lour.)Skeels的干燥叶。黄皮新肉桂酰胺B的提取：干燥黄皮叶粗粉，用70%酒精回流提取3次，每次2h，收集滤液，用减压旋转蒸发仪40T浓缩，得浓缩稠膏状物体，真空干燥得黄皮新肉桂酰胺B，置于-20℃保存（批号:20180604)。使用时用DMSO溶解到最后体积为0.1%(DMSO对细胞生长没有影响
1.3细胞培养RAW264.7细胞(小鼠单核/巨噬细胞系）购自中南大学湘雅医学院生物研究所，用含10%胎牛血清、青霉素（100U/mL)及链霉素（100mg/mL)有酚红高糖DMEM培养液于5%CO2、37X和90%湿度条件下传代培养。
1.4LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-a分析 (1)以4x106个/孔接种于6孔培养板中，细胞贴壁后，每孔加入不同浓度LPS(0.1、1、10、100ng/mL)，另设空白对照组，24h后收集各组培养细胞的培养基，ELISA法检测培养基中TNF-a的水平，具体步骤按试剂盒说明书进行操作。（2)RAW264.7细胞以4x106个/孔接种于6孔培养板中，细胞贴壁后，每孔加入浓度为1ng/mL的LPS，分别在4、8、12、24、48h收集培养细胞的培养基，ELISA法检测培养基中TNF-a的水平，具体步骤按试剂盒说明书进行操作，在不同时间点均设置空白组作阴性对照。
1.5黄皮新肉桂酰胺B、LPS对RAW264.7细胞抑制率的影响MTT试验：RAW264.7细胞以1x106个/孔接种于96孔培养板中，细胞贴壁后，分别加入黄皮新肉桂酰胺B（25、50、100μg/mL)和LPS(1ng/mL)，第48小时加入5mg/mL的MTT液15|xL，4h后加入150μLDMSO，振荡10min，置入酶标仪中检测，490nm测定吸光度。
1.6 ELISA法测定黄皮新肉桂酰胺B对LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-a水平RAW264.7细胞以4x106个/孔接种于6孔培养板中，细胞贴壁后，实验分组：空白对照组、LPS组、黄皮新肉桂酰胺B不同浓度组(25、50、100μg/mL)。将黄皮新肉桂酰胺B加入细胞中干预，1h后加入LPS(1ng/mL)，48h后收集各组上清液，ELISA法检测培养基中TNF-a的水平。
1.7 ELISA法检测黄皮新肉桂酰胺B是否介导TLR4/MyD88/NF-ΚB/TNF-a信号通路对TNF-a分泌产生影响RAW264.7细胞以10x106个/孔接种于直径为10cm2的培养皿中，实验分组（文章中实验各分组代表都如此）：（1)正常组、（2)LPS组、（3)LPS+MyD88抑制剂组、（4)LPS+黄皮新肉桂酰胺B、（5)LPS+黄皮新肉桂酰胺B+MyD88抑制剂组。根据分组加入黄皮新肉桂酰胺B（50μg/mL)，1h后加入LPS(1ng/mL)，第46小时加入5mmol/LMyD88抑制剂，2h后收集各组细胞培养基及细胞，ELISA法检测培养基中TNF-a的水平；细胞用RIPA buffer (Thermo)提取总蛋白，-80℃冰箱保存。
1.8 Western Blot法测定黄皮新肉桂酰胺B对LPS诱导RAW264.7细胞中TLR4和NF-ΚB蛋白的影响提取总蛋白的蛋白含量测定使用Pierce?BCA蛋白含量测定试剂盒（Thermo)，根据蛋白的分子量选择不同浓度的分离胶和浓缩胶，蛋白于沸水中煮5min，跑胶完成后蛋白转至TVDF膜，一抗比例分别为:TLR4(1:1000)，NF-ΚB(1：5000)，p-actin(1:500)，一抗封闭过夜，洗膜后37X孵二抗1h，二抗浓度为1:5000，洗膜后使用X-ray曝光。
1.9统计学方法测得指标均用x±s表示，采用SPSS18.0软件包进行统计分析，组间比较采用F检验，两两比较采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 LPS诱导RAW264.7细胞对TNF-a分泌影响的结果不同浓度的LPS诱导RAW264.7细胞24h，均能增加TNF-a的分泌，当LPS浓度为1ng/mL时，TNF-a的分泌量最多。不同时间点诱导RAW264.7细胞，TNF-a的分泌随时间的增加而不断增多。见图1。
图1LPS不同浓度、不同时间点对RAW264．7细胞分泌TNF－α的影响
2.2黄皮新肉桂酰胺B、LPS对RAW264.7细胞抑制率的影响MTT试验显示，不同浓度黄皮新肉桂酰胺B、LPS(1ng/mL)均对细胞的生长无显著抑制作用。见图2。
图2黄皮叶提取物、LPS对RAW264．7细胞抑制率的影响
2.3黄皮新肉桂酰胺B对LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-a的影响与LPS组比较，黄皮新肉桂酰胺B不同浓度组，分别使TNF-a的分泌降低至30.2%、25.5%、21.8%，说明在一定的浓度范围内黄皮新肉桂酰胺B具有抗炎作用，且其效果随浓度增加而增加。见图3。
图3黄皮叶提取物对LPS诱导RAW264．7细胞TNF－α分泌的影响
2.4黄皮新肉桂酰胺B对TNF-a的分泌的影响LPS组与空白对照组比较，差异有统计学意义，说明LPS诱导细胞炎症模型成功；与LPS组比较，LPS+MyD88抑制剂组、LPS+黄皮新肉桂酰胺B组、LPS+黄皮新肉桂酰胺B+MyD88抑制剂组均能减少TNF-a分泌，LPS组与LPS+MyD88抑制组比较说明MyD88抑制剂有抑制炎症形成的效果，LPS组与LPS+黄皮新肉桂酰胺B比较说明黄皮新肉桂酰胺B具有抗炎效果，各组之间比较说明黄皮新肉桂酰胺B产生抗炎作用可能主要通过抑制MyD88依赖通路。见图4。
图4黄皮叶提取物通过介导TLR4／MyD88／NF-ΚB／TNF-α信号通路对TNF-α分泌的影响
2.5 Western Blot法测定黄皮新肉桂酰胺B对LPS诱导RAW264.7细胞中TLR4和NF-ΚB蛋白的影响与LPS组比较，LPS+MyD88抑制剂组、LPS+黄皮新肉桂酰胺B组、LPS+黄皮新肉桂酰胺B+MyD88抑制剂组分别使TLR4和NF-ΚB蛋白降低至74%、21%,70%、27%，44%、8.5%，进一步表明黄皮新肉桂酰胺B抗炎作用机制可能主要通过TLR4/MyD88/NF-ΚB/TNF-a信号通路中的MyD88依赖信号通路来完成。见图5。
图5黄皮叶提取物对LPS诱导RAW264．7细胞中TLR4和NF-ΚB蛋白的影响
3讨论
RAW264.7属小鼠巨噬细胞系，广泛分布于全身的免疫细胞，特别在肺组织中分布数量最多，巨噬细胞炎症应答是引起多种疾病的关键。根据巨噬细胞活化后功能不同，大致可分为经典活化巨噬细胞和替代活化巨噬细胞[4]。而经典活化巨噬细胞高表达促炎因子TNF-a、IL-1等；替代活化巨噬细胞则高表达抵抗素样分子家族蛋白、壳多糖酶等。LPS是革兰阴性菌的外膜的主要成分，在激活Toll(TLR4)样受体和激活炎症信号中起重要作用[5]。剌激TLR4信号通路可导致MyD88依赖途径和MyD88非依赖途径激活。而MyD88依赖性TLR4信号通路为多数病原相关分子模式如革兰阴性杆菌的内毒素脂多糖（LPS)、革兰阳性菌的肤聚糖（PCN)和脂磷壁（LTA)等所诱导[6]。
大量的研究已证明[7-8]，许多中药有抗炎作用。国外有文献报道黄皮新肉桂酰胺B中Lansiumamide B 和SB-204900有抗炎作用，包括抑制组胺的释放，lL-6、cox-2和TNF-a分泌，其抗炎作用可能通过抑制p38 MAPK通路的磷酸化[9-10]。而p38 MAPK通路的上游通路有MyD88依赖性通路和MyD88非依赖性通路，这给笔者提出了进一步研究依据。本研究使用LPS诱导细胞炎症模型；MTT试验证实黄皮新肉桂酰胺B及LPS均对细胞的生长无明显抑制作用；细胞炎症模型形成后，黄皮新肉桂酰胺B处理RAW264.7细胞，结果发现黄皮新肉桂酰胺B可以抑制TNF-a的形成；将试验分为5组，ELISA法检测TNF-a分泌情况，通过各组间的比较，发现黄皮新肉桂酰胺B抗炎作用机制可能主要通过TLR4/MyD88/NF-ΚB/TNF-a信号通路中的MyD88依赖信号通路；Western Blot法检测TLR4、NF-ΚB蛋白的表达，本研究结果进一步证明黄皮新肉桂酰胺B抗炎经上述机制抗炎。分析研究结果可知，黄皮新肉桂酰胺B通过抑制MyD88接头蛋白的激活，减少MyD88对下游因子NF-ΚB的激活，从而抑制NF-kB游离进入细胞核内，最终减少TNF-a的产生。目前黄皮研究甚少，仅有一些关于其单体的提取及作用方面的研究。因此笔者希望通过实验来挖掘黄皮叶不同的抗炎机制，为抗炎领域带来突破，也使黄皮叶的药理作用更充分的被人们认识及利用，在以后的实验中也将提取黄皮叶不同的单体成分来研究不同成分的作用及机制。
综上所述，通过实验发现黄皮新肉桂酰胺B对TNF-a有抑制作用，其机制可能主要通过TLR4/MyD88/NF-ΚB/TNF-a信号通路中的MyD88依赖信号通路来完成，黄皮新肉桂酰胺B是否可能存在其他抗炎途径，这还需要下一步的深入探讨。
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论文作者:杨华
论文发表刊物:《医师在线》2019年20期
论文发表时间:2019/12/5
标签：肉桂论文; 酰胺论文; 细胞论文; 炎症论文; 抑制论文; 蛋白论文; 诱导论文; 《医师在线》2019年20期论文;