1. 青岛大学药学院药理学系，中国山东、青岛，邮编266021
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3. 青岛大学附属医院 中国山东、青岛，邮编266100
通讯作者： 王蕾 qdwanglei67@126.com
摘要： 目的 获得人载脂蛋白A-I (apoA-I)重组蛋白原核表达的最佳条件。方法 研究由诱导温度、IPTG终浓度、IPTG诱导时间等对apoA-I重组蛋白表达量的影响。 结果 SDS-PAGE验证各不同条件下获得目的蛋白条带为29kd;结果显示重组大肠杆菌菌株的最佳条件为32℃、IPTG诱导浓度为1.0mmol/L以及IPTG诱导时间为 3h。结论 成功在大肠杆菌中诱导表达出来apoA-I，并筛选出apoA-I原核表达的最优条件。
关键词：载脂蛋白A-I、原核表达、条件优化
载脂蛋白A-I (Apolipoprotein A-I, apoA-I)是高密度脂蛋白（HDL）的主要成分，约占95％1，其在体内胆固醇逆向转运过程中发挥关键作用2。成熟apoA-I由243个氨基酸残基组成的单一多肽3，含有8个串联重复片段，为两性α螺旋4，此为apoA-I发挥在体内发挥作用的结构基础。
作者利用重组大肠杆菌实现了apoA-I在大肠杆菌中的原核表达，并对表达条件优化，获得重组蛋白的最大产量，为之后研究奠定基础.
1 材料和方法
1.1重组质粒
ApoA-I的pET-30b(+)重组表达质粒由实验室保存。
1.2试剂和仪器
异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、低分子蛋白标准、硫酸卡那霉素（Kan）购自北京索莱宝公司；胰蛋白胨、酵母粉购自Oxoid公司；TEMED购自Sigma公司；BCA试剂盒、5X SDS蛋白上样缓冲液购自碧云天公司。其他试剂均为国产分析纯。垂直电泳仪、高速冷冻离心凝胶成像分析系统。
1.3重组蛋白的原核表达
将大肠杆菌加入卡那霉素至30μg/ml，于在37℃，220rpm条件下振摇，直到培养至OD值为0.5~0.64，之后改变培养温度、IPTG诱导浓度及IPTG诱导时间进行最佳条件探究，数小时后，离心超声破碎菌体后离心。
1.4SDS-PAGE（12%）鉴定重组蛋白
配制分离胶10ml（12%）及配制浓缩胶4ml（4%）。加样前加热煮沸蛋白使之变性，每个孔加样20μl；电泳后染色脱色后使用成像系统拍照。
1.5重组蛋白原核表达的条件优化
1.5.1表达温度
将重组菌株按照1：100接种量分别接种到1 个含100 mL LB 液体培养基(含Kan 30μg/ml)三角瓶中, 于37℃条件下培养至OD600 为0.5-0.6 时加入IPTG 使其终浓度为1.0mmol/L, 后将菌液均分为4份, 分别于25、28、32和37℃诱导3 h。
1.5.2IPTG诱导浓度
同上培养至OD600 为0.5-0.6 时将菌液均分为4份, 加入IPTG 使其终浓度分别为0.5、1.0、1.5和2.0m/L,于37℃诱导3h。
1.5.3IPTG诱导时间
同上培养至OD600 为0.5-0.6 时加入IPTG 使其终浓度为1.0mmol/L, 37℃继续培养，分别于1、2、3、4、5和6h取样。
1.6纯化蛋白含量测定
纯化蛋白由SDS-PAGE鉴定，BCA法定量浓度。
2. 结果
2.1 温度、IPTG诱导浓度及时间的影响 最佳条件为32℃、1.0mmol/L IPTG、3h。
2.2 经镍柱纯化后蛋白量比较 由图2可知，优化组蛋白表达量相较于未优化组大大提高至3.18±0.374mg/ml。
3 结论
本研究通过条件优化得到载脂蛋白A-I的最佳温度为37℃，最佳IPTG诱导浓度为1mm，最佳IPTG诱导时间为3h，该研究将对之后载脂蛋白A-I的研究奠定了物质基础。
参考文献
1周细龙 et al. 载脂蛋白与动脉粥样硬化. 心血管病学进展, 152-156 (1991).
2Ren, F. & He, C. Gene Clone of Apolipoprotein AⅠ,Prokaryotic Expression and the Preparation of Polyclonal Antibody. Journal of Military Surgeon in Southwest China (2011).
3Li, W. H., Tanimura, M., ., Luo, C. C., Datta, S., . & Chan, L., . The apolipoprotein multigene family: biosynthesis, structure, structure-function relationships, and evolution. Journal of Lipid Research 29, 245 (1988).
4Borhani, D. W., Rogers, D. P., Engler, J. A. & Brouillette, C. G. Crystal structure of truncated human apolipoprotein A-I suggests a lipid-bound conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94, 12291-12296 (1997).
论文作者:闫莹1,2 石新艳3 王华3 王云龙2 王蕾1*
论文发表刊物:《医师在线》2019年第01期
论文发表时间:2019/3/4
标签：诱导论文; 蛋白论文; 脂蛋白论文; 浓度论文; 条件论文; 大肠杆菌论文; 青岛大学论文; 《医师在线》2019年第01期论文;