一、HCV全长基因真核表达载体的构建及其细胞内表达（论文文献综述）
曹增国[1]（2021）在《SARS-CoV-2编码蛋白抑制宿主Ⅰ型干扰素应答机制研究》文中认为新型冠状病毒病（Coronavirus disease 2019,COVID-19）,又称新型冠状病毒肺炎,是由新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）感染引起的、以肺炎为主要临床症状的、严重威胁人类健康及公共卫生安全的重要人兽共患传染病。时至今日,其感染人数和流行区域的空间范围已遍及全球,并演变为全球大流行。SARS-CoV-2在病毒分类学上属于冠状病毒科β冠状病毒属,该属病毒还包括在2002年出现的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）和在2012年出现的中东呼吸系统综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）,此三种病毒均可感染多种动物以及人类,并引起致死性呼吸系统疾病,这也使得冠状病毒成为21世纪严重影响全人类公共健康发展的主要阻力之一。此外,亦有4种地方流行性冠状病毒（分别为OC43、229E、NL63和HKU1）可感染人类,引起感冒等呼吸道疾病。SARS-CoV-2基因组为单股正链RNA,长约29.9 kb,被包装于直径约80 nm的病毒内腔中,可编码16个非结构蛋白（NSP1-16）、4个结构蛋白（S、E、M和N）以及若干个辅助蛋白（如ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8及ORF10等）。在SARS-CoV-2的生命周期中,非结构蛋白构成病毒复制酶参与病毒复制及RNA合成;结构蛋白负责形成病毒粒子并参与病毒感染;辅助蛋白与病毒毒力及致病机制密切相关,并参与调控病毒感染和免疫应答。作为宿主天然免疫的重要组成部分,干扰素应答参与构成了宿主机体抗病原微生物（如病毒）感染的第一道防线。干扰素是一类具有强大功能的细胞因子,可通过控制炎症反应、协调免疫应答直接诱导机体的抗病原微生物免疫应答,从而抵抗外来病原的入侵和感染。病毒感染诱导产生的干扰素可经由不同的信号转导途径,最终导致数百种干扰素刺激基因（IFN-stimulated genes,ISGs）的转录和表达,并进一步发挥抗病毒感染的作用。为阐明SARS-CoV-2编码蛋白在宿主I型干扰素应答（包括I型干扰素的产生及I型干扰素的信号转导）中的作用,并解析其作用的分子机制,本研究分别将SARS-CoV-2编码蛋白克隆至真核表达载体,转染HEK293T细胞,以体外表达病毒编码蛋白。随后逐一检测SARS-CoV-2各编码蛋白对宿主I型干扰素产生及信号转导通路的影响。随后,以对宿主I型干扰素应答具有抑制作用的SARS-CoV-2编码蛋白为研究对象,从“病毒-宿主”相互作用的角度,简单解析了其发挥抑制作用的分子机制。结果如下:（1）在I型干扰素产生通路中,3个非结构蛋白（NSP1、NSP6和NSP13）和1个辅助蛋白（ORF6）具有显着的抑制作用。其中,NSP6通过结合TANK结合激酶1（TANK binding kinase 1,TBK1）而下调干扰素调节因子3（Interferon Regulatory Factor 3,IRF3）的磷酸化水平,最终抑制IFN-β的产生通路,但NSP6与TBK1的结合并不会影响TBK1的磷酸化;NSP13通过结合TBK1并下调其磷酸化的方式,抑制IRF3的磷酸化激活,进而导致IFN-β的产生通路受到抑制;ORF6通过结合核转运受体蛋白KPNA2而抑制IRF3的入核转运,最终导致IFN-β的产生通路受到抑制。（2）在I型干扰素信号转导通路中,NSP1、NSP6、NSP7、NSP13、NSP14、ORF3a、M、ORF6、ORF7a、ORF7b均可显着抑制I型干扰素的信号转导通路。其中,NSP1、NSP6、NSP13、ORF3a、M及ORF7b通过下调信号转导和转录激活因子1（Signal transducer and activator of transcription proteins 1,STAT1）的磷酸化以抑制I型干扰素的信号转导通路;NSP6、NSP13、ORF7a及ORF7b通过下调STAT2磷酸化以抑制I型干扰素的信号转导通路;ORF6通过结合核转运受体蛋白KPNA2以限制STAT1的入核,并最终导致I型干扰素信号转导通路受到抑制。泛素作为重要的宿主因子,参与先天免疫的调节。而蛋白质泛素化是一种蛋白质翻译后修饰方式,在许多生物学过程中发挥着重要作用。以上述具有抑制宿主I型干扰素应答功能的SARS-CoV-2编码蛋白作为研究对象,研究泛素化在其抑制宿主I型干扰素应答中的作用。结果发现:NSP13、ORF3a和ORF7a均存在泛素化修饰。通过对ORF7a泛素化修饰特性分析可得,SARS-CoV-2 ORF7a主要在第119位赖氨酸残基处发生K63多聚泛素化修饰。随后经过点突变,以丙氨酸（Alanine,A）替代第119位赖氨酸（Lysine,K）,构建ORF7a泛素化缺陷型突变（ORF7a-K119A）。并比较其与野生型ORF7a（ORF7a-WT）在抑制I型干扰素信号转导方面的差异,最终证明SARS-CoV-2 ORF7a通过泛素化修饰增强其抑制STAT2磷酸化的能力,从而加强其对宿主I型干扰素信号转导通路的抑制作用。基于SARS-CoV-2反向遗传学系统,通过分子生物学手段将海肾荧光素酶（Renilla luciferase,Rluc）基因插入并替换SARS-CoV-2（毒株2019-n CoV/USAWA1/2020）全基因组第21,563-28,259位核苷酸（包括结构蛋白基因S、M、E及辅助蛋白基因ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8）,成功构建了SARS-CoV-2复制子系统。随后使用可有效抑制SARS-CoV-2复制的药物瑞德西韦（Remdesivir）验证了该复制子系统的实用性,结果证明该复制子系统可以作为一种有效的工具,在抗病毒药物筛选及评价不同环境下病毒复制能力中的实用性。最后本研究将该复制子系统应用于比较三种高致病性冠状病毒（SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV）NSP1和NSP6抑制宿主I型干扰素信号转导活性对病毒复制效率的影响中,证明了SARS-CoV-2非结构蛋白NSP1、NSP6在抑制宿主I型干扰素信号转导中具有较高的活性,而这可能最终导致了SARS-CoV-2具有比SARS-CoV和MERS-CoV更强的复制能力。综上所述,本研究筛查了SARS-CoV-2对宿主I型干扰素应答具有抑制作用的蛋白,并从“病毒-宿主”相互作用的角度,分别解析了各个病毒蛋白在I型干扰素产生和信号转导中发挥抑制作用的分子机制,为冠状病毒疫苗研发及抗病毒药物筛选提供了理论依据。此外,本研究还建立了携带海肾荧光素酶报告基因的复制子系统,降低了相关研究的安全等级,有利于相关研究在普通实验室的开展。
高明春[2]（2021）在《IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制》文中进行了进一步梳理牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza 3 virus,BPIV3）是引起犊牛呼吸道感染的重要病原体之一,世界各国的牛群感染BPIV3的抗体阳性率通常在50%到90%之间。BPIV3可感染肺上皮细胞与肺泡巨噬细胞,发生组织损伤和免疫抑制,随后继发细菌感染导致严重的支气管肺炎。IL10（Interleukin10,IL10）是极少数具有强大的负调节功能的抗炎性细胞因子,上皮细胞、单核巨噬细胞等都是IL10发挥抑制性作用的靶细胞。许多病毒感染后依靠多种途径诱导宿主IL10表达来负调控宿主免疫应答,IL10负调控免疫应答的相关机制在HIV（Human immunodeficiency virus）、FMDV（Foot-and-Mouth disease virus）、LCMV（Lymphocytic choroid meningitis virus）、PCV2（Porcine circovirus type 2）、PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）等病毒的致病机制中发挥重要作用,BPIV3感染中IL10是否及如何调控免疫应答尚未清楚。本研究分离BPIV3流行毒株并分析其致病特征,证实BPIV3流行株能够感染牛与鼠的上皮细胞与单核巨噬细胞。建立小鼠呼吸道感染模型与鼠原代巨噬细胞感染模型。以小鼠与原代巨噬细胞的高通量转录组数据证实BPIV3可能利用IL10及其重要的下游产物SOCS3（Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3）下调宿主的抗感染免疫应答。随后开展了牛IL10、IL10R1、SOCS3的生物学活性与作用机制研究,证实牛IL10与IL10受体结合转导信号,激活JAK-STAT3通路来迅速高表达SOCS3,在小鼠与牛细胞上都具有类似的生物学活性。最终探索了BPIV3主要依赖My D88、p38 MAPK以及NF-κB信号通路来表达IL10,负调控宿主抗病毒应答并提高BPIV3复制能力的相关机制。本研究为阐明IL10/STAT3/SOCS3信号轴在BPIV3感染中的致病作用和抑制IL10通路防制牛呼吸道传染病奠定了理论基础。首先对2017年黑龙江省、河北省等地的群发犊牛肺炎1793份血清进行了BPIV3的抗体调查,结果表明近70%的犊牛呼吸道疾病可部分归因于BPIV3所参与的感染。随后自病牛鼻拭子中分离到了一株BPIV3,其具有感染MDBK、BHK21、BBEC、BL、BTB、BT、ML、PBMC、BMDM等牛与小鼠多种上皮细胞与单核巨噬细胞的能力。分离株经呼吸道感染小鼠肺脏并对其进行了致病性的分析,感染鼠肺脏发生病理变化,并且肺内病毒在12 d内不能够被完全清除,感染肺脏发生了多种炎性因子的表达,检测到重要的调节性抑炎性因子IL10在感染后的12 d之内,大多数检测时间点的转录均显着高于对照。通过高通量转录组测序、差异表达分析与基因富集及蛋白质相互作用网络分析,在小鼠与原代巨噬细胞感染BPIV3前后重要宿主免疫与调控分子的变化模式。BPIV3感染小鼠与感染巨噬细胞后,在感染早期显着上调了IL10与SOCS3表达,SOCS3几乎在所有分组中都得到了显着的转录激活。大多数组别中Tyk2、STAT1、STAT2、IRF7、ISG15、Mx1、RSAD2、PML等关键抗感染免疫基因被显着下调,IL10与SOCS3参与了BPIV3感染后抑制宿主抗病毒应答。为进一步研究牛IL10的信号转导以及其是否能发挥免疫负调控作用,克隆了牛IL10、牛IL10R1与SOCS3基因并分析其生物信息与进化保守性。对IL10、IL10R1胞外区与SOCS3进行了蛋白表达与纯化,并制备了相应的高效价抗体。采用腺病毒系统表达了牛IL10、IL10R1胞外区,然后在牛与鼠细胞上证实重组IL10可快速并强烈诱导SOCS3的表达,这种作用可以被IL10R1胞外区所抑制。IL10与SOCS3都具有抑制Ⅰ型干扰素及其下游分子表达的功能,即牛IL10与SOCS3可用于牛与鼠细胞的负免疫调控研究,而IL10R1胞外区可作为IL10通路的阻断剂。进一步探讨BPIV3感染中IL10参与负调控的相关机制,研究表明BPIV3以时间与剂量依赖性的方式诱导原代巨噬细胞与肺上皮细胞在感染极早期迅速上调IL10的m RNA并大量分泌IL10蛋白,同时TNF-α与Ⅰ型干扰素及其下游蛋白Mx1的表达受到了显着的抑制。IL10在原代巨噬细胞中的产量远高于上皮细胞,外源与内源性的IL10都可提高BPIV3的滴度。IL10R1胞外区作为游离的受体竞争掉IL10或抑制剂阻断IL10产生的通路都能降低病毒的复制能力。在My D88（Myeloid differentiation factor,MYD88）缺失与My D88抑制剂处理的BMDM细胞上,IL10/SOCS3的表达大幅降低,表明依赖My D88分子转导信号的通路在BPIV3感染过程中诱导IL10的表达起到了重要作用。此外,应用通路抑制剂证实NF-κB和p38 MAPK在BPIV3诱导IL10表达中为关键通路。JAK-STAT通路中的多种JAK与STAT分子均参与IL10与BPIV3之间复杂的调控作用。综上所述,BPIV3是我国犊牛传染性肺炎的主要病原之一,感染后可显着上调IL10与SOCS3的表达并引起宿主免疫抑制,主要下调以Ⅰ型干扰素及其下游分子介导的抗病毒应答,这种由IL10介导的负调控依赖于My D88、NF-κB和p38 MAPK信号通路。本研究可为进一步阐明BPIV3的分子致病机制与开发以调控IL10为靶标的免疫防控提供理论基础。
张惠惠[3]（2021）在《樱桃谷肉鸭DDX1介导的信号通路和抗NDRV活性研究》文中研究指明当宿主受到病原微生物感染时,先天性免疫系统会通过病原分子模式识别受体（Pattern recognition receptors,PRRs）识别病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）,激活下游信号通路来诱导宿主产生效应分子和炎症反应,而解旋酶蛋白作为一种细胞质核酸识别器,在先天性免疫反应中发挥着重要的作用。DEAD-box RNA解旋酶构成了最大种类的核酸解旋酶,是一个极为保守的RNA结合蛋白家族,因包含独特的Asp-Glu-Ala-Asp（DEAD）序列基序而被命名,它除了可以作为依赖三磷酸腺苷（ATP）的RNA解旋酶发挥作用,以促进各种细胞活动中RNA结构的改变,还可以作为代谢性疾病发生的传感器。DEAD-box解旋酶1（DEAD-box helicase1,DDX1）属于DEAD-box RNA解旋酶家族的一员,其在1993年首先于成视网膜细胞瘤和成神经细胞瘤中被发现,它能够识别双链RNA（double-stranded RNA,ds RNA）病毒,在宿主的先天性免疫反应中可以通过调节干扰素（Interferons,IFNs）的表达进而影响抗病毒免疫反应。新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）作为一种新型传染病,是正呼肠孤病毒属的一员,属于ds RNA病毒,其病理变化表现为肝脏和脾脏有出血点和坏死灶。该病发病率高且宿主范围广,严重的会因继发感染而死亡,因缺乏有效的预防方法而给水禽养殖业造成严重的经济损失。DDX1在抵抗病毒感染的先天性免疫系统中起着至关重要的作用,但是尚未阐明鸭DDX1（duDDX1）在抗NDRV感染中的作用。所以本实验首次研究了樱桃谷肉鸭DDX1的生物学功能及其在抗NDRV先天性免疫应答中的作用。主要研究成果如下:第一部分樱桃谷肉鸭DDX1基因的克隆、鉴定和生物学分析根据NCBI上预测的鸭DDX1引物序列,从健康樱桃谷肉鸭的脾脏中提取RNA,并反转录为cDNA从而克隆出duDDX1的全长编码序列（Full-length coding sequence,CDs）,duDDX1全长由2223 bp组成,编码740个氨基酸残基,分子量约为82 k Da,并构建了真核表达质粒pcDNA3.0-duDDX1-Flag。通过生物学分析,我们发现duDDX1包含DEXDc结构域、HELICc结构域和SPRY结构域,且与鸡的DDX1的同源性最高,在系统进化树上可见与Anas platyrhynchos的亲缘关系最近。第二部分DDX1在樱桃谷肉鸭中的分布情况分别提取了健康鸭的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、大脑、小脑、肌肉、盲肠、回肠、空肠、十二指肠、气管、法氏囊、肌胃、腺胃、皮肤、食道、胰腺和脑干等组织的RNA来确定duDDX1在各个组织中的分布情况。荧光定量PCR实验发现duDDX1广泛分布于所有被检测的组织中,尤其在十二指肠、肝脏和脾脏中的表达量较高。用NDRV感染鸭的实验结果表明duDDX1的表达量在肝脏中显着上调,在脾脏中显着下调,这提示在感染NDRV的两个器官中,duDDX1的特异性反应是不同的,宿主可能主要通过上调肝脏中duDDX1的表达参与抗病毒免疫反应。第三部分duDDX1通过介导IFN-β相关信号通路参与鸭的先天性免疫应答在DEF细胞中过表达duDDX1后,通过荧光定量PCR检测发现,Toll样受体（TLR2、TLR3和TLR4）的表达水平显着上调,但是MDA5和RIG-I的表达量无明显变化,另外还显着上调了OAS、IL-8、IL-1β和IFNs的表达量。通过双荧光素酶实验发现IFN-β启动子的转录活性被显着激活,同时激活了转录因子IRF-7和NF-κB的活性,证明IRF-7和NF-κB启动子均参与调节duDDX1诱导的IFN-β信号通路的激活。在过表达duDDX1并用NDRV刺激DEF细胞后,TLR3的表达量下调,但TLR2和TLR4的表达量均上调,同时MDA5和RIG-I无明显变化。其他细胞因子例如OAS、Mx和IL-6的表达量显着下调。在敲低duDDX1表达量的反向实验中,可以看到duDDX1调节部分PRRs、细胞因子和抗病毒蛋白的表达,例如在36 hpi,IFN-β上调2.1倍（P<0.001）,IL-6下调2.4倍（P<0.001）,IL-8下调2.0倍（P<0.001）。这表明duDDX1可能通过介导IFN-β相关信号通路参与鸭的先天性免疫过程。第四部分duDDX1具有抗NDRV活性在DEF细胞中转染pcDNA3.0-duDDX1-Flag或空载体并用NDRV感染细胞,我们发现过表达duDDX1在早期阶段能显着抑制NDRV的复制,通过在DEF细胞上的干扰实验也进一步验证了上述结论。实验表明,过表达duDDX1会抑制NDRV的复制,duDDX1具有抗NDRV活性。
王静[4]（2021）在《鸡Viperin蛋白与ALV-J相互作用的研究》文中认为禽白血病（Avian Leukosis,AL）是一种世界分布性疾病,由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）引起的禽类多种肿瘤性疾病,该病呈世界性分布,在我国被列为二类动物疫病。本病对养禽业造成了诸多方面的危害,可引起感染鸡免疫抑制和多组织器官发育迟缓,机体免疫力下降,使病禽继发感染多种疾病,严重影响其生产性能,还可通过垂直传播危害子代。有研究显示,ALV还可以污染禽用弱毒疫苗,给养殖场带来巨大威胁。目前,尚无有效的疫苗或药物应用于该病的治疗,采取严格的监测和净化措施是防控该病的主要方式。Viperin是一种干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes ISGs）能被多种病毒和细菌诱导表达,已证实具有抑制病毒复制、免疫调节和代谢调节的功能。目前,未见Viperin蛋白抑制ALV复制的相关报道。为研究鸡Viperin蛋白与ALV-J复制的相互影响,本研究首先建立了鸡Viperin基因表达水平的实时荧光定量PCR检测方法。分离鸡外周血淋巴细胞,利用RT-PCR扩增鸡Viperin基因,构建了包含Viperin全长CDs的重组质粒。随后优化反应条件,对所建立方法的敏感性和重复性进行验证。结果显示,所建立的实时荧光定量PCR方法在107-102拷贝/μL范围内呈现良好的线性关系,最低检测限度为100拷贝/μL;重复性良好,组内和组间变异系数均小于2%。应用所建立的实时荧光定量PCR方法检测1日龄正常SPF鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、脑、外周血淋巴细胞、骨髓等组织器官的Viperin基因拷贝数,结果显示Viperin具有广泛的组织分布性。由于鸡Viperin基因与哺乳动物Viperin基因同源性差异较大,为便于后续试验,本研究表达了鸡Viperin蛋白并免疫小鼠制备多抗,将鸡Viperin基因克隆至pET32a（+）载体中构建原核表达质粒并转化至大肠杆菌BL21中,在30℃条件下加入IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明Viperin重组蛋白以包涵体的形式表达。将蛋白与弗式佐剂乳化后颈背部皮下注射BALB/c小鼠,三免后收集小鼠血清。采用Western-Blot方法确定制备多克隆抗体的特异性,检测发现该多克隆抗体可特异性识别Viperin真核表达蛋白。鸡Viperin基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及鸡Viperin蛋白多抗的制备为后续实验提供了材料基础。ALV-J SDAU1005株分别接种CEF细胞和1日龄SPF鸡,通过建立的实时荧光定量PCR方法检测Viperin基因的转录水平,研究ALV-J感染对鸡Viperin基因表达的影响。将SDAU1005株接种CEF,感染后12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h收集细胞,提取总RNA,分析ALV-J感染后Viperin基因表达量。结果显示,感染病毒的CEF细胞及SPF鸡血液中Viperin基因的转录水平均明显升高,96 h时细胞中Viperin转录水平达到峰值,相应的ALV-J转录水平显着下降。为探索Viperin对ALV-J复制的影响,本研究通过过表达技术和RNA干扰技术在体外培养的细胞层面进行了检测。构建带有V5标签的真核表达质粒pcDNA-Viperin,并将其转染细胞,发现过表达Viperin可以有效干扰病毒的复制。随后,设计并合成了针对Viperin的特异性si RNA,并转染细胞。结果发现,干扰Viperin的表达产生能促进病毒复制和释放。上述结果表明,Viperin能够在体外培养的细胞上抑制ALV-J的复制。分别设计引物扩增Viperin三个活性区域的基因片段,连接至pEGFP-N1载体,构建pEGFP-N、pEGFP-SAM和pEGFP-C真核质粒,明确其作用区域。质粒转染CEF细胞后在荧光显微镜下观察到特异性绿色荧光,表明质粒转染效果良好且能表达相应蛋白。将ALV-J感染转染了相应质粒的CEF细胞,评估Viperin各区域在ALV-J复制过程中的作用。发现在转染pEGFP-N质粒的细胞中,病毒复制受到抑制,而转染pEGFP-SAM和pEGFP-C真核质粒则对ALV-J复制没有影响,证明Viperin-N活性区域在抗ALV-J复制中发挥重要作用。进一步筛选与Viperin互作的蛋白,设计引物扩增ALV-J各蛋白对应的基因片段,连接至pC-flag载体,构建了ALV-J不同编码蛋白的真核表达质粒,将各质粒与pcDNA-Viperin质粒共同转染细胞,通过激光共聚焦和免疫共沉淀实验检测Viperin与病毒基因的相互作用。激光共聚焦实验结果显示p19蛋白与Viperin共定位,免疫共沉淀实验同样确认这一结果,即证实p19蛋白与Viperin可以发生相互作用。综上所述,Viperin是抑制病毒的天然免疫因子,ALV-J感染可以诱导Viperin在体内和体外的表达;Viperin通过与p19蛋白相互作用,从而抑制ALV-J的复制,其中N结构域是Viperin发挥抗病毒作用的关键域。本文的研究加深Viperin抗病毒作用机理的认识,扩大其抗病毒谱范围,为进一步探究Viperin蛋白抵抗ALV-J的作用机理提供依据。
徐玲玲[5]（2021）在《RTP4与IZUMO1的相互作用以及对受精的影响》文中研究表明哺乳动物通过有性生殖的方式繁衍后代,受精是有性生殖得以实现的最重要一环。受精的整个过程包括精子获能、透明带识别反应、顶体反应以及最终的精卵膜融合。已知精子上的IZUMO1和卵细胞膜上JUNO是实现精卵膜融合的必需分子。然而仅有IZUMO1和JUNO只能使细胞粘附,不足以使细胞膜融合,因此哺乳动物精卵膜融合应该是一个多分子协作的过程,一定存在其它分子来协助IZUMO1和JUNO发挥作用。本实验鉴定了RTP4与IZUMO1和JUNO的相互作用以及对受精的影响,为认识精卵膜融合机制积累了新资料。首先,克隆了大鼠rtp4的cDNA。构建了pGAD-rtp4酵母表达载体和pCMVC-Flag-rtp4真核表达载体。其中pGAD-rtp4分别与实验室保存的pGBK-Izumo1和pGBK-juno进行酵母双杂交。结果表明RTP4与IZUMO1存在相互作用,但与JUNO不存在相互作用。接着,用pCMV-C-Flag-rtp4与实验室保存的pCMVC-HA-Izumo1共同转染293 T细胞,免疫共沉淀实验进一步确认了RTP4与IZUMO1存在相互作用。然后,构建pET-28a-rtp4原核表达载体,转化E.coli BL21（DE3）表达并纯化得到HIS-RTP4融合蛋白。用纯化后的HIS-RTP4融合蛋白免疫小鼠,得到RTP4腹水多克隆抗体。以自制的RTP4腹水多克隆抗体为一抗,对小鼠睾丸和卵巢组织切片进行免疫荧光染色。结果显示:RTP4在小鼠睾丸中表达于精原细胞、精母细胞和支持细胞的细胞质中,并且存在于成熟的精子中;在小鼠卵巢中表达于卵丘细胞的细胞质中和卵子的细胞膜上。此外,以自制的RTP4腹水多克隆抗体为一抗,对大小鼠的精子和小鼠MII期卵子进行定位发现:RTP4定位于顶体反应前大鼠精子的顶体和尾部,顶体反应后大鼠精子的头部前端且少量存在于尾部前半段;定位于顶体反应前小鼠精子的顶体和尾部前半段,顶体反应后小鼠精子的整个头部和尾部前半段;定位于小鼠MII期卵子的细胞膜上。另外,以自制的RTP4腹水多克隆抗体和兔抗IZUMO1血清多抗为一抗,在大鼠和小鼠精子上进行了RTP4与IZUMO1共定位观察。结果发现:顶体反应前,RTP4与IZUMO1共定位于大鼠和小鼠精子的顶体处,但顶体反应后没有共定位。最后,利用自制的RTP4腹水多克隆抗体分别处理小鼠的精子和卵子,并进行体外受精,结果发现:RTP4对小鼠体外受精率的影响不显着。实验发现,RTP4与IZUMO1存在相互作用,并且在大鼠和小鼠的生殖组织、生殖细胞中均有表达。推测RTP4可能参与了精卵融合事件。
岳山[6]（2021）在《牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS4B抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制研究》文中认为牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）属于单股正链RNA病毒,BVDV是黄病毒科、瘟病毒属的成员,主要引起牛的腹泻、发热、白细胞减少、口腔及消化道黏膜糜烂和坏死、怀孕母牛流产或产畸型胎儿等为特征的一种接触性传染病,急性病毒感染可引起免疫抑制,妊娠30-120日龄感染引起犊牛持续性感染和免疫耐受。本病在世界各国牛场普遍存在,给畜牧业生产造成严重的经济损失,世界动物卫生组织（OIE）将其列为进出口动物贸易必须检疫疫病,我国列为二类疫病。先前研究显示BVDV基因组编码的非结构蛋白Npro和结构蛋白Erns（E0）能够抑制宿主先天性免疫应答,非结构蛋白NS4B在病毒复制复合物中起到关键支架作用,但是,关于其在病毒发病机理中的作用知之甚少。本研究主要对BVDV基因组编码的NS4B蛋白在先天性免疫应答过程中的作用进行探究,并阐明其在RIG-I样受体（RIG-I like receptors,RLRs）介导的I型干扰素信号通路中的作用及其分子机制。首先,本研究构建了p CDNA3.0-HA-NS4B真核表达质粒,通过PCR扩增NS4B基因,胶回收和酶切后对目的基因及表达载体进行连接,经过转化和双酶切鉴定后,将鉴定正确的重组质粒p CDNA3.0-HA-NS4B转染至HEK-293T和MDBK细胞中,Western blot验证NS4B的表达;进一步应用双荧光素酶报告基因、实时荧光定量PCR和ELISA方法验证NS4B对I型干扰素的影响。结果显示,经Western blot检测NS4B在39 KDa处出现明显的目的条带,证明真核表达载体构建成功。通过双荧光素酶报告基因和实时荧光定量PCR检测发现BVDV NS4B显着抑制Se V诱导的IFN-β启动子的激活,并呈剂量依赖性,同时NS4B抑制HEK-293T和MDBK细胞中IFN-β的m RNA水平。ELISA检测结果发现NS4B抑制Se V诱导的HEK-293T细胞上清液中IFN-β的分泌。研究表明BVDV NS4B具有抑制I型干扰素的特性。其次,为深入探究BVDV NS4B通过何种机制抑制RLRs介导的I型干扰素应答,通过对RLRs通路中下游信号分子IRF3的磷酸化检测发现过表达BVDV NS4B后能抑制HEK-293T细胞中的IRF3磷酸化水平,通过双荧光素梅报告基因检测NS4B与RLRs信号通路中的关键信号分子对IFN-β启动子的激活,发现NS4B显着抑制MDA5诱导的IFN-β表达。随后过表达NS4B,通过实时荧光定量PCR检测各信号分子的转录水平,发现在HEK-293T细胞转染后12 h和24 h两个时间段NS4B均降低了MDA5的m RNA水平,而在MDBK细胞转染后24 h也显着降低了MDA5的m RNA水平。再次通过免疫共沉淀试验证明了NS4B与MDA5相互作用,并且激光共聚焦检测确定NS4B与MDA5存在共定位现象,并定位于细胞质中。研究表明BVDV NS4B通过与MDA5相互作用抑制I型干扰素通路的激活。最后,为深入探索BVDV NS4B与MDA5中哪个结构域存在相互作用,构建了MDA5三个不同结构域的真核表达载体质粒,经Western blot验证,结果显示2CARD、HEL、CTD分别在34 KDa、70 KDa和20 KDa处出现明显的目的条带,通过免疫共沉淀试验发现BVDV NS4B与MDA5中的2CARD结构域相互作用。激光共聚焦检测发现NS4B与MDA5-2CARD存在共定位现象,并定位于细胞质中。综上所述,本研究证明了BVDV NS4B蛋白与RLRs信号通路MDA5结构域中的2CARD区相互作用来负调控I型干扰素的表达。进一步提高了对BVDV非结构蛋白参与逃避宿主先天性免疫应答机制的理解,为深入了解BVDV致病机理奠定了理论基础。
黄雯静[7]（2021）在《m6A甲基化修饰调控牛病毒性腹泻病毒NS5A的表达》文中研究说明牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV）属于黄病毒科、瘟病毒属,单股正链RNA病毒。NS5A是一种具有亲水活性的病毒非结构蛋白,黄病毒科各成员中的NS5A通过丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化,其在病毒生命周期具有一定的作用。据报道黄热病毒、丙型肝炎病毒等黄病毒科病毒基因组多个位点存在m6A甲基化修饰现象,NS3和NS5区域内富集了m6A位点,潜在保守的m6A位点可以调节病毒的成熟过程。研究表明m6A可机械调节丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）颗粒的产生,敲低m6A甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase like 3,METTL3）、甲基转移酶样蛋白14（methyltransferase like 14,METTL14）后显着增加了HCV NS5A蛋白的丰度;相反,敲低m6A去甲基化酶肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein,FTO）后,NS5A蛋白表达明显降低。由于BVDV NS5A与HCV NS5A的结构和功能极为相似,推测m6A也可调控BVDV NS5A蛋白的表达水平,进而影响病毒颗粒的产生。本研究探讨了BVDV复制对m6A甲基化修饰的影响以及BVDV NS5A蛋白与m6A甲基化蛋白的关系,为深入了解m6A甲基化修饰调控病毒复制的分子机制奠定基础。首先,为了确定感染BVDV后MDBK细胞中的m6A甲基化水平变化,在病毒感染细胞后用q-PCR和Western-blot检测了甲基转移酶METTL3、METTL14和去甲基化酶FTO的转录和表达水平,以及甲基化结合蛋白YTH结构域蛋白YTHDF1（YTH domain-containing family protein 1）,YTHDF2（YTH domain-containing family protein2）,YTHDC1（YTH domain-containing protein1）的转录水平。结果显示,CP和NCP型BVDV感染后METTL3的转录和蛋白表达水平均下降,FTO的转录和蛋白表达水平均升高,YTHDF1转录水平下降,YTHDF2、YTHDC1转录水平均升高。研究表明CP和NCP型BVDV感染影响m6A甲基化蛋白的表达。其次,通过PCR扩增、胶回收、双酶切鉴定目的基因及表达载体、连接与转化等方法,构建了pcDA3.0-METTL3、pcDA3.0-METTL14、pcDA3.0-FTO真核表达质粒。将上述鉴定正确重组质粒通过磷酸钙法转染至293T细胞中,进行Western blot验证。结果显示,在64KDa、52KDa、58KDa处出现明显的目的条带,与预期大小一致。研究表明成功构建了牛METTL3、METTL14、FTO蛋白真核表达载体,并对牛METTL3和FTO蛋白进行生物信息学分析,对为后续研究奠定了基础。第三,利用生物信息学软件预测了牛METTL3蛋白与NS5A蛋白的互作,并利用Co-IP等方法验证其互作关系。预测结果表明牛METTL3蛋白与NS5A蛋白具备互作的可能性。将NS5A与METTL3质粒共转染至293T细胞中,通过Co-IP方法进行正反向互作分析。结果显示,METTL3蛋白与BVDV NS5A蛋白发生共沉淀;初步证明BVDV NS5A蛋白与甲基转移酶METTL3存在相互作用。在293T细胞中,过表达甲基转移酶METTL3蛋白能使BVDV NS5A蛋白表达量降低,过表达去甲基化酶FTO蛋白能使BVDV NS5A蛋白表达量升高,过表达BVDV NS5A蛋白能使甲基转移酶METTL3蛋白表达量降低,并使去甲基化酶FTO蛋白表达量升高。在MDBK细胞中,过表达甲基转移酶METTL3,能抑制病毒的复制。综上所述,本研究证明了CP和NCP型BVDV感染MDBK细胞后能够影响m6A甲基化蛋白表达水平;BVDV NS5A蛋白与甲基转移酶METTL3有相互作用,在293T细胞中过表达METTL3能使NS5A蛋白的表达量降低,过表达FTO能使NS5A蛋白的表达量升高。而过表达BVDV NS5A蛋白能是使METTL3的表达表达量降低,FTO的表达量升高。在MDBK细胞中,过表达甲基转移酶METTL3,能抑制病毒的复制。本研究为深入了解BVDV NS5A蛋白的功能及m6A甲基化修饰调控病毒复制的分子机制奠定了基础。
宫晓华[8]（2021）在《ATG16L1囊泡转运在口蹄疫病毒内体运输过程中的效应机制研究》文中研究指明病毒是一种由核酸和蛋白质外壳构成的非细胞生命形态,必须利用宿主细胞中的物质和能量来完成自身的生命活动。作为重大动物疫病口蹄疫（FMD）的病原,口蹄疫病毒（FMDV）主要通过识别三种不同类型的细胞表面受体分子,由网格蛋白或小窝蛋白介导的内吞作用路径入胞,在酸性内体中脱壳后,释放基因组RNA以完成病毒复制周期的后续步骤。FMDV侵染易感细胞能够激活并调节自噬,不同病毒蛋白在细胞自噬的作用和自噬相关蛋白（ATGs）在FMDV感染过程中复杂作用研究备受关注。本论文以FMDV的生命周期为轴,重点阐释ATG16L1在FMDV不同复制阶段动态变化的分子机制及其生物学意义。对FMDV经典疫苗株（O/HN/CHA/93）不同毒株的培养特性研究发现三株FMDV存在衣壳蛋白氨基酸替代而发生受体利用差异。骨架病毒（rHN）与乳鼠组织毒（MF6）、细胞适应毒（BF9）相比,素（HS）受体感染CHO-K1细胞,但在BHK-21细胞上表现对肝素（HP）的高亲和力;三者在结构蛋白VP1—4中仅有三处氨基酸差异。为此以（O/HN/CHA/93）感染性cDNA克隆（pOFS）为原始骨架,借助反向遗传技术,尝试构建仅有效利用单一类型受体的定点突变体,为甄别病毒吸附、侵入及入胞后的详细路径提供材料。遗憾的是,VP1 G—H环中的RGD→KGE/RGG（整联蛋白→JMJD6）具有致死性效应。进一步研究发现:E1083K为MF6转化为细胞适应毒株而扩大细胞嗜性范围及rHN获得HP+特性的关键性氨基酸,L2080与E1083K之间存在体外协同进化作用;L2080M与D1138G使rHN丧失感染CHO细胞系的能力,而可以被K1083R代偿。抗体封闭试验和间接免疫荧光试验（IFA）结果暗示,JMJD6不是FMDV的内在化受体;HP+基因工程毒能够与小窝蛋白在BHK-21细胞表面共定位,提示BHK-21与CHO-K1细胞上的HS在序列或结构上有所不同。随后,选择两株HP敏感性不同的细胞适应毒在BHK-21细胞中开展FMDV感染后的内在化路径研究。结果表明:O/HN/CHA/93（HP+）和O/Fujian/CHA/5/99（HP-）分别经小窝蛋白和网格蛋白介导入胞后,均出现在早期内体（EE）中,两者都不出现于晚期内体（LE）、再循环内体（RE）和溶酶体中。而且,两株FMDV细胞适应株脱壳后,外部衣壳蛋白能够与反式高尔基体（TGN）共定位,说明FMDV内吞入胞后进入EE至TGN的内体运输。透射电镜观察到O/Fujian/CHA/5/99感染的BHK-21细胞中有大量膜泡结构的产生。同时,LC3会出现明显的聚积与呈点状分布,LC3-Ⅰ/Ⅱ的转化也会随着结构蛋白的产生而增加。饥饿诱导细胞自噬有利于FMDV复制,但雷帕霉素处理对FMDV的复制影响不显着;自噬抑制剂3-MA、CQ、Baf-A1则显着降低FMDV的复制能力。FMDV感染影响细胞自噬,同时自噬在FMDV感染中发挥有利作用。激光共聚焦观察结果显示,FMDV非结构蛋白（NSPs）2BC、3A、3C可以与LC3共定位,推测它们在FMDV感染BHK-21细胞后的自噬水平调节中发挥作用。最后,结合网格蛋白介导内在化的ATG16L1胞内运输路径及FMDV内在化路径相“平行”,研究ATG16L1在FMDV感染早期与晚期阶段对FMDV感染的影响。试验结果表明:敲降ATG16L1有利于FMDV的复制,而过表达ATG16L1不利于FMDV的复制。FMDV感染BHK-21细胞时,早期阶段ATG16L1蛋白上调不明显但晚期阶段发生显着下调。FMDV感染会改变ATG16L1的细胞内体定位,而被分选进入EE中与FMDV生命周期“同行”。与构建的BHKATG16L1-/-细胞系比较分析发现,ATG16L1不影响FMDV在BHK-12细胞上的吸附,但参与FMDV的内化,利用囊泡运输协助FMDV进入早期内体脱壳,进而加速感染进程。在FMDV感染的晚期阶段,ATG16L1会被定位于TGN上的2BC依赖于Caspase路径所降解。ATG16L1的Golgi网络募集分子Rab33B效应器蛋白影响FMDV的增殖,Rab33B-siRNAs或Rab33B显性突变体促进FMDV的复制,过表达Rab33B抑制FMDV的复制。由此看来,FMDV在感染BHK-21细胞的不同时期,通过早期利用或晚期抑制ATG16L1对病毒粒子的解离,而对ATG16L1进行动态调节,从而揭示了病毒对宿主蛋白调控以达到子代病毒增殖的分子机制之一。上述研究内容为深入探讨FMDV体外适应性共进化的分子基础、ATGs在FMDV生命周期中发挥自噬与非自噬功能的分子机制奠定基础,我们对病原体“劫持”宿主（细胞）因子以拮抗机体“布防体系”的认知。
王琦[9]（2021）在《水稻黑条矮缩病毒侵染引起灰飞虱细胞自噬的分子机制研究》文中研究指明水稻是全世界最重要的粮食作物,但由灰飞虱以持久增殖型方式传播的水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）严重危害水稻,并每年造成巨大的粮食产量损失。自噬作为一种先天性免疫在抵抗病毒入侵中发挥重要作用,而病毒在与寄主相互博弈过程中进化出逃避自噬或者抑制自噬机制而实现侵染,有些病毒甚至利用寄主的自噬体膜和自噬机制促进其繁殖、扩散。RBSDV侵染能否引起灰飞虱细胞自噬?灰飞虱细胞自噬反应对RBSDV复制和传播的作用是什么?RBSDV引起灰飞虱细胞自噬的分子机制是什么?这些科学问题亟待解答。为此,本论文分析了RBSDV侵染对传毒介体灰飞虱细胞自噬发生的影响,研究了RBSDV侵染诱导灰飞虱细胞自噬的分子机制及自噬对病毒侵染、复制的作用,取得如下研究结果:（1）RBSDV侵染诱导灰飞虱细胞自噬并抑制病毒侵染复制通过Western blot、电镜观察和组织免疫荧光技术发现,RBSDV饲毒后2-4 d,灰飞虱中肠细胞内ATG8-Ⅱ蛋白的积累量和自噬体数量明显增加,并且ATG8在细胞中的定位从弥散分布转变为点状聚集,表明在RBSDV侵染的早期可以诱导灰飞虱细胞发生自噬。为了明确自噬对RBSDV侵染和复制的作用,使用自噬抑制剂3-MA或自噬激活剂rapamycin处理灰飞虱24 h后进行饲毒,发现经3-MA处理的灰飞虱体内RBSDV P10的蛋白积累量和表达水平与DMSO对照相比明显提高,而经rapamycin处理的灰飞虱体内RBSDV P10的蛋白积累量和表达水平与DMSO对照相比显着降低。且沉默灰飞虱自噬相关基因ATG3、ATG5或ATG8后,灰飞虱的获毒率显着提高。以上结果表明,病毒侵染早期所引起的自噬可以抑制病毒的侵染和复制增殖。（2）RBSDV P10蛋白引起灰飞虱细胞和Sf9细胞自噬RBSDV共编码13个蛋白,为了探究病毒的哪个蛋白主要起到自噬诱导的作用,在Sf9细胞中利用杆状病毒表达体系分别表达了病毒的13个蛋白,通过Western blot和透射电子显微镜检测细胞自噬发生水平,发现表达RBSDV P10的Sf9细胞内ATG8-Ⅱ蛋白的积累量与自噬体的数量明显多于GFP对照。为了检测RBSDV P10蛋白是否可以引起灰飞虱细胞自噬,通过膜饲喂法饲喂灰飞虱原核表达的RBSDV P10重组蛋白,结果发现饲喂P10蛋白灰飞虱体内ATG8-Ⅱ的积累量明显高于饲喂GST蛋白对照,且在中肠细胞中也观察到更多的自噬体。表明RBSDV P10蛋白可以引起Sf9细胞和灰飞虱细胞自噬。（3）RBSDV P10与灰飞虱GAPDH互作并在中肠上皮细胞中共定位酵母双杂交实验筛选灰飞虱c DNA文库发现,灰飞虱GAPDH蛋白可以与RBSDV P10发生互作,并通过pull-down和Co-IP实验进一步证明了两者互作。为了观察RBSDV P10与GAPDH在中肠细胞中的定位,解剖饲毒后不同时间点灰飞虱中肠,利用荧光抗体分别标记P10与GAPDH蛋白,激光共聚焦显微镜观察发现,RBSDV P10蛋白与GAPDH蛋白在饲毒后4 d和7 d存在共定位,随后共定位逐渐减弱。且饲喂重组的RBSDV P10蛋白可以进入灰飞虱中肠细胞,同样观察到了RBSDV P10与GAPDH的共定位现象。（4）灰飞虱ATG3与GAPDH互作,但沉默GAPDH未影响自噬发生据报道,ATG3与GAPDH互作可以负调控本氏烟中的自噬。本论文的酵母双杂交实验、pull-down和Co-IP实验发现,灰飞虱的ATG3与GAPDH存在互作,但沉默GAPDH没有诱导灰飞虱或Sf9细胞的自噬,还抑制了RBSDV诱导的灰飞虱细胞自噬。说明GAPDH在昆虫细胞和植物细胞的自噬过程中所起的作用完全不同。（5）RBSDV P10促进AMPK和GAPDH磷酸化,磷酸化的GAPDH的核转位诱导细胞自噬有文献报道,当小鼠细胞在葡萄糖饥饿条件下GAPDH的第122位丝氨酸被AMPK磷酸化后进入细胞核,并与Sir1互作从而激活自噬。本研究的激光共聚焦显微镜观察和磷酸化分析实验等发现,糖饥饿处理后的Sf9细胞中GAPDH蛋白可以被AMPK磷酸化并进入细胞核中激发自噬,进一步研究发现灰飞虱GAPDH蛋白第95位丝氨酸是关键磷酸化位点。并发现表达RBSDV P10的Sf9细胞的GAPDH及RBSDV饲毒和重组RBSDV P10蛋白饲喂灰飞虱中肠细胞的GAPDH均可以进核诱导自噬。而且,表达RBSDV P10基因的Sf9细胞内的GAPDH和AMPK蛋白的磷酸化水平升高,饲毒灰飞虱中肠细胞内的AMPK蛋白的磷酸化水平也显着升高。沉默AMPK基因能抑制RBSDV P10所引起的GAPDH磷酸化和入核。此外,Co-IP实验证明AMPK与GAPDH互作,且磷酸化的AMPK能磷酸化GAPDH。综上所述,RBSDV P10蛋白或RBSDV侵染均能上调AMPK的磷酸化水平,从而导致其底物GAPDH磷酸化,磷酸化状态的GAPDH进入细胞核从而激活灰飞虱细胞的自噬途径,进而抑制RBSDV侵染和在灰飞虱体内的复制繁殖。
孙仁杰[10]（2021）在《猪圆环病毒2型利用宿主细胞应激反应促进其自身复制的分子机制》文中研究表明猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus associated disease,PCVAD）的重要病原,给全球养猪业造成重大经济损失。但PCV2单独感染的致病力不强,共感染或继发感染或环境应激,可以触发PCVAD。受限于自身基因组大小和编码能力,PCV2复制在很大程度上依赖于宿主细胞,因此易引起内质网应激、氧化应激和自噬等细胞应激反应。本实验室研究表明,PCV2能通过与相关宿主因子的相互作用,调控宿主细胞的应激反应从而促进自身复制。高迁移率族蛋白1（High mobility group box 1protein,HMGB1）是高度保守的非组蛋白染色体结合蛋白,在细胞中的功能取决于其在细胞内的位置,在核内主要起DNA分子伴侣作用。研究表明,氧化应激或一些病毒感染可以引起HMGB1在细胞中重新分布,并在病毒感染过程中发挥重要作用。那么,PCV2感染引起的内质网应激是否诱导氧化应激?通过何种机制诱导?由此产生的氧化应激是否影响HMGB1在细胞内的分布?HMGB1是否影响PCV2复制?通过何种机制影响病毒复制?本论文针对这些科学问题展开了系统研究,目的是解明PCV2利用宿主细胞应激反应,促进其自身复制的分子机制。主要研究内容和结果如下:1.核内HMGB1负调控PCV2复制通过免疫印迹、免疫荧光等技术分析HMGB1蛋白在PCV2感染的PK-15细胞或3D4/31细胞（猪肺泡巨噬细胞）中的表达和分布情况,发现PCV2感染可以诱导HMGB1向核外转移至细胞质,但不影响HMGB1的转录和表达。利用过表达或基因沉默技术调节HMGB1在细胞内的水平,并分析其对PCV2复制的影响。结果显示,过表达HMGB1能够抑制PCV2复制,细胞内病毒DNA拷贝数、m RNA水平以及病毒衣壳蛋白（Cap）表达水平均下降;而下调HMGB1表达,可以显着促进PCV2的复制,表明HMGB1负调控PCV2复制。为探究是否是核内HMGB1调控PCV2复制,我们将PCV2感染细胞进行HMGB1出核抑制剂处理,发现丙酮酸乙酯可以有效抑制PCV2诱导的HMGB1出核,并抑制PCV2在细胞中的复制;而用甘草酸抑制胞外HMGB1活性（直接与其结合）并不影响病毒复制。以上结果表明,细胞核内HMGB1可抑制病毒复制,而PCV2感染可以促使HMGB1向核外转移。那么,核内HMGB1如何影响PCV2复制?2.核内HMGB1通过与病毒基因组DNA复制起始区茎环结构结合影响PCV2复制为探明HMGB1是否与病毒基因组DNA互作?互作过程涉及哪个区域?我们制备了PCV2基因组全长和包含或不包含复制起始区（Ori）的不同DNA片段（orf1、orf2、Ori-orf1和Ori-orf2）,并构建了表达HMGB1全长或不同结构域截短蛋白（A box、AB box和B box CT）的载体,通过凝胶阻滞或DNA结合蛋白免疫共沉淀分析HMGB1蛋白-病毒DNA互作,结合病毒复制水平检测,发现只有携带B box的区域与全长HMGB1一样可以抑制病毒在PK-15细胞中的复制,且只有携带复制起始区茎环结构的病毒DNA片段与HMGB1互作才能阻滞蛋白-DNA复合物在凝胶中的迁移。表明HMGB1中的B box结构域是影响PCV2复制的关键区域,核内HMGB1通过与病毒DNA的复制起始区茎环结构结合抑制病毒复制。3.PCV2通过提高胞内活性氧水平促进HMGB1出核和自身复制应用流式细胞术检测PCV2感染PK-15细胞中的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平变化,抗氧化剂乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）和过氧化氢（H2O2）处理PCV2感染细胞,结合分析HMGB1在细胞核内外的分布。我们发现PCV2感染可以显着提高细胞内ROS水平和核内HMGB1向核外转移;用NAC处理PCV2感染细胞,可抑制HMGB1向核外转移,并抑制病毒复制;用H2O2处理PCV2感染细胞,则在促进HMGB1出核的同时,增强PCV2复制。以上结果表明,PCV2感染可增加细胞中ROS水平,引起氧化应激并促进HMGB1向核外转移,降低了核内HMGB1对病毒DNA复制的抑制,有利于PCV2复制。4.PCV2感染诱导内质网应激和氧化应激促进HMGB1向核外转移本实验室前期研究表明,PCV2感染可激活PK-15或3D4/31细胞内质网应激的PERK-e IF2α-ATF4-CHOP通路;已知ERO1α（内质网氧化还原酶1α）受CHOP调控,参与内质网新生蛋白的氧化折叠,并将电子传递给氧分子,最后形成H2O2。我们通过RNA干扰下调PERK蛋白表达、GSK2606414抑制PERK磷酸化或用EN460抑制ERO1α活性,结合细胞内ROS、HMGB1核内外分布以及病毒复制水平的检测,发现PERK或ERO1α抑制均能下调PCV2感染细胞中的ROS水平,抑制HMGB1向核外转移,且PCV2复制受到显着抑制。表明PCV2诱导的内质网应激可以伴随氧化应激,且内质网应激引起的ROS水平增加足以促进HMGB1向核外转移,进而降低核内HMGB1对病毒DNA复制的抑制。5.PCV2诱导内质网氧化还原稳态失衡和HMGB1出核的分子基础在PK-15细胞中过表达PCV2的ORF1（Rep）、ORF2（Cap）、ORF3、ORF4和ORF5蛋白,发现只有Rep和Cap促进ERO1α表达、ROS产生以及HMGB1向核外转移。通过对Rep和Cap中半胱氨酸残基分析,构建了Cap C108S以及RepC107S和Rep C305S的突变蛋白,与野生型蛋白相比,半胱氨酸置换均显着降低它们对PERK和ERO1α的激活作用,下调ROS水平,抑制HMGB1出核。为进一步探究这三个半胱氨酸残基在PCV2感染过程中的作用,通过反向遗传技术构建携带Rep和Cap中半胱氨酸残基单突变和三突变的重组病毒PCV2Rep1（C107S）、PCV2Rep2（C305S）、PCV2Cap1（C108S）和PCV2Rep1/2-Cap1。结果表明,只有三突变的重组病毒(PCV2Rep1/2-Cap1)对PERK和ERO1α的激活作用减弱,并显着降低胞内ROS水平、减少HMGB1向核外转移,病毒复制及增殖水平也显着下降。提示内质网中半胱氨酸介导的蛋白氧化折叠和ROS产生量在单一蛋白水平和全病毒水平之间存在差别,可能与单一蛋白过表达和全病毒水平相关蛋白的表达量存在一定差异有关,也可能是全病毒水平半胱氨酸残基的协同作用所致。综上所述,本研究首次报道了宿主蛋白HMGB1与PCV2基因组DNA之间的相互作用及其对PCV2复制的影响:核内HMGB1通过与病毒基因组DNA的复制起始区茎环结构结合,起到抑制病毒复制的作用,是一种抗PCV2复制的宿主因子。阐明了PCV2通过诱导细胞应激逃避宿主抗病毒反应的新机制:PCV2通过激活PERK-ERO1α系统,在发生内质网应激的同时伴随氧化应激,产生的ROS足以促使核内HMGB1向胞质转移,降低核内HMGB1对病毒基因组DNA的“劫持”,进而有利于PCV2复制。研究结果为猪场通过抗氧化辅助手段防治PCVAD提供借鉴,为深入探索PCV2在宿主体内的相关应激激活机制奠定重要基础。
二、HCV全长基因真核表达载体的构建及其细胞内表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HCV全长基因真核表达载体的构建及其细胞内表达（论文提纲范文）
（1）SARS-CoV-2编码蛋白抑制宿主Ⅰ型干扰素应答机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 新型冠状病毒 |
| 1 新型冠状病毒的出现与疫情的发展 |
| 2 SARS-CoV-2 的“溢出”与传播 |
| 3 SARS-CoV-2 的基因组结构 |
| 4 SARS-CoV-2 编码蛋白在病毒生活史中的主要作用 |
| 5 冠状病毒与宿主因子的互作及对先天免疫应答的抑制 |
| 6 结语 |
| 第2章 宿主先天免疫与病毒逃逸 |
| 1 宿主抗病毒先天免疫 |
| 2 干扰素应答 |
| 3 蛋白泛素化 |
| 4 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 SARS-CoV-2 编码蛋白对Ⅰ型干扰素产生通路的抑制作用 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 SARS-CoV-2 编码蛋白对Ⅰ型干扰素信号转导通路的抑制作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 ORF7a泛素化修饰增强其抑制Ⅰ型干扰素信号转导活性 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 高致病性冠状病毒NSP1/6抑制Ⅰ型干扰素信号转导通路的差异 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 牛呼吸道疾病病原及其固有免疫应答 |
| 1.1 牛呼吸道病原识别病原的分子基础 |
| 1.2 气道和肺上皮细胞对牛呼吸系统疾病的抵抗能力 |
| 1.3 固有免疫系统的效应细胞 |
| 第二章 牛副流感病毒3 型感染及其逃避宿主免疫的研究进展 |
| 2.1 宿主范围与传播特点 |
| 2.2 流行病学与基因型 |
| 2.3 BPIV3 编码基因与蛋白特征 |
| 2.4 牛副流感的临床症状与病理变化 |
| 2.5 病原分离与鉴定 |
| 2.6 BPIV3 造成的经济损失 |
| 2.7 BPIV3 的治疗与预防 |
| 2.8 副黏病毒拮抗Ⅰ型干扰素的研究概况 |
| 第三章 IL10 的信号转导与其在病毒致病中的作用 |
| 3.1 白细胞介素-10 的来源细胞与基本作用 |
| 3.2 IL10 的受体与信号转导 |
| 3.3 IL10 的相关家族与病毒编码的IL10 |
| 3.4 IL10 在病毒致病中的作用 |
| 3.5 IL10 重要产物SOCS3 在病毒感染中的作用 |
| 3.6 病毒诱导IL10 产生的信号通路 |
| 3.7 阻断IL10 清除病毒感染的新策略 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 犊牛BPIV3 血清抗体调查与BPIV3 A的分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、菌株与质粒 |
| 1.2 血清与病料采集 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 呼吸道症状的犊牛BPIV3 抗体调查 |
| 2.2 鼻棉拭子中的BPIV3 鉴定与分离培养 |
| 2.3 病毒的鉴定与纯化 |
| 3 结果 |
| 3.1 呼吸道症状的犊牛BPIV3 抗体调查 |
| 3.2 BPIV3 分离培养 |
| 3.3 BPIV3 的特性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 BPIV3 感染C57BL/6 小鼠与巨噬细胞的转录组分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要动物、细胞与毒株 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3对C57BL/6 鼠的致病性 |
| 2.2 转录样本的制备 |
| 2.3 转录组测序 |
| 2.4 qPCR验证转录组测序结果 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3对C57BL/6 鼠的致病性 |
| 3.2 BPIV3 感染鼠巨噬细胞后细胞因子的变化 |
| 3.3 BPIV3 感染C57 小鼠后肺组织的转录组分析 |
| 3.4 BPIV3 感染原代巨噬细胞转录组测序与分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的重组表达及特性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、菌株与质粒 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的克隆与生物信息学分析 |
| 2.2 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的原核表达与多抗制备 |
| 2.3 牛IL10、SOCS3 的真核表达 |
| 2.4 牛IL10、IL10R1 腺病毒制备及蛋白表达 |
| 2.5 牛IL10 启动子双荧光素酶载体的构建 |
| 2.6 构建牛IL10、IL10R1、SOCS3 干扰载体 |
| 2.7 牛IL10 的生物学活性及信号通路研究 |
| 2.8 牛SOCS3 对I型干扰素表达的负调控 |
| 3 结果 |
| 3.1 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的克隆 |
| 3.2 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的原核表达与多抗制备 |
| 3.3 牛IL10、SOCS3 的真核表达 |
| 3.4 牛IL10、IL10R1 胞外区的腺病毒感染细胞与表达蛋白鉴定 |
| 3.5 牛IL10 启动子双荧光素酶载体的构建与活性分析 |
| 3.6 牛IL10、IL10R1、SOCS3 干扰载体的构建 |
| 3.7 牛IL10 和IL10R的生物学活性 |
| 3.8 牛IL10 的信号通路 |
| 3.9 牛SOCS3 对I型干扰素表达的负调控 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 IL10 在牛副流感病毒3 型感染中的作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与质粒 |
| 1.2 抗体和抑制剂 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3 感染细胞表达IL10 并发挥其活性 |
| 2.2 IL10/IL10R1对BPIV3 感染与细胞因子表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3 感染细胞诱导IL10 的转录与表达 |
| 3.2 BPIV3 感染对STAT3 表达的影响 |
| 3.3 BPIV3 感染对SOCS3 转录的影响 |
| 3.4 BPIV3 感染对其他细胞因子表达的影响 |
| 3.5 IL10对BPIV3 感染与细胞因子表达的影响 |
| 3.6 IL10 受体阻断对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 IL10 与牛副流感病毒3 型感染的相互调控 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与质粒 |
| 1.2 抗体和抑制剂 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3 感染诱导IL10 产生的信号通路 |
| 2.2 调控IL10 相关通路对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3 诱导IL10 产生所依赖的信号通路 |
| 3.2 调控IL10 相关通路对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）樱桃谷肉鸭DDX1介导的信号通路和抗NDRV活性研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 DExD/H-box解旋酶和DDX1 的概述 |
| 1.1.1 DExD/H-box解旋酶的由来 |
| 1.1.2 DExD/H-box解旋酶的结构和解旋机制 |
| 1.1.3 DExD/H-box解旋酶家族部分成员及功能 |
| 1.1.4 DDX1 的功能 |
| 1.2 先天性免疫系统概述 |
| 1.2.1 先天性免疫系统简介 |
| 1.2.2 模式识别受体识别PAMPs |
| 1.2.3 干扰素 |
| 1.3 NDRV简介 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒株 |
| 2.1.2 实验动物及细胞 |
| 2.1.3 质粒与干扰RNA |
| 2.1.4 主要实验仪器设备 |
| 2.1.5 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.6 主要缓冲液及试剂的配置 |
| 2.1.7 主要数据库及软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 duDDX1 的克隆、鉴定和生物学分析 |
| 2.2.2 duDDX1 真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 duDDX1 真核表达载体在DEF细胞中的表达 |
| 2.2.4 病毒TCID50 的测定 |
| 2.2.5 duDDX1 在樱桃谷肉鸭体内的分布情况研究 |
| 2.2.6 过表达duDDX1 参与先天性免疫 |
| 2.2.7 干扰RNA效率检测 |
| 2.2.8 duDDX1 抗病毒活性研究 |
| 2.2.9 duDDX1 影响NDRV感染后的抗病毒和先天性免疫反应 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 duDDX1 的克隆、鉴定和生物学分析 |
| 3.2 duDDX1 的组织表达差异分析 |
| 3.2.1 健康樱桃谷肉鸭体内duDDX1 的组织分布情况 |
| 3.2.2 感染NDRV后樱桃谷肉鸭体内duDDX1 的表达情况分析 |
| 3.3 pcDNA3.0-duDDX1-Flag真核表达载体的构建 |
| 3.4 过表达duDDX1 参与宿主的先天性免疫反应 |
| 3.5 duDDX1 的过表达激活了IFN-β信号通路 |
| 3.6 过表达duDDX1 抑制 NDRV的复制 |
| 3.7 duDDX1 影响NDRV感染后宿主的抗病毒和先天性免疫反应 |
| 3.7.1 过表达duDDX1 并感染NDRV后诱导的模式识别受体和细胞因子表达量的变化 |
| 3.7.2 敲低duDDX1并感染NDRV后诱导的模式识别受体和细胞因子表达量的变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 附录 |
（4）鸡Viperin蛋白与ALV-J相互作用的研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 ALV概述 |
| 1.1.2 ALV分子结构 |
| 1.1.3 ALV致病机理 |
| 1.1.4 ALV流行病学 |
| 1.1.5 ALV诊断和检测 |
| 1.1.6 ALV防控和净化 |
| 1.2 Viperin蛋白概述 |
| 1.2.1 Viperin的基本结构与生物学特性 |
| 1.2.2 Viperin的表达调控 |
| 1.2.3 Viperin在免疫反应中的作用 |
| 1.2.4 Viperin的抗病毒作用 |
| 1.2.5 病毒逃避Viperin的机制 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 细胞和毒株 |
| 2.1.2 感受态细胞和质粒 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.1.4 主要试剂与耗材 |
| 2.1.5 主要溶液的配制 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 Viperin荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.2.1.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.1.2 鸡外周血淋巴细胞分离 |
| 2.2.1.3 提取外周血淋巴细胞总RNA |
| 2.2.1.4 反转录反应扩增鸡Viperin基因 |
| 2.2.1.5 目的条带胶回收 |
| 2.2.1.6 胶回收产物与p MD18-T载体的连接 |
| 2.2.1.7 连接产物的转化与培养 |
| 2.2.1.8 阳性菌液鉴定与测序 |
| 2.2.1.9 重组质粒提取 |
| 2.2.1.10 荧光定量PCR反应条件的优化 |
| 2.2.1.11 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.2.1.12 荧光定量PCR的敏感性和重复性检测 |
| 2.2.2 Viperin的原核表达与多抗制备 |
| 2.2.2.1 pMD-Viperin与pET-32a(+)的双酶切 |
| 2.2.2.2 目的片段与载体的连接 |
| 2.2.2.3 连接产物的转化 |
| 2.2.2.4 重组质粒的筛选、鉴定与提取 |
| 2.2.2.5 Viperin蛋白的原核表达 |
| 2.2.2.6 Viperin蛋白的可溶性分析 |
| 2.2.2.7 表达产物的Western Blot分析 |
| 2.2.2.8 Viperin蛋白的浓度测定 |
| 2.2.2.9 Viperin蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.2.3 ALV-J感染对体外培养细胞和鸡体内Viperin表达的影响 |
| 2.2.3.1 CEF细胞的制备 |
| 2.2.3.2 ALV-J感染CEF细胞及样品的收集 |
| 2.2.3.3 SPF鸡各组织器官的收集及Viperin转录量检测 |
| 2.2.3.4 ALV-J感染SPF鸡及外周血淋巴细胞的收集 |
| 2.2.3.5 荧光定量PCR检测Viperin转录水平变化 |
| 2.2.4 Viperin过表达对ALV-J复制水平的影响 |
| 2.2.4.1 Viperin真核质粒的构建 |
| 2.2.4.2 Viperin真核表达质粒的转染 |
| 2.2.4.3 IFA验证pcDNA-Viperin的表达 |
| 2.2.4.4 Western Blot验证pcDNA-Viperin的表达 |
| 2.2.4.5 过表达Viperin对病毒复制影响的测定 |
| 2.2.5 干扰Viperin表达对ALV-J复制水平的影响 |
| 2.2.5.1 siRNA的设计与合成 |
| 2.2.5.2 siRNA干扰Viperin效果的测定 |
| 2.2.5.3 干扰Viperin表达对病毒复制水平的影响 |
| 2.2.6 Viperin发挥抗ALV-J功能结构域的筛选 |
| 2.2.6.1 Viperin各区域片段的扩增 |
| 2.2.6.2 Viperin各区域过表达质粒的构建 |
| 2.2.6.3 Viperin各区域过表达质粒效果验证 |
| 2.2.6.4 过表达Viperin各区域对ALV-J复制水平影响的测定 |
| 2.2.7 筛选与Viperin互作的ALV-J病毒蛋白 |
| 2.2.7.1 pEGFP-Viperin过表达质粒效果验证 |
| 2.2.7.2 ALV-J各编码蛋白表达质粒的构建 |
| 2.2.7.3 ALV-J各编码蛋白过表达质粒效果验证 |
| 2.2.7.4 激光共聚焦检测Viperin与 ALV-J编码蛋白的共定位 |
| 2.2.7.5 免疫共沉淀筛选互作蛋白 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Viperin荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.1.1 鸡源Viperin全长CDS的扩增结果 |
| 3.1.2 反应体系与条件优化 |
| 3.1.3 标准曲线的建立 |
| 3.1.4 敏感性检测结果 |
| 3.1.5 重复性检测结果 |
| 3.1.6 SPF鸡组织中Viperin表达量检测结果 |
| 3.2 Viperin的原核表达和多抗制备 |
| 3.2.1 Viperin原核表达质粒的构建结果 |
| 3.2.2 Viperin蛋白的诱导表达结果 |
| 3.2.3 Viperin蛋白的浓度测定结果 |
| 3.3 ALV-J感染对宿主Viperin表达的影响 |
| 3.3.1 ALV-J感染CEF细胞对Viperin表达水平的影响 |
| 3.3.2 ALV-J感染SPF鸡对Viperin表达水平的影响 |
| 3.4 诱导Viperin表达对ALV-J复制水平的影响 |
| 3.4.1 pcDNA-Viperin过表达质粒的构建结果 |
| 3.4.2 pcDNA-Viperin质粒转染效果验证结果 |
| 3.4.2.1 IFA验证pcDNA-Viperin的表达 |
| 3.4.2.2 Western Blot验证pcDNA-Viperin的表达 |
| 3.4.3 过表达Viperin对 ALV-J复制水平的影响 |
| 3.5 干扰Viperin表达对ALV-J复制水平的影响 |
| 3.5.1 si RNA干扰效果测定结果 |
| 3.5.2 si RNA干扰Viperin表达对ALV-J病毒复制水平的影响 |
| 3.6 Viperin功能结构域的筛选结果 |
| 3.6.1 Viperin各功能区域真核质粒的构建 |
| 3.6.1.1 Viperin各区域片段的获取 |
| 3.6.1.2 pEGFP-N、pEGFP-SAM、pEGFP-C、pEGFP-Viperin质粒双酶切验证 |
| 3.6.1.3 质粒转染效果 |
| 3.6.2 过表达N.SAM.C区域蛋白对ALV-J复制水平的影响 |
| 3.7 与Viperin互作ALV-J病毒蛋白的筛选结果 |
| 3.7.1 ALV-J各区域真核质粒的构建结果 |
| 3.7.1.1 ALV-J各区域目的片段的扩增结果 |
| 3.7.1.2 ALV-J各部分蛋白表达质粒双酶切鉴定 |
| 3.7.2 质粒转染效果 |
| 3.7.3 激光共聚焦检测Viperin与 p19 蛋白共定位现象 |
| 3.7.4 免疫共沉淀验证ALV p19 蛋白与Viperin蛋白互作 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）RTP4与IZUMO1的相互作用以及对受精的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略说明 |
| 第一章 RTP4 的研究进展 |
| 1 RTP家族概述 |
| 1.1 气味受体的发现 |
| 1.2 RTP家族研究进展 |
| 1.2.1 RTP1和RTP2 的研究进展 |
| 1.2.2 RTP3 的研究进展 |
| 1.2.3 RTP5 的研究进展 |
| 2 RTP4 研究进展 |
| 2.1 RTP4 基本介绍 |
| 2.2 RTP4 作为干扰素刺激基因 |
| 2.2.1 在反刍动物妊娠中的作用 |
| 2.2.2 在病毒抑制和免疫中的作用 |
| 2.2.3 在预防抑郁症中的作用 |
| 2.2.4 在急性Q热中的作用 |
| 2.3 RTP4 作为阿片受体辅助蛋白 |
| 2.4 RTP4 的其它功能 |
| 第二章 RTP4与IZUMO1 的相互作用以及对受精的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器设备 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 实验细胞及实验用载体 |
| 2.1.5 实验常用溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠卵巢组织总RNA的提取 |
| 2.2.2 大鼠卵巢组织cDNA的合成 |
| 2.2.3 大鼠卵巢组织cDNA的检测 |
| 2.2.4 大鼠rtp4 CDS区全长的克隆 |
| 2.2.4.1 大鼠rtp4 CDS区全长克隆引物的设计与合成 |
| 2.2.4.2 大鼠rtp4 CDS区全长的克隆 |
| 2.2.4.3 大鼠rtp4-Blunt克隆载体的构建 |
| 2.2.5 酵母双杂交实验 |
| 2.2.5.1 大鼠pGAD-rtp4 酵母表达载体的构建 |
| 2.2.5.2 pGAD-rtp4 重组质粒转化酵母感受态细胞 |
| 2.2.5.3 酵母双杂交实验 |
| 2.2.6 免疫共沉淀实验 |
| 2.2.6.1 大鼠pCMV-C-Flag-rtp4 真核表达载体的构建 |
| 2.2.6.2 293 T细胞的培养 |
| 2.2.6.3 磁珠法免疫沉淀目标蛋白 |
| 2.2.6.4 Western-blot检测免疫共沉淀结果 |
| 2.2.7 RTP4 腹水多克隆抗体的制备 |
| 2.2.7.1 大鼠pET-28a-rtp4 原核表达载体的构建 |
| 2.2.7.2 大鼠HIS-RTP4 融合蛋白的表达 |
| 2.2.7.3 大鼠HIS-RTP4 融合蛋白的鉴定 |
| 2.2.7.4 大鼠HIS-RTP4 融合蛋白的纯化及鉴定 |
| 2.2.7.5 大鼠HIS-RTP4 融合蛋白浓度测定 |
| 2.2.7.6 RTP4 腹水多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.2.8 RTP4 在小鼠睾丸组织中的定位 |
| 2.2.9 RTP4与IZUMO1 在小鼠精子顶体反应前后的定位 |
| 2.2.10 RTP4与IZUMO1 在大鼠精子顶体反应前后的定位 |
| 2.2.11 RTP4 在小鼠卵巢组织中的定位 |
| 2.2.12 RTP4 在小鼠MII期卵子上的定位 |
| 2.2.13 抗体抑制体外受精实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 大鼠卵巢组织cDNA检测 |
| 3.2 大鼠rtp4 CDS区全长的克隆 |
| 3.3 大鼠rtp4-Blunt克隆载体的PCR鉴定 |
| 3.4 酵母双杂交实验 |
| 3.4.1 pGAD-rtp4 酵母表达载体的构建 |
| 3.4.2 pGAD-rtp4 转化酵母感受态菌落PCR鉴定 |
| 3.4.3 酵母双杂交 |
| 3.5 免疫共沉淀实验 |
| 3.5.1 大鼠PCMV-C-Flag-rtp4 真核表达载体的构建 |
| 3.5.2 免疫共沉淀 |
| 3.6 大鼠RTP4 腹水多克隆抗体的制备 |
| 3.6.1 大鼠pET-28a-rtp4 原核表达载体的构建 |
| 3.6.2 大鼠HIS-RTP4 原核蛋白的表达及鉴定 |
| 3.6.3 大鼠HIS-RTP4 融合蛋白的纯化及鉴定 |
| 3.6.4 大鼠HIS-RTP4 融合蛋白的浓度测定 |
| 3.6.5 RTP4 腹水多克隆抗体的鉴定和特异性检测 |
| 3.7 RTP4 在小鼠睾丸组织的定位 |
| 3.8 RTP4与IZUMO1 在小鼠精子上的定位 |
| 3.8.1 RTP4 在小鼠精子上的定位 |
| 3.8.2 RTP4与IZUMO1 在小鼠精子上的共定位 |
| 3.8.3 利用Image J软件分析RTP4与IZUMO1 在小鼠精子上的共定位结果 |
| 3.9 RTP4与IZUMO1 在大鼠精子上的定位 |
| 3.9.1 RTP4 大鼠精子上的定位 |
| 3.9.2 RTP4与IZUMO1 在大鼠精子上的共定位 |
| 3.9.3 利用Image J软件分析RTP4与IZUMO1 在大鼠精子上的共定位结果 |
| 3.10 RTP4 在小鼠卵巢组织的定位 |
| 3.11 RTP4 在小鼠MII期卵子上的定位 |
| 3.12 抗体抑制体外受精实验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RTP4 在生殖组织和生殖细胞的定位 |
| 4.2 RTP4与IZUMO1和JUNO的相互作用 |
| 4.3 RTP4 对小鼠体外受精的影响 |
| 5 小结和创新点 |
| 5.1 小结 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间参与的科研项目和发表论文 |
（6）牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS4B抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛病毒性腹泻/黏膜病研究进展 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 BVDV分类与基因组 |
| 1.1.3 BVDV基因组结构蛋白和非结构蛋白 |
| 1.1.4 BVDV流行情况 |
| 1.2 抗病毒天然免疫及Ⅰ型干扰素信号通路的研究进展 |
| 1.2.1 抗病毒天然免疫 |
| 1.2.2 抗病毒天然免疫受体 |
| 1.2.3 Ⅰ型干扰素的研究进展 |
| 1.2.4 RNA病毒诱导的Ⅰ型干扰素产生的信号通路 |
| 1.2.5 TLRs介导的信号通路 |
| 1.2.6 RLRs介导的信号通路 |
| 1.3 黄病毒科非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制的研究进展 |
| 1.3.1 WNV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制 |
| 1.3.2 ZⅠKV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制 |
| 1.3.3 YFV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制 |
| 1.3.4 JEV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制 |
| 1.3.5 DENV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制 |
| 1.3.6 HCV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制 |
| 1.4 瘟病毒属CSFV和 BVDV抑制Ⅰ型干扰素研究进展 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第二章 BVDV NS4B真核表达载体的构建及对ⅠFN-β的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、毒株及质粒 |
| 2.1.2 质粒构建载体图谱及多克隆位点 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 BVDV和 SeV的增殖 |
| 2.2.4 病毒/细胞总RNA的提取 |
| 2.2.5 重组质粒的构建 |
| 2.2.6 磷酸钙转染 |
| 2.2.7 质粒电击转染MDBK细胞 |
| 2.2.8 免疫印记分析 |
| 2.2.9 双荧光素酶报告基因检测 |
| 2.2.10 实时荧光定量RT-PCR |
| 2.2.11 ELISA检测细胞上清液中IFN-β的分泌 |
| 2.2.12 统计学方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 BVDV NADL株感染MDBK细胞结果 |
| 2.3.2 BVDV-NS4B扩增结果 |
| 2.3.3 重组质粒pCDNA3.0-HA-NS4B的鉴定 |
| 2.3.4 Western blot验证pCDNA3.0-HA-NS4B表达结果 |
| 2.3.5 BVDV NS4B抑制SeV诱导的IFN-β启动子活性 |
| 2.3.6 BVDV NS4B蛋白抑制SeV诱导的IFN-β表达 |
| 2.3.7 BVDV NS4B蛋白抑制SeV诱导的细胞上清液中IFN-β的分泌 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛病毒性腹泻病毒NS4B蛋白对RLRs通路的抑制作用研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、毒株及质粒 |
| 3.1.2 质粒构建载体图谱及多克隆位点 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 RLRs通路信号分子重组质粒的构建 |
| 3.2.2 磷酸钙转染 |
| 3.2.3 质粒电击转染MDBK细胞 |
| 3.2.4 免疫印记分析 |
| 3.2.5 BVDV NS4B对 IRF3 磷酸化的影响 |
| 3.2.6 NS4B和 RLRs信号通路中各信号分子对IFN-β启动子的激活 |
| 3.2.7 实时荧光定量检测NS4B蛋白对内源性RLRs通路各信号分子的转录水平. |
| 3.2.8 免疫共沉淀 |
| 3.2.9 激光共聚焦 |
| 3.2.10 统计学方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 RLRs各信号分子双酶切鉴定结果 |
| 3.3.2 RLRs各信号分子Western blot表达结果 |
| 3.3.3 BVDV NS4B抑制IRF3 的磷酸化 |
| 3.3.4 BVDV NS4B作用靶点位于MDA5 及其上游水平 |
| 3.3.5 BVDV NS4B抑制内源性MDA5 的表达 |
| 3.3.6 BVDV NS4B与外源性MDA5 相互作用 |
| 3.3.7 BVDV NS4B与外源性MDA5 共定位 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 BVDV NS4B蛋白对MDA5 不同结构域作用机制研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、菌株和质粒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 MDA5 不同结构域引物设计 |
| 4.2.2 磷酸钙转染 |
| 4.2.3 免疫印记分析 |
| 4.2.4 免疫共沉淀 |
| 4.2.5 激光共聚焦 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MDA5-2CARD、MDA5-HEL、MDA5-CTD重组质粒双酶切鉴定 |
| 4.3.2 MDA5 各结构域Western blot表达结果 |
| 4.3.3 BVDV NS4B与外源性MDA5-2CARD相互作用 |
| 4.3.4 BVDV NS4B与外源性MDA5-2CARD共定位 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（7）m6A甲基化修饰调控牛病毒性腹泻病毒NS5A的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 牛病毒性腹泻-粘膜病的研究进展 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 BVDV引起的免疫反应 |
| 1.2.4 BVDV结构与功能 |
| 1.3 N~6-methyladenosine(m~6A)修饰 |
| 1.3.1 RNA修饰 |
| 1.3.2 m~6A修饰 |
| 1.4 病毒m~6A修饰的研究 |
| 1.4.1 m~6A修饰在RNA病毒感染中的影响 |
| 1.4.2 m~6A修饰在RNA病毒感染中的影响 |
| 1.5 研究的目的及意义 |
| 2 BVDV感染后影响m~6A甲基化酶和去甲基化酶的表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞和病毒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养与病毒增殖 |
| 2.2.2 细胞的RNA提取及反转录 |
| 2.2.3 PCR鉴定BVDV |
| 2.2.4 BVDV感染细胞后m~6A甲基化蛋白转录水平的检测 |
| 2.2.5 BVDV感染细胞后m~6A甲基化蛋白蛋白水平的检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 BVDV NADL株接种MDBK细胞结果 |
| 2.3.2 BVDV的PCR鉴定 |
| 2.3.3 m~6A甲基化蛋白相对荧光定量PCR结果 |
| 2.3.4 METTL3、METTL14、FTO Western blot结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 牛METTL3、METTL14、FTO真核表达载体的构建及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 载体、细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 细胞的RNA提取及反转录 |
| 3.2.3 牛METTL3、METTL14、FTO基因的克隆及分析 |
| 3.2.4 牛METTL3、METTL14、FTO蛋白真核表达载体的构建 |
| 3.2.5 293T细胞的转染 |
| 3.2.6 重组蛋白pcDNA3.0-METTL3、 pcDNA3.0-METTL14、 pcDNA3.0-FTOWestern blot的鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 METTL3、METTL14、FTO基因的PCR扩增 |
| 3.3.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.3.3 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.3.4 METTL3、FTO蛋白生物信息学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 牛METTL3、METTL14、FTO对 BVDV NS5A蛋白的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞及质粒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组质粒pcDNA3.1-NS5A的转化 |
| 4.2.2 重组质粒pcDNA3.1-NS5A的酶切鉴定 |
| 4.2.3 重组质粒pcDNA3.1-NS5A的鉴定 |
| 4.2.4 蛋白互作的预测 |
| 4.2.5 免疫共沉淀试验 |
| 4.2.6 质粒的共转染 |
| 4.2.7 质粒的电转 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组质粒pcDNA3.1-NS5A的鉴定 |
| 4.3.2 NS5A蛋白Western blot的鉴定 |
| 4.3.3 蛋白互作预测结果 |
| 4.3.4 通过Co-IP试验分析METTL3和NS5A的相互作用 |
| 4.3.5 Western blot分析NS5A与 METTL3、METTL14和FTO的关系 |
| 4.3.6 过表达METTL3对病毒复制的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（8）ATG16L1囊泡转运在口蹄疫病毒内体运输过程中的效应机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 口蹄疫病毒概述 |
| 1.1.2 口蹄疫病毒基因组的组成 |
| 1.1.3 口蹄疫病毒蛋白组功能 |
| 1.2 口蹄疫病毒生命周期 |
| 1.2.1 口蹄疫病毒吸附与侵入 |
| 1.2.2 口蹄疫病毒内在化过程 |
| 1.2.3 口蹄疫病毒蛋白翻译 |
| 1.2.4 口蹄疫病毒核酸复制 |
| 1.2.5 子代口蹄疫病毒粒子的组装成熟与释放 |
| 1.3 自噬 |
| 1.3.1 自噬概述 |
| 1.3.2 自噬与病毒感染 |
| 1.3.2.1 病毒感染诱导自噬形成 |
| 1.3.2.2 病毒感染抑制自噬形成 |
| 1.3.2.3 自噬在FMDV感染的研究进展 |
| 1.4 ATG16L1蛋白 |
| 1.4.1 ATG16L1蛋白的自噬功能 |
| 1.4.2 ATG16L1蛋白的非自噬功能 |
| 1.4.3 ATG16L1与病原感染 |
| 1.5 研究目的与内容 |
| 第二章 FMDV识别细胞表面受体类型转换的分子基础研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 细胞 |
| 2.1.4 试剂与抗体 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 溶液配制 |
| 2.1.7 引物的设计与合成 |
| 2.1.8 FMDV全基因组序列的测定 |
| 2.1.9 FMDV基因组全长修饰型cDNA克隆的构建 |
| 2.1.10 基因工程FMDV的拯救与传代 |
| 2.1.11 FMDV蚀斑试验 |
| 2.1.12 FMDV吸附试验 |
| 2.1.13 FMDV侵入试验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 O/HN/CHA/93wt、O/HN/CHA/93tc和rHN全基因组测序结果与比较分析 |
| 2.2.2 rHN定点突变体的拯救结果 |
| 2.2.3 rHN定点突变体的遗传稳定性分析结果 |
| 2.2.4 rHN定点突变体的受体表型鉴定结果 |
| 2.2.5 rHN定点突变体的吸附能力检测结果 |
| 2.2.6 rHN定点突变体的内吞作用路径观察结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 FMDV侵染BHK-21细胞的转运路径研究 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 细胞与毒株 |
| 3.1.2 抗体 |
| 3.1.3 FMDV吸附与受体结合试验 |
| 3.1.4 FMDV与EE、RE、LE、TGN及溶酶体的共定位观察 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 FMDV与BHK-21细胞表面受体共定位结果 |
| 3.2.1.1 FMDV感染BHK-21细胞的吸附观察 |
| 3.2.1.2 FMDV与BHK-21细胞表面受体的共定位观察 |
| 3.2.2 FMDV的内吞作用路径观察 |
| 3.2.3 FMDV与EE的共定位观察结果 |
| 3.2.4 FMDV与RE的共定位观察结果 |
| 3.2.5 FMDV与LE的共定位观察结果 |
| 3.2.6 FMDV与TGN的共定位观察结果 |
| 3.2.7 FMDV与溶酶体的共定位观察结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 FMDV感染BHK-21细胞动态调节自噬水平的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 毒株与细胞 |
| 4.1.2 试剂与抗体 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 蛋白样品的处理与定量 |
| 4.1.6 免疫蛋白印迹试验 |
| 4.1.7 电镜样品的处理与观察 |
| 4.1.8 LC3蛋白的共聚焦观察 |
| 4.1.9 细胞活力检测(MTT法) |
| 4.1.10 FMDV感染与药物处理 |
| 4.1.11 FMDV的荧光定量检测 |
| 4.1.12 FMDV蛋白重组质粒的构建 |
| 4.1.13 数据统计分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 FMDV感染BHK-21细胞的LC3检测结果 |
| 4.2.2 FMDV感染BHK-21细胞的电镜观察 |
| 4.2.3 FMDV感染BHK-21细胞对LC3的IFA观察 |
| 4.2.4 自噬激活剂对FMDV复制的影响 |
| 4.2.5 自噬抑制剂对FMDV复制的影响 |
| 4.2.6 FMDV蛋白与LC3的共定位观察 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 ATG16L1在FMDV早期感染阶段的作用研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 毒株及细胞 |
| 5.1.2 抗体及试剂 |
| 5.1.3 表达ATG16L1的重组质粒的构建 |
| 5.1.4 ATG16L1-siRNA的设计合成与转染 |
| 5.1.5 表达ATG16L1-shRNA的慢病毒包装 |
| 5.1.6 稳定表达ATG16L1-shRNA的BHK-21细细胞系的构建 |
| 5.1.7 FMDV在BHK-21细胞上的感染率测定 |
| 5.1.8 FMDV感染BHK-21细胞后非结构蛋白的检测 |
| 5.1.9 ATG16L1、VP2及EE的共定位观察 |
| 5.1.10 FMDV吸附试验 |
| 5.1.11 FMDV内化试验 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 ATG16L1重组质粒的构建与鉴定 |
| 5.2.2 ATG16L1-siRNA干扰效果检测 |
| 5.2.3 稳定表达ATG16L1-shRNA的BHK-21细胞系的鉴定 |
| 5.2.4 FMDV感染对ATG16L1的影响 |
| 5.2.5 过表达ATG16L1对FMDV复制的影响 |
| 5.2.6 敲降ATG16L1对FMDV复制的影响 |
| 5.2.7 ATG16L1与FMDV的共定位观察 |
| 5.2.8 FMDV感染对ATG16L1内体定位的影响 |
| 5.2.9 ATG16L1对FMDV的内化及吸附的影响 |
| 5.2.10 稳定敲降ATG16L1对FMDV早期内体运输的影响 |
| 5.2.11 稳定敲降ATG16L1对FMDV感染的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 FMDV感染晚期下调ATG16L1的作用机制研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 毒株及细胞 |
| 6.1.2 抗体及试剂 |
| 6.1.3 灭活FMDV的制备 |
| 6.1.4 Rab33B重组质粒的构建 |
| 6.1.5 针对Rab33B、2BC的siRNA的设计与合成 |
| 6.1.6 免疫共沉淀试验(CO-IP) |
| 6.1.7 电镜样品的观察 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 Rab33B质粒及其显性突变体的鉴定 |
| 6.2.2 灭活FMDV对ATG16L1的影响 |
| 6.2.3 FMDV蛋白对ATG16L1的影响 |
| 6.2.4 FMDV非结构蛋白与ATG16L1的互作结果 |
| 6.2.5 2BC蛋白对ATG16L1的降解路径分析 |
| 6.2.6 Rab33B对FMDV复制的影响 |
| 6.2.6.1 敲降Rab33B对FMDV复制的影响 |
| 6.2.6.2 表达Rab33B及其显性突变体对FMDV复制的影响 |
| 6.2.7 2BC在FMDV感染中的作用 |
| 6.2.7.1 ATG16L1对FMDV2BC的影响 |
| 6.2.7.2 2BC-siRNA对FMDV复制的影响 |
| 6.2.7.3 TEM观察2BC蛋白对细胞膜的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）水稻黑条矮缩病毒侵染引起灰飞虱细胞自噬的分子机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 水稻黑条矮缩病毒研究进展 |
| 1.1.1 水稻黑条矮缩病毒的寄主及症状 |
| 1.1.2 RBSDV传播介体及介体传播特性 |
| 1.1.3 水稻黑条矮缩病毒分类及形态学特征 |
| 1.1.4 水稻黑条矮缩病毒基因组结构及功能 |
| 1.2 虫传植物病毒的传播机制 |
| 1.2.1 非循回型病毒 |
| 1.2.2 循回型病毒 |
| 1.3 昆虫免疫系统 |
| 1.3.1 昆虫的细胞免疫 |
| 1.3.2 昆虫体液免疫 |
| 1.4 自噬概述 |
| 1.4.1 自噬的分类 |
| 1.4.2 自噬的发生过程 |
| 1.4.3 自噬信号调控 |
| 1.4.4 研究自噬的方法 |
| 1.4.5 病毒与自噬的研究进展 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 实验材料与试验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料、昆虫、细胞 |
| 2.1.2 实验试剂与抗体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 灰飞虱获毒 |
| 2.2.2 Trizol法提取样品总RNA |
| 2.2.3 反转录实验 |
| 2.2.4 目的片段PCR扩增 |
| 2.2.5 DNA琼脂糖凝胶回收 |
| 2.2.6 质粒DNA提取 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 RBSDV P10、LsGAPDH和 LsATG3 的原核表达 |
| 2.2.10 蛋白pull-down |
| 2.2.11 生物膜干涉技术(Bio-layer interferometry, BLI)检验蛋白间相互作用 |
| 2.2.12 抗体纯化 |
| 2.2.13 抗体的荧光素交联 |
| 2.2.14 灰飞虱消化系统器官免疫荧光检测 |
| 2.2.15 Sf9 细胞免疫荧光检测 |
| 2.2.16 RNAi沉默基因表达实验 |
| 2.2.17 Sf9 昆虫表达系统 |
| 2.2.18 电子显微镜观察细胞自噬 |
| 2.2.19 胞质胞核蛋白提取 |
| 2.2.20 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RBSDV侵染对灰飞虱细胞自噬的影响 |
| 3.2 自噬抑制RBSDV在灰飞虱体内的复制增殖 |
| 3.3 RBSDV P10 是引起细胞自噬的主要蛋白 |
| 3.3.1 RBSDV P10对Sf9 细胞自噬的影响 |
| 3.3.2 重组蛋白 RBSDV P10 可以进入灰飞虱中肠上皮细胞的细胞质 |
| 3.3.3 膜饲喂RBSDV P10 对灰飞虱细胞自噬的影响 |
| 3.4 筛选与RBSDV P10 互作的灰飞虱蛋白 |
| 3.5 RBSDV P10与GAPDH在细胞中存在共定位 |
| 3.6 GAPDH与 ATG3 的互作在昆虫细胞无法负调控自噬 |
| 3.7 RBSDV P10 影响昆虫细胞GAPDH的细胞定位 |
| 3.7.1 饥饿处理对Sf9 细胞GAPDH亚细胞定位的影响 |
| 3.7.2 GAPDH第95 位丝氨酸磷酸化位点调控昆虫细胞自噬的发生 |
| 3.8 RBSDV P10 能提高GAPDH磷酸化水平 |
| 3.8.1 RBSDV P10对Sf9 细胞GAPDH磷酸化水平的影响 |
| 3.8.2 RBSDV P10对Sf9 细胞GAPDH亚细胞定位的影响 |
| 3.8.3 RBSDV P10 对灰飞虱细胞GAPDH亚细胞定位的影响 |
| 3.9 RBSDV P10与AMPK互作并提高AMPK的磷酸化水平 |
| 4 讨论 |
| 5 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 本研究创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 本研究所用引物汇总 |
| 附录2 本论文所用术语缩写及中英文对照 |
| 附录3 本论文所用培养基和缓冲液配方 |
（10）猪圆环病毒2型利用宿主细胞应激反应促进其自身复制的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒2 型研究进展 |
| 1 猪圆环病毒的分类 |
| 2 猪圆环病毒2 型基因组结构及其编码产物功能 |
| 3 猪圆环病毒2 型基因组的复制 |
| 4 猪圆环病毒2 型与细胞应激反应 |
| 第二章 HMGB1 蛋白的研究进展 |
| 1 HMGB1 蛋白的发现与分类 |
| 2 HMGB1 蛋白的基本结构 |
| 3 HMGB1 蛋白的功能 |
| 4 HMGB1 蛋白的核-质穿梭和释放 |
| 5 HMGB1 与病毒感染 |
| 第三章 内质网应激与活性氧的相关研究进展 |
| 1 内质网应激及未折叠蛋白反应的信号通路 |
| 2 蛋白质氧化折叠与内质网活性氧的生成 |
| 3 内质网和线粒体与氧化应激之间的联系 |
| 第四章 本研究拟探索的科学问题 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 PCV2 与宿主蛋白HMGB1 的相互作用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 质粒构建 |
| 2.3 病毒感染及药物处理 |
| 2.4 细胞转染 |
| 2.5 细胞核-质组分分离 |
| 2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.7 病毒基因组DNA提取 |
| 2.8 免疫印迹 |
| 2.9 免疫荧光 |
| 2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2 感染影响HMGB1 蛋白的核内外分布 |
| 3.2 PCV2 感染不影响HMGB1 蛋白的转录和翻译 |
| 3.3 核内HMGB1 负调控PCV2 复制 |
| 4 分析与讨论 |
| 第二章 HMGB1 蛋白通过与病毒基因组DNA结合抑制 PCV2 复制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 HMGB1 蛋白不同截短片段的真核表达载体构建 |
| 2.3 病毒感染与质粒转染 |
| 2.4 细胞核-质组分分离 |
| 2.5 凝胶迁移实验 |
| 2.6 DNA结合蛋白免疫共沉淀 |
| 2.7 病毒基因组DNA提取与实时荧光定量PCR |
| 2.8 免疫印迹与免疫荧光 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 HMGB1与PCV2 基因组DNA的复制起始区相互作用 |
| 3.2 HMGB1 B box是抑制PCV2 复制的关键结构域 |
| 4 分析与讨论 |
| 第三章 PCV2 通过提高感染细胞内ROS促进HMGB1 蛋白出核和病毒自身复制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 病毒感染及药物处理 |
| 2.3 细胞核-质组分分离 |
| 2.4 病毒基因组DNA提取与实时荧光定量PCR |
| 2.5 免疫印迹与免疫荧光 |
| 2.6 流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS) |
| 2.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 胞内ROS能影响HMGB1 的亚细胞定位 |
| 3.2 H_2O_2促进HMGB1 出核并增强PCV2 复制 |
| 3.3 NAC阻断HMGB1 向核外转移并抑制 PCV2 复制 |
| 4 分析与讨论 |
| 第四章 PCV2 感染诱导内质网应激和氧化应激促进HMGB1 向核外转移 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 病毒感染及药物处理 |
| 2.3 细胞转染 |
| 2.4 细胞核-质组分分离 |
| 2.5 病毒基因组DNA提取与实时荧光定量PCR |
| 2.6 免疫印迹与免疫荧光 |
| 2.7 流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS) |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2 感染促进内质网ERO1α表达 |
| 3.2 PCV2 感染激活内质网应激(PERK)通路调控ERO1α表达 |
| 3.3 PCV2 利用PERK通路激活产生的ROS诱导HMGB1 出核促进自身复制 |
| 4 分析与讨论 |
| 第五章 PCV2 通过Rep和 Cap蛋白诱导内质网氧化还原稳态失衡和 HMGB1 核外转移的机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 PCV2 主要病毒蛋白及其半胱氨酸突变体的真核表达载体构建 |
| 2.3 病毒感染与质粒转染 |
| 2.4 细胞核-质组分分离 |
| 2.5 病毒基因组DNA提取 |
| 2.6 免疫印迹与免疫荧光 |
| 2.7 流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS) |
| 2.8 重组病毒体外拯救 |
| 2.9 病毒滴度测定 |
| 2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Rep和 Cap蛋白能引起内质网ERO1α上调以及ROS的产生 |
| 3.2 Rep和 Cap蛋白的半胱氨酸残基参与内质网ROS的产生 |
| 3.3 Rep和 Cap蛋白促进HMGB1 向核外转移 |
| 3.4 Rep和 Cap的半胱氨酸残基影响细胞应激反应及病毒复制 |
| 4 分析与讨论 |
| 全文结论 |
| 创新性 |
| 展望 |
| 主要缩略词表 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间科研成果 |
| 致谢 |
四、HCV全长基因真核表达载体的构建及其细胞内表达（论文参考文献）
- [1]SARS-CoV-2编码蛋白抑制宿主Ⅰ型干扰素应答机制研究[D]. 曹增国. 吉林大学, 2021(01)
- [2]IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制[D]. 高明春. 吉林大学, 2021
- [3]樱桃谷肉鸭DDX1介导的信号通路和抗NDRV活性研究[D]. 张惠惠. 山东农业大学, 2021
- [4]鸡Viperin蛋白与ALV-J相互作用的研究[D]. 王静. 山东农业大学, 2021(01)
- [5]RTP4与IZUMO1的相互作用以及对受精的影响[D]. 徐玲玲. 内蒙古大学, 2021(12)
- [6]牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS4B抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制研究[D]. 岳山. 黑龙江八一农垦大学, 2021(01)
- [7]m6A甲基化修饰调控牛病毒性腹泻病毒NS5A的表达[D]. 黄雯静. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [8]ATG16L1囊泡转运在口蹄疫病毒内体运输过程中的效应机制研究[D]. 宫晓华. 中国农业科学院, 2021
- [9]水稻黑条矮缩病毒侵染引起灰飞虱细胞自噬的分子机制研究[D]. 王琦. 浙江大学, 2021(01)
- [10]猪圆环病毒2型利用宿主细胞应激反应促进其自身复制的分子机制[D]. 孙仁杰. 浙江大学, 2021