【摘 要】目的：观察海南砂仁对肝源性大鼠胃粘膜表皮生长因子(EGF)及表皮生长因子受体(EGFR)的影响。方法：成年健康雄性SD 大鼠50 只，随机分为5 组，正常组、模型组、普萘洛尔组、海南砂仁低剂量组、海南砂仁高剂量组。除正常组外，其余四组在成功复制免疫损伤性肝纤维化大鼠模型的基础上，采用无水乙醇和阿司匹林灌胃法建立胃溃疡大鼠模型。①溃疡指数测定；② 免疫组织化学法检测大鼠胃粘膜EGF 和EGFR 的表达；③Real-time PCR 法，对胃粘膜及EGFmRNA 行定量检测和分析。结果：① 除正常组外，其余各组大鼠溃疡指数均较高，普萘洛尔组和海南砂仁低、高剂量组溃疡指数均低于模型组（P< 0.05）；② 免疫组化：大鼠胃粘膜EGF 和EGFR 的表达模型组略高于正常组，普萘洛尔组、海南砂仁低、高剂量组均有明显提高，尤以海南砂仁高剂量组提高明显；③EGFmRNA 在模型组和正常组比较无差异（P>0.05），与砂仁低剂量组无明显差异（P>0.05），高剂量组和西药组均有明显升高，两组的效果最接近(P>0.05)。结论：海南砂仁对大鼠胃粘膜损伤具有保护作用，其机制可能与提高EGF 和EGFR 的表达有关。
【关键词】海南砂仁 肝源性溃疡 胃粘膜 EGF EGFR
【中图分类号】S857.11+1【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2015）-09-038-03
海南砂仁具有健脾化湿，行气止痛等作用，常用于腹痛胀满、食欲不振、恶心呕吐，反酸嗳气等症。现代药理研究证实砂仁可增强胃的功能，促进消化液的分泌，增进肠道运动，排出消化管内的积气，可起到帮助消化，消除肠胀气等症状，对溃疡有明显抑制作用。本实验通过海南砂仁的干预，观察其对实验性大鼠胃粘膜表皮生长因子（EGF）、表皮生长因子受体(EGFR)的表达以及对EGFmRNA 基因表达的影响，探讨海南砂仁改善肝源性溃疡，促进溃疡愈合的作用机制。
1 材料
1.1 动物 SPF级雄性SD 大鼠50只，体质量( 180±20) g，长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2009-0012。
1.2 药品
砂仁购自海南省海口市国瑞堂医药公司，经海南医学院药学院鉴定为南药砂仁的干燥成熟果实。按常规法自治煎剂，即冷水浸泡30 min，煮沸10min，过滤药液，加水再煎煮10min，合并两次滤液，并将其配成生药浓度为20%、50%的水煎液备用，冷却后装瓶置于4℃冰箱中保存备用。普萘洛尔10mg/片，国药准字427H43400，广东金葫芦制药有限公司生产，研粉备用。无水乙醇、阿司匹林购自海南医学院附属医院。
1.3 实验主要试剂及仪器
1.3.1 主要试剂
免疫组化试剂盒：表皮生长因子（EGF）、表皮生长因子受体(EGFR)，配套使用稀释液（1：100）（批号：SA1022）；DAB 显色剂 以上试剂均购自武汉博士德生物工程公司。主要试剂：PS2、ITF 抗体，免疫组织化学( S-P) 法试剂盒及EGFR 一抗。TRIzol 试剂，Taq 酶，Rnasin，MMLV RT反转录酶， SYBRgreen ， DNA Marker ， oligo dT 序列：5'-TTTTGTA-CAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'；B-actin (263 bp)：
上游 5'-GAGACCTTCAA-CACCCCAGCC-3'，
下游 5'-AATGTCACG-CACGATTTCCC-3'；EGF（404 bp）上游：5′-CAC CAT CCA TGA CAT GAACC-3′
下游：5′-TCA TGT TGG ACA ACT CCT CC-3′
1.3.2 主要仪器
7000 型实时荧光定量PCR 系统；紫外分光光度计；-20℃低温冰箱（日本Sanyo 公司）；低温高速离心机；恒压恒流电泳仪；切片机( LEZCARM2135)；BMJ-Ⅲ型包埋机；BH-2 型光学显微镜；显微摄像仪；GD-8 病理摄像多媒体分析仪；Tanon 1600 凝胶图像分析仪。
2 方法
2.1 动物模型制备与给药 雄性SD 大鼠60 只，随机分为5 组，每组12 只。正常组（N 组）、模型组（M 组）、普萘洛尔组（P 组）、海南砂仁低（HSD 组）、高剂量组（HSG 组）。除N 组外（生理盐水ip 2 mL/只，2 次/周），其他四组按照文献［1-2］等方法略加改进，复制免疫损伤性肝纤维化大鼠模型，2 次/w，0.5ml/只，造模4 周。第五周开始，除N 组用0.9%生理盐水灌胃（2ml/只，2 次/w）外，其余各组均采用无水乙醇和阿司匹林灌胃法建立胃溃疡大鼠模型［3］。
造模成功后，从第6 周开始，N 组和M 组均给与等量的生理盐水，1ml/100g 体重灌胃，P 组给予普萘洛尔5mg/kg•d，HSD 组、HSG 组予2ml/kg•d 灌胃，连续两周。2.2 取材 给药结束后，对各组大鼠禁食 24 h 后，予2%戊巴比妥钠50mg/kg 腹腔注射麻醉后处死，剖检取胃，观察并采集标本。用于各项指标的测定。
取出全胃，沿胃大弯剖开，分别切取胃窦部、胃体部及胃底部一部分组织，剪取包括溃疡部位的胃黏膜组织，大小约0.5 cm ×1.0 cm，用10% 中性甲醛固定制备石蜡切片光镜标本和免疫组化标本；一部分组织液氮速冻，-70℃度冰箱保存以备提取总RNA。剩余组织刮取粘膜，备用。
2.3 指标检测
2.3.1 一般情况观察 大鼠毛色、精神、活动量、饮食、大便、体质量情况，每周称量一次体重。
2.3.2 溃疡指数 (Gastric ulcer GUI)的检测 以游标卡尺测量溃疡面的最大长径和垂直于最大长径的最大宽径，以二者的乘积作为溃疡指数。
2.3.3 免疫组织化学（SP 法） 观察胃粘膜EGF、EGFR 蛋白表达 处死大鼠，摘取全胃并清洗，肉眼观察胃粘膜情况，并刮取胃粘膜组织，大小约0.5 ㎝×1.0 ㎝，置于10%中性甲醛固定液中固定24 h。采用S-P 法染色，切片常规脱蜡水化，柠檬酸缓冲液热修复。兔抗鼠单克隆抗体EGF、EGFR（ 按1：100 稀释）4 ℃孵育过夜。其他操作步骤，按试剂盒说明书进行。对照实验用PBS 替代一抗进行上述免疫组化反应，光学显微镜观察阳性表达。结果以细胞膜和细胞质内出现棕黄色颗粒为判定标准。按阳性区域表达由强至弱分为：强阳性(+++)、阳性(++)、弱阳性(+)、阴性(－) ［4］。GD-8 病理摄像多媒体分析仪在电脑上对图片进行分析，由电脑自动得出每张片的灰度值和光密度值，再求出平均值。观察比较各组表达，并进行量效比较。
2.3.4 Real-time PCR 法，对胃粘膜及EGFmRNA 行定量检测和分析
①提取总RNA 及反转录反应 Trizol 一步法提取总RNA。
紫外-分光光度计测定所提取RNA 浓度。反转录反应体系：总RNA 2Lg，Oligo dT(0.5 g/mL) 2μL，dNTP(10mmol/mL)3μL，DTT(0.1 mol/mL)2μL，Rna-seinhibitor(40 U/μL )1μL，MMLV-RT(200 U/μL) 1μL，5×MMLV-RT Buffer 6μL，加入DEPC 处理过的无菌水至30μL；反应条件：45℃反应1 h，95℃5 min 终止反应。
②Real-time PCR 反应
20μL 的PCR 反应体系含：10μL 的2×SYBR Green PCRMaster Mix，5.4μL 的RNaseFree Water，上、下游引物(0.05 mg/mL)各1.8μL 和1μL 的cDNA。反应条件：预变性，94℃，5min；变性，95℃，30s；退火，58℃，30s；延伸，72℃，30s；共进行40 个循环的扩增，72℃后延伸5min。实验中同步进行内参基因B-actin 的定量检测，以目的基因与内参基因相对浓度比作为目的基因的相对表达量。扩增反应在ABI7000 荧光定量PCR 仪上进行，各样品的荧光信号值由荧光定量PCR 仪的支持软件ABIPrism7000SDS software 实时产生并自动计算定量数值。
2.4 统计方法 各样品目标基因的相对表达水平通过内参基因进行校准后用 x ± s 表示，组间差异使用 t 检验。计数资料用PEMS3.1 软件分析，比较用x2 检验，所有数据均采用SPSS 13.0 统计软件进行分析。P<0.05 为有统计学意义。
3.结果：
3.1 一般情况观察：造模成功后，除N 组外，其他各组大鼠均出现活动减少，饮食量减少，蜷卧嗜睡，脱毛，便溏，体质量下降。随灌胃（造模）次数的增加，上述症状更加明显。
3.2 大体观察 模型组胃粘膜皱襞变浅或消失，有圆形溃疡形成，直径约在0.3-0.5 ㎝之间，中心颜色苍白，边界清楚，底部平坦，溃疡周围胃粘膜充血、水肿明显。海南砂仁低剂量组胃粘膜皱襞存在，可见直径约0.1-0.3 ㎝溃疡面，溃疡周围胃粘膜轻微充血；海南砂仁高剂量组胃粘膜皱襞基本正常，无溃疡面；普萘洛尔组皱襞存在，未见溃疡面。
3.3 溃疡指数
表 1 给药后各组大鼠溃疡指数比较（ x ± s）
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表2 显示：正常组呈弱阳性表达；模型组EGF 及EGFR的表达均略高于正常组；干预后EGF 及EGFR 的表达均明显高于模型组（P <0.05）；尤以海南砂仁高剂量组显著（P <0.01）。其表达主要在胃底腺细胞的细胞膜和细胞质。低、高剂量组间有显著差异(P <0.05)；西药组与高剂量组无差异（P >0.05）
3.5 各组大鼠胃粘膜EGFmRNA 蛋白表达 见表3、图1
表 3 各组大鼠胃粘膜 EGFmRNA蛋白表达（ x ± s ）
图1 显示：EGFmRNA 在模型组和正常组比较无差异（P>0.05），与砂仁低剂量组无明显差异（P>0.05），高剂量组和西药组均有明显升高，两组的效果最接近(P>0.05)。
4 讨论
肝纤维化或肝硬化合并消化性溃疡，称为肝源性溃疡（HU）。其临床特点与一般消化性溃疡相似，但也有其自身特点。溃疡病变部位以胃窦部溃疡多见。
EGF 是一种含有53 个氨基酸的单链多肽，具有广泛的生物学作用，与消化系统的关系密切，它可抑制胃酸分泌，促进胃肠粘膜上皮的分化、增生，促进成纤维细胞的生长以及胶原产生的作用，能显著增加胃粘膜血流，参与粘膜上皮的更新以及损伤后的修复，是一种重要的促进溃疡愈合的调节因子［5-6］。但EGF 发挥作用依赖与其受体EGFR 的特异性结合。
EGFR 是一种具有酪氨酸活性的重要跨膜受体，参与调节胃粘膜上皮更新和修复过程。研究发现大鼠胃粘膜组织EGF 与EGFR 的表达有同步性，且与胃溃疡愈合质量一致 ［ 7 ］。Tarnawski 的研究发现［8］当胃粘膜发生溃疡后，损伤组织边缘粘膜EGF 及EGFR 表达增加，在两者的作用下，粘膜上皮成分发生增殖、移行，逐渐覆盖溃疡底部，促进溃疡愈合。中医对此病的认识，认为是因外感六淫、饮食劳伤、七情内伤等病因，导致脏腑的功能异常，肝失疏泄、脾失运化，气机失调，气血运行不畅，气滞血瘀；津液输布异常，痰湿停聚。而胃为多气多血之腑，当气机不畅，阴血亏损，血脉瘀阻时，胃粘膜的微循环受到影响，导致粘膜的局部缺氧缺血而产生胃粘膜损伤的病变。海南砂仁属于四大南药之一，药物有效成分为砂仁挥发油（挥发油成分主要包括乙酸乙脑酯5%-47%、樟脑4%-17%、龙脑1.5%-6%等），性味辛温，气味芳香，归脾胃经，具有健脾化湿，行气止痛，温脾止泻等作用。在中医治疗胃肠疾病中应用广泛，具有确切的疗效。常用于腹痛胀满、食欲不振、恶心呕吐，反酸嗳气等症。
从本研究结果分析：正常大鼠胃粘膜呈弱阳性，说明EGF及EGFR 是维持胃黏膜完整性的结构基础，其他各组在胃粘膜受损后，EGF 及EGFR 表达均有提高，尤其在溃疡边缘EGF、EGFR 表达明显增强，说明在胃粘膜受损的组织修复过程中，胃粘膜自身可产生EGF、EGFR 参与粘膜修复。砂仁组能明显提高两者的表达，与西药组相比，砂仁高剂量组有明显提高。表明砂仁可能通过加强EGF 与EGFR 的特异性结合，促进胃粘膜组织的再生、重建和修复。这可能是砂仁治疗消化性溃疡的主要机制之一。
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［8］Tarnawski A，Jone MK.The role of epidermal growthfactor(EGF) and its receptor in mucosal protection，adaptationtoinjury ， and ulcer healing ： involvement of EGF-Rsignaltransduction pathways ［J］.J Clin Gastroenterol，1998，27(Suppl1)：S12-20.
第一作者：高湲，硕士，教授，从事中医消化病研究，Tel：0898-66890539，E-mail：2524106149@qq.com
通讯地址：海口市城西学院路3 号海南医学院中医学院
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E-mail：2524106149@qq.com
收稿日期：
基金项目： 2014 年海南省自然科学基金资助项目（814302）
通讯作者：孙涛，硕士，讲师，中医脾胃病研究，Tel：13700440416，E-mail：444822696@qq.com
论文作者:高湲 孙涛 谢毅强 杨世忠
论文发表刊物:《系统医学》2015年第1卷第9期
论文发表时间:2016/2/18
标签：砂仁论文; 海南论文; 胃粘膜论文; 溃疡论文; 大鼠论文; 剂量论文; 模型论文; 《系统医学》2015年第1卷第9期论文;