沙珊珊[1]2004年在《结核分枝杆菌Rv2032和Rv3127的克隆、表达与功能鉴定》文中进行了进一步梳理结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) H37Rv 菌株基因组测序工作的完成为加深理解这种病原菌的生物学特性以及研发新的抗结核药物提供了基础。H37Rv 菌株的基因组大小为 4411529 bp,约含 4000 个基因,其中 700 个基因与细胞壁的代谢有关,但部分基因的功能尚未确定。结核分枝杆菌细胞壁是细菌特有的、赖以生存的结构基础。其核心结构由最内层的肽聚糖 (Peptidoglycan, PG)、中间层的聚阿拉伯糖半乳糖 (Aribinangalactan, AG) 以及最外层的分枝菌酸 (Mycolic acid) 所构成。聚阿拉伯糖半乳糖为连接肽聚糖和分枝菌酸、维持细胞壁结构完整性的重要组分,所以可作为研发新一代抗结核药物的理想靶标。因此,有必要深入研究聚阿拉伯糖半乳糖结构及其合成与分解代谢规律。1996年,辛毅博士首次在耻垢分枝杆菌 (Mycobacterium smegmatics) 中发现了一种内源性的能降解AG的聚阿拉伯糖水解酶,并在2001年完成了此酶的初步纯化及酶蛋白的N-末端氨基酸序列 (MPAPAVPQSVITEAVGLA-) 测定。将N-末端氨基酸序列与耻垢分枝杆菌基因组数据库进行BLAST分析,得到编码耻垢分枝杆菌聚阿拉伯糖水解酶的基因ara及聚阿拉伯糖水解酶的氨基酸序列。无致病性的耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌同属分枝杆菌,二者具有相似的细胞壁结构。将耻垢分枝杆菌聚阿拉伯糖水解酶的氨基酸序列与结核分枝杆菌基因组数据库进行BLAST分析,在结核分枝杆菌中有两种未知功能的蛋白质Rv2032和Rv3127与耻垢分枝杆菌聚阿拉伯糖水解酶分别有50% 和39% 同源性。本论文的目的是 (1) 从结核分枝杆菌中分别克隆Rv2032和Rv3127基因;(2)构建以大肠杆菌为宿主的表达质粒pET16b-Rv2032 和
方海红[2]2011年在《结核分枝杆菌二级信使环二鸟苷酸的生理功能》文中指出结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)通过气溶胶方式感染人体后,在肺泡部位增殖引起肺部炎症,经过一个快速增长时期,多数形成典型的肉芽肿组织病灶。随着适应性细胞免疫的建立,细菌不再增殖,而是以潜伏状态存在于体内。当机体再次受到外来生物或者化学因素的刺激后,潜伏的细菌可复苏,大量增殖,形成原发后感染特点。因此多数学者认为结核分枝杆菌的休眠状态对应于细菌的持留感染过程是结核分枝杆菌成功感染人类的重要模式。中国的结核病发病率高居世界第二位,对于结核分枝杆菌深入细致的研究刻不容缓。数个基因可能编码休眠的重要调控子称为休眠存活调节子(dormancysurvival regulator,dosR),是通过dosR-dosS二元组分系统的基因调节过程发挥作用。持续感染时细菌的另一个重要上调基因种类是毒素-抗毒素(tonxin-antitoxin,TA)基因座,TA基因座产生的毒素被短期存活的抗毒素中和,当子细胞丢失这种携带TA基因座的基因时,抗毒素就被降解允许毒素杀死细菌。TA基因座可以受诸如缺氧、饥饿等环境因素的上调,启动一个细菌的代谢停止,最终促进休眠。长期进化过程,MTB还形成了一些适应吞噬体内增殖的生存策略。包括胞内的氧化和硝化应激,活性氧和活性氮中间体的解毒,蛋白修复和降解,DNA修复、保护和突变。因此MTB是较为典型的兼性胞内寄生菌,也可以作为细菌慢性感染的一个重要机制。细菌胞内二级信使环二鸟苷酸(c-di-GMP)首次在葡萄相关的木葡糖酸醋杆菌(Acetobacter xylinum)中被鉴定为纤维素合成酶的变构刺激子,二鸟苷环化酶(DGC)和磷酸二酯酶(PDE)为c-di-GMP的合成酶和水解酶。DGC和PDE都包含两个保守的结构域,分别称为GGDEF和EAL。系统发育分布研究显示编码GGDEF和EAL结构域的基因在细菌中广泛并相对特异存在,但在真核细胞或者古细菌中目前没有被报道。胞内c-di-GMP的浓度和作用机制通过多种方式进行调节,能调控细菌的细胞-细胞间信号通讯,生物膜形成,运动性,分化(变异)和毒力等一系列生理过程。但这些结论多是从快速生长细菌中获得的,在慢生长菌MTB的具体作用模式仍然不清楚。那么c-di-GMP在MTB中是否也发挥着重要的生理作用呢?胞内c-di-GMP是否能感应外界环境的变化从而启动MTB的休眠?我们的研究就是试图阐述c-di-GMP这种二级信使在Mtb感染过程发挥的作用。利用生物信息学方法比对发现MTB减毒株H37Ra和毒力株H37Rv中仅含有一个GGDEF结构域的基因MRA_1362和Rv1354c以及一个EAL结构域的基因MRA_1365和Rv1357c,而且氨基酸序列完全一致。体外表达显示MRA_1362基因编码产物具有将GTP合成c-di-GMP的功能。随后我们利用同源重组的原理,建立了MTB的基因敲除体系,将MTBH37Ra中c-di-GMP的合成酶基因敲除(基因编号分别为MRA_1362),获得基因敲除株△Ra1362,发现△Ra1362形成生物膜的速度比野生株更快,而△Ra1365则滞后；转录谱基因芯片结果也显示△Ra1362中部分与休眠相关的基因表达水平下调并能被基因回补和外源添加的c-di-GMP所补偿；在快速耗氧模型中,发现迟缓期过后ARa1362对氧气的消耗更快,但胞内NAD、NADH能量水平反而下降,推测该菌以更快的利用氧气的速度来补偿无感应状态。这些实验说明MTB依赖c-di-GMP感应缺氧或者氧化还原压力,一方面调控生物膜的发育；另一方面合成缺失后在缺氧时部分dosR调节子基因下降表达。而在毒力株H37Rv中将c-di-GMP降解酶基因Rv1357c敲除后,感染小鼠42天后,跟WT感染组相比,发现在感染鼠肺组织细菌的CFU并没有明显差异,但组织病理学显示敲除株出现的实质性病变较野生型更加明显,肺重也明显增大,提示在小鼠内的致病性增强。从而推测体外培养时随着细菌增殖以及胞内c-di-GMP浓度增加,感应外界环境中的缺氧压力,细菌不易形成生物膜,而感染动物时不易成膜的特性利于细菌在组织间的扩散,从而使细菌在肺内引起更明显病变,炎症反应加重。该研究首次报道认为在MTB中c-di-GMP可发挥第二信使功能,体外抑制生物膜发育,使得细菌致病性增强。C-di-GMP亦可通过感应低氧压力调节部分与休眠有关基因的表达。
参考文献：
[1]. 结核分枝杆菌Rv2032和Rv3127的克隆、表达与功能鉴定[D]. 沙珊珊. 大连医科大学. 2004
[2]. 结核分枝杆菌二级信使环二鸟苷酸的生理功能[D]. 方海红. 中国科学技术大学. 2011