（浙江省嘉兴第二医院 浙江嘉兴 314000）
【摘要】目的：研究猫爪草多糖的体外抗乳腺癌活性。方法：选取了多糖提取物的不同浓度，采用MTT法和流式细胞术考察其对人乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用和细胞凋亡。结果：猫爪草多糖对人乳腺癌MCF-7细胞株的生长有不同程度的影响，与空白对照组比较差异有显著性；流式细胞术显示其能诱导细胞凋亡；另外，还能增强NK细胞活性。结论：猫爪草多糖具有较好的体外抗乳腺癌活性。
【关键词】猫爪草；多糖；MCF-7
【中图分类号】R73-3 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）03-0028-02
猫爪草Radix ranunculus ternati系毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatusThunb.的干燥块根[1]，别名为三散草(浙江)、猫爪儿草(河南)、猫爪子(河南)、鸭脚板(安徽)、金华草(广西)[2]，原主产于我国河南信阳地区的信阳、横川、息县及驻马店地区的正阳、确山，现长江中、下游各省，浙江、江苏、安徽、江西、台湾、广西、河南、湖北、湖南、四川、云南、贵州等地均有分布[3-5]。猫爪草的化学成分非常复杂，中国医学科学院药物所测定，猫爪草含糖16%、油1.2%、植物碱很少[6]；日本学者从其变种Rnaunuclus ternatus var.glaber的地上部分分离鉴定出葡萄糖、阿拉伯糖及半乳糖等单糖成分[7-8]。经多年临床验证，猫爪草对恶性淋巴瘤、甲状腺瘤和乳腺肿瘤等具有较好的效果[9-10]，但有关猫爪草抗肿瘤的有效成分及作用机制尚不清楚。鉴于猫爪草入药常以水煎煮用之,且经初步预试,猫爪草中多糖含量较高。为此本实验对猫爪草多糖进行提取,研究其对体外培养人乳腺癌细胞株MCF-7的作用,以寻找猫爪草抗肿瘤的有效部位及作用机理,为临床治疗肿瘤提供理论依据。
1.实验材料
1.1 药品与试剂
猫爪草（本校药学院提供,产地河南信阳,经鉴定为毛茛科植物小毛茛的干燥块根）；RPMll640培养基 (GIBCOBRL公司产品)；MTT（Sigma公司）；氟脲嘧啶（江苏恒瑞医药股份有限公司）；葡萄糖对照品和其它相关试剂均为分析纯。
1.2 主要仪器
AE31型倒置相差显微镜（Motic公司）；超净工作台SW-CJ-IF型（苏州净化设备厂）；全自动酶标仪(Mod550型,美国BioRad公司)；低温冷冻离心机（Eppendorf，德国）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；血球计数板（上海求精生化仪器厂）。
1.3 人乳腺癌细胞株MCF-7
本院药理教研室提供
2.实验方法
2.1 猫爪草多糖的提取纯化
采用水提醇沉和svega法[11]提取和纯化多糖精密称取晾干的猫爪草粉末100g,置入索氏提取器中,依次用石油醚(30℃～60℃),乙醚和乙醇回流提取4小时,残渣挥干溶剂后,再以水回流提取4小时,减压浓缩至一半体积,加入0.1%活性炭,脱色、过滤,滤液加入95%乙醇使溶液含醇80%,静置过液、过滤,残渣用乙醚、无水乙醇反复洗涤,得猫爪草粗多糖,加水溶解成10%糖溶液，svega法脱蛋白，水溶液低温冷冻干燥得猫爪草总多糖备用。
2.2 猫爪草多糖对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖的抑制效应
取对数生长期MCF-7接种于96孔板,每孔5×103个细胞,过夜培养，加入皂苷,配成质量浓度分别为12.5、25.0、,50.0、100、200、400mg/L,每一浓度设3个平行孔,另设空白对照组、5-Fu组(50mg?L-1)。培养48h。加入5g/L的MTT,再培养4h。倒尽培养液,各孔加150μLDMSO,轻轻振动后,用酶标仪(波长570nm)测定各孔的光密度(OD)值,取每组平均OD值,绘制量-效曲线,计算细胞生长抑制率。
抑制率(%)=(1-加药孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100%。
2.3 流式细胞术(FCM)
猫爪草多糖(500mg/L)作用MCF-7细胞72h后,收集细胞,PBS反复洗涤、离心。75%乙醇,4℃固定过夜。加200μL RNA酶溶液(5g/L),37℃,30min,冰浴终止细胞悬液加PI(50mg/L)染色,4℃,30min,FCM(波长488nm)测定细胞周期。
2.4 自然杀伤(NK)细胞活性测定
脾细胞体积分数为1×107/mL,靶细胞MCF-7分积分数为5×105/mL,效-靶为20∶1,效应、靶细胞各取100μL,自然释放组以培养液代替效应细胞,最大释放组以1% NP40代替效应细胞,37℃孵育2h后终止效靶反应,1500r/min离心5min,取上清每孔100μL于96孔板中,37℃预热,加入底物液每孔100μL,室温静置10min,加入0.1mol/L柠檬酸30μL,终止酶促反应。测定570nm处OD值,计算：自然杀伤率（%）=(样品释放OD值-自然释放OD值)/(最大释放OD值-自然释放OD值)×100%。
2.5 统计学方法
实验数据采用SPSS 13.0软件分析，两组间比较采用t检验，多组间两两比较采用单因素方差分析。
3.实验结果
3.1 猫爪草多糖对MCF-7细胞株的抑制作用
不同剂量猫爪草多糖对MCF-7细胞株的抑制作用见表1，猫爪草多糖各剂量组均能不同程度的抑制人乳腺癌细胞株MCF-7的生长，且多糖浓度越大，抑制效果越明显，呈现明显的剂量依赖性。当多糖浓度在50.0～200 mg/L时，给药组与空白对照组呈现显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。
4.讨论
多糖广泛存在于自然界的植物里，尤其为多种中药中有效成份之一，其特点是具有多种的生物活性，如抗肿瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗放射、降血糖、降血脂，是较理想的免疫增强剂，临床研究能抗肿瘤坏死因子产生[12-13]。曾有人从微量元素与健康的角度认为，癌症患者血清中Cu/Zn值升高，而猫爪草Cu/Zn值趋向与癌症患者Cu/Zn相反，因此可能有助于调节患者体内Cu、Zn平衡而发挥抗癌效果[14]，又有研究[15]表明猫爪草70%的乙醇浸膏对肿瘤坏死因子(TNF)具有较强的诱生作用。
本实验采用水提醇沉和svega法对猫爪草总多糖进行了提取和纯化，并对提取物进行了体外抗乳腺癌作用的初步研究。结果显示，猫爪草多糖对人乳腺癌MCF-7细胞株的生长有不同程度的影响，与空白对照组比较差异有显著性。本实验采用MTT、FCM进一步证实，体外抗肿瘤作用机制可能是通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡，并阻滞细胞周期而抑制DNA的合成，抑制了肿瘤细胞的分裂。实验还证实，不同剂量猫爪草多糖还能显著提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤率，提高机体免疫功能。猫爪草在我国资源丰富，对于其抗乳腺癌有效成分及其结构和确切的作用机制的进一步研究意义重大。
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论文作者:陶立君
论文发表刊物:《心理医生》2016年3期
论文发表时间:2016/7/29
标签：猫爪草论文; 多糖论文; 细胞论文; 细胞株论文; 作用论文; 乳腺癌论文; 抑制论文; 《心理医生》2016年3期论文;