任力强[1]1990年在《小鼠白细胞介素4基因的化学合成、克隆和表达》文中提出本文化学合成了小鼠白细胞介素4(Interleukin 4，IL—4)基因，在大肠杆菌中成功地进行了克隆和表达，并对化学合成基因在大肠杆菌中的表达情况进行了分析，设计的基因序列特点为以后在真核细胞中表达奠定了基础，以期用基因工程手段来生产小鼠白细胞介素4，供其基础理论研究的需要。 实验将小鼠IL—4全基因的442碱基对(base-pair，bp)分为29个寡聚DNA片段，利用381A型DNA合成仪进行了全化学合成，设计的基因序列5’端带有Hind Ⅲ，EcoRI酶切位点和ATG起始码，3’端带有TAA、TAG两个终止码和HindⅢ酶切位点，有利于基因克隆操作。以基因中的Pstl酶切位点为界，用pUC12质粒作载体，将所有合成的DNA片段分前、后两组进行克隆，并转化大肠杆菌JM103，根据前、后两段基因序列的不同，选择了不同的克隆实验条件，得到了pUC12A和pUC12B两种重组克隆质粒，经DNA序列分析，肯定了pUC12A和pUC12B中所含的小鼠IL—4的前后两半基因片段的核苷酸序列完全正确。将pUC12A和pUC12B中所含的两个基因片段连接起来，插入到pUC12质粒中，得到了含小鼠IL—4全基因片段的重组质粒pFR101。 从pFR101质粒中切下小鼠IL—4基因片段，分别插入到pRC23，pSM43和pSM53三种不同的大肠杆菌表达质粒中，转化大肠杆菌TAP106，分别得到了TAP106(pFR102)，TAP106(pFR103)，TAP106(pFR104)和TAP106(pFR105)四种大肠杆菌克隆。经42℃诱导，提取四种细菌的总RNA，通过RNA打点杂交和Northern转移杂交，发现TAP106(pFR105)细菌中IL—4 mRNA的表达量最高，并在TAP106
任力强, 陈南春, 陈苏民, 苏成芝, 金伯泉[2]1992年在《小鼠白细胞介素4基因的化学合成、克隆与表达》文中进行了进一步梳理利用381A型DNA合成仪,分29个寡聚核苷酸片段化学合成了小鼠IL-4全基因,共442bp。以pUC12质粒作为载体,将所有合成片段分前后两组进行磷酸化、退火、连接和克隆,经过菌落原位杂交、酶切鉴定和质粒DNA序列分析,分别得到了含有小鼠IL-4前后两半基因片段的两种重组质粒,回收前半基因片段,插入到含有后半基因重组质粒的EcoRI和PstI酶切位点之间,成功地得到了含有小鼠IL-4全基因的重组质粒pFR101。将全合成基因插入到质粒pSM53中,得表达质粒pFR105,转化大肠杆菌TAP106,根据IL-4对CTLL细胞的作用,肯定了TAP106(pFR105)细菌中有小鼠IL-4活性蛋白的表达。
武梅[3]2002年在《成华猪白细胞介素—4基因克隆及表达效应研究》文中进行了进一步梳理增强动物抗病防御和免疫应答能力，提高疫苗保护率是当前防治传染性疾病最可靠的简便途径。鉴于传统的药物治疗和常规疫苗接种已不能保障现代畜牧业的健康高效发展，动物免疫抑制和疫苗免疫应答及保护水平下降已严重制约对传染性疾病的防治。因此，研制和应用新型高效动物免疫增强剂对防治动物的传染性疾病具有十分重要的现实意义。近年来，随着分子生物学和免疫学的进展，表明细胞因子基因免疫增强剂不仅安全，而且可调节体液免疫和细胞免疫应答，适于多种抗原疫苗，具有广阔的前景。细胞因子DNA已被初步证实能够显著增强病毒和细菌以及寄生虫抗原基因的免疫应答。细胞因子作为疫苗的高效免疫增强剂已成为免疫佐剂研究的新方向。 鉴于白细胞介素-4是动物免疫应答调节中十分重要的细胞因子，国内外对猪淋巴细胞白细胞介素-4基因的研究甚少，还未见到对其在体内外转基因表达及其对动物免疫系统和免疫应答反应的深入研究；尤其是国内外还没有猪白细胞介素-4真核表达质粒作为分子免疫佐剂与其它分子免疫增强剂协同作用对猪常规疫苗免疫应答水平影响的研究报道。而白细胞介素-4在猪的免疫防御和免疫应答调节中发挥着非常重要的作用，因此，我们进行了猪白细胞介素-4基因的克隆及其在体内外转基因表达、对免疫系统和对猪瘟、猪肺疫和猪丹毒三联疫苗以及猪副伤寒疫苗的免疫应答的作用及机理进行了较系统的研究。 首先，我们将猪外周血淋巴细胞在Con A的刺激下培养48h后，应用RT-PCR扩增猪淋巴细胞白细胞介素-4基因，首次克隆报导了成华猪淋巴细胞白细胞介素-4基因(PIL-4)，并在GenBank数据库中登记(登记号：AF493991)。序列分析表明PIL-4的cDNA长度为413bp，开放阅读框为402bp，由134个氨基酸残基构成，分子量15.0KDa，等电点8.24。将得到的序列在CenBank和EMBL数据库中进行了同源比较，结果表明它与来源于长白猪肠粘膜固有层淋巴细胞的白细胞介素-4有99％同源，与来源于杂交猪T细胞的白介素-4有96％同源，说明猪种及组织细胞来源的不同可能使基因有一定的差 成华槽自匆血介刁卜4吞旧义险及 纪 异。证明本实验克隆到了猪白细胞介素一的全基因。 第二，将克隆到的成华猪淋巴细胞白细胞介素叶基因亚克隆到真核表达 型载体 VR 020上，通过菌落 PCR的方法在转化子中筛选阳性克隆，用 B3m H I酶切初步鉴定重组子，用 BgllP PmaCI双酶切确定基因插入相位正确的 重组子。得到的重组真核表达质粒转染C朋7细胞株，RTqCR检测PIL－4 的转录表达：用猪淋巴母细胞增殖实验检测＊几4在真核细胞中表达产物对 猪淋巴细胞的刺激活性；用小鼠脾淋巴母细胞增殖实验检测PIL4真核表达 产物对小鼠淋巴细胞的刺激活性；并通过吸附实验检测PIL－4在真核细胞中 表达产物与小鼠脾淋巴细胞上相应受体的吸附情况。结果表明：通过菌落 PCR和酶切分析，得到PIL＊基因以正确插人方向的重组真核表达质粒，命 名为 VPIL－4：重组质粒转染 COS7细胞株后，RTPCR结果显示转染细胞总 RNA中含有PIL－4对应的InRNA：猪淋巴母细胞增殖实验证明VPIL4在转 染C。s7细胞株后，能够表达出有生物活性的猪PIL4蛋白质，对猪淋巴细胞 具有增殖作用；小鼠脾淋巴细胞母细胞增殖实验首次证实猪白细胞介素4能 够刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，受体吸附检测表明P兀4在真核细胞中表达产 物能与小鼠脾淋巴细胞上的相应受体结合，为研究以小鼠作为实验动物探讨 PIL4的兔疫调节作用提供了可靠依据。这些结果表明已成功构建了能正确 表达PIL斗的真核表达质粒，其表达产物具有正常的生物学活性。 第三，探讨白细胞介素．4基因的真核质粒在动物体内转基因表达对动物 体液和细胞免疫的影响，增强白细胞介素－4基因真核质粒诱导动物体液和细 胞免疫应答的方法，是本项研究的重要目的之一。我们制备了阳离子脂质体 和纳米颗粒0LG）；把VPL＊质粒分别用脂质体和聚丙交酯乙交酯（PLG） 纳米颗粒包装，本实验还人工合成了80hp的兔疫刺激序列CpG短序，构建 了含有CpG基序的pUC18（pG质粒，与猪瘟猪肺疫猪丹毒三联茵和猪副伤 寒疫苗联合免疫小鼠，首次系统地研究了猪白细胞介素4基因的真核质粒在 不同免疫佐剂的协同作用下对小鼠细胞免疫和体液兔疫的影响情况；比较了 不同的免疫刺激分子影响小鼠对疫苗的体液和细胞免疫应答情况。实验结果 首次发现：在猪VPIL斗质粒作为免疫增强剂时，小鼠的总IgG和特异性抗 体水平比对照组显著升高；同时，兔疫细胞数量、淋巴细胞增殖活性和白细 胞介素．2的诱生活性明显增加；与阳离子脂质体及PLG纳米颗粒联合使用。 在减少质粒剂量的情况下，同样可以显著提高实验动物的IgG含量、免疫细 胞数量、淋巴细胞增殖活性及几－2诱生活性，
谭俊杰[4]2006年在《猪生长激素基因与白介素-6基因的联合表达效应分析》文中进行了进一步梳理本实验室将克隆到的猪生长激素(pGH)基因亚克隆到真核表达载体VR1020上，得到pGH基因以正确方向插入的重组真核表达质粒，命名为VpGH；将克隆到的猪白细胞介素6(pIL-6)基因按同样方法构建重组真核表达质粒，命名为VpIL-6。将此二种重组真核表达质粒转化大肠杆菌TOP10F’，用质粒PCR和酶切的方法验证了此重组质粒为正确插入序列，并大量制备此二种重组真核表达质粒。以薄膜法制备阳离子脂质体，分别包裹VpGH基因、VpGH与VpIL-6基因联合表达后，肌肉注射1周龄昆明小鼠。在注射后的0，7，14，21，28，35天称其体重，同时每周断尾采血分离血清，用ELISA分析免疫小鼠GH，IgG水平，检测白细胞、红细胞、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞数量的变化。实验结果表明，脂质体包裹VpGH与VpIL-6基因联合注射小鼠较单纯注射VpGH基因试剂的小鼠在体重增长幅度上有显著增强(P＜0.05)，而二者在细胞免疫和体液免疫反应上无显著差异。 根据小鼠实验所得到的结果我们将这种基因试剂在猪身上做了实验。将阳离子脂质体包裹VpGH基因、VpGH与VpIL-6基因联合表达试剂注射实验猪，检测了猪的增重情况。结果发现，与单纯注射VpGH基因的猪相比，注射VpGH与
张志红[5]2005年在《烟曲霉菌与气道上皮细胞的相互作用》文中进行了进一步梳理背景 哮喘急性发作及死亡率表现出明显的季节性和昼夜节律性。烟曲霉菌孢子是空气中传播最广的霉菌之一,遍布室内外,其孢子直径在2-3μm,能被人吸入并且到达各级支气管和肺泡。孢子被吸入呼吸道后,可能会被清除,也可能会黏附到气道上皮细胞表面,接着芽生,而其芽生后的菌丝成为烟曲霉菌致病的主要形式。研究发现对烟曲霉菌过敏的人很多,表现出过敏性支气管肺曲霉菌病和哮喘样反应,甚至致死。气道上皮组织连接内外环境,除具备生理屏障作用外,在局部炎症反应中亦起重要作用,它可能通过其表面的Toll样受体识别微生物的某些成分从而参与机体先天免疫反应,Toll样受体则是连接先天免疫和获得性免疫反应的桥梁。此外,气道上皮还是炎症产物的重要来源,可以产生重要的炎症介质,如白细胞介素(Interleukin,IL)IL-6和IL-8。 目的 (1) 研究烟曲霉菌与呼吸道上皮细胞的相互作用及可能的ABPA和哮喘样反应的机制;(2) 研究呼吸道上皮细胞识别微生物的可能受体机制。 方法 (1) 将A549细胞和原代支气管上皮细胞分别与经不同方法处理的烟曲霉菌菌丝片段和孢子共培养,镜下观察上皮细胞形态学改变;菌丝以及孢子的黏附作用 (2) 同时收取培养悬浮液;(3) 制备cytospin,MGG染色观察气道上皮细胞系A549对于孢子的吞噬作用;(4) 免疫组化染色检测气道上皮细胞系A549上TLR2和TLR4的表达以及(5) 测定培养悬浮液内IL-6和IL-8水平。 结果 (1) A549以及支气管原代细胞形态学改变 在与酵母菌多聚糖、热灭活菌丝片段、射线灭活菌丝片段、灭活孢子、TNF-α共培养24小时后,A549细胞形态和支气管原代细胞形态未发生明
参考文献：
[1]. 小鼠白细胞介素4基因的化学合成、克隆和表达[D]. 任力强. 第四军医大学. 1990
[2]. 小鼠白细胞介素4基因的化学合成、克隆与表达[J]. 任力强, 陈南春, 陈苏民, 苏成芝, 金伯泉. 生物化学杂志. 1992
[3]. 成华猪白细胞介素—4基因克隆及表达效应研究[D]. 武梅. 四川大学. 2002
[4]. 猪生长激素基因与白介素-6基因的联合表达效应分析[D]. 谭俊杰. 四川大学. 2006
[5]. 烟曲霉菌与气道上皮细胞的相互作用[D]. 张志红. 安徽医科大学. 2005