宋晓燕[1]2000年在《剪切力对鼠脑微血管内皮细胞骨架蛋白和黏附分子的影响及其机制研究》文中研究说明为探索剪切力对内皮细胞作用的信号传导途径，以鼠脑微血管内皮细胞为研究对象，运用荧光染色、免疫组化染色等定性定量方法辅以计算机图象处理，对微血管骨架结构和黏附分子ICAM-1在剪切力作用下的变化规律进行了研究。对揭示剪切力在动脉粥样硬化和脑血栓形成等心脑血管疾病发病机理中所起的作用提供了有意义的线索。 在骨架结构的研究中我们发现：与对照组相比，单向流动剪切力作用后细胞骨架中F-actin的含量明显增加，细胞中出现凝结成束的应力纤维。而双向流动剪切力作用后与对照组相比F-actin的含量没有显著增加，也没有应力纤维出现。实验结果还表明，在细胞松弛素作用后，无论是单向流还是双向流都不能使其含量增加，剪切力作用后细胞的脱落和坏死现象明显。 在黏附分子的研究中我们发现不同于来源于其它动物和组织的内皮细胞，鼠脑微血管内皮细胞在剪切力作用后ICAM-1的表达呈现特有的规律。在剪切力作用半小时后其含量即有显著上升，在4小时左右达到高峰，而在随后其含量又呈现下降的趋势。ICAM-1的表达量与一定范围内剪切力的强度无关。而Tsuboi等~3对人脐静脉内皮细胞上ICAM-1的表达研究表明，剪切力作用一小时后ICAM-1才有显著的增加，高峰期在8小时左右出现，鼠脑微血管内皮细胞上ICAM-1表达增加和高峰出现的时间都要早于脐静脉内皮细胞。这可能是因为微血管内皮细胞与大血管内皮细胞相比，其对剪切力的作用特别敏感，微小的剪切力足以启动引起ICAM-1变化的信号传导途径，因此剪切力的强度增加对ICAM-1的表达影响不大。 我们的研究还发现剪切力作用后的细胞上清液不能明显改变鼠脑微血管内皮细胞的ICAM-1的表达量，说明剪切力导致的ICAM-1含量的变化很有可能是剪切力直接作用于内皮细胞产生的细胞内效应的结果，而非首先引起细胞生化改变，产生释放的细胞因子再引起ICAM-1含量的变化。
王静波[2]2007年在《几种细胞因子和剪切力对人视网膜色素上皮细胞syndecan-1及早期生长反应因子-1表达的影响》文中进行了进一步梳理目的视网膜色素上皮(RPE)细胞参与多种炎性和非炎性眼病的发生和发展,如葡萄膜炎、孔源性视网膜脱离(RRD)、增生性玻璃体视网膜病变(PVR)和年龄相关性黄斑变性(AMD)[1, 2]等。在这些眼病中,RPE细胞的黏附和移行有着重要的作用。细胞只有相互间黏附并黏附于细胞外基质(ECM)上,才能开始移行和增生,并发挥一系列功能。在上述眼病中,RPE细胞可暴露于多种细胞因子[如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)等[3]]、单核/巨噬细胞、玻璃体液[4]和剪切力组成的病理微环境中,这些因子的刺激对于RPE细胞生物学性状和功能的改变起重要作用。细胞黏附对于许多生理病理过程非常重要,如形态形成、免疫反应、伤口愈合等[2],黏附连接是通过连接在细胞骨架上的跨膜黏附蛋白形成的[3]。前期实验表明,黏附分子syndecan-1参与调节RPE细胞的病理生理过程[5],并可能在PVR的发生发展中起作用[6]。在外界微环境发生改变后,细胞的早期基因改变对随后细胞的结构和功能变化起关键作用。早期生长反应因子-1(Egr-1)属于即刻早期反应因子家族,参与多种细胞的反应,包括细胞的生长分化和凋亡、炎性细胞趋化、免疫刺激等。本研究目的在于:①检测可溶性syndecan-1在RRD患者视网膜下液(SRF)和玻璃体液中的水平,及其水平与RRD患者临床参数之间的相关性;②研究刺激因子TNF-α、脂多糖(LPS)、IFN-γ、单核/巨噬细胞(THP-1细胞)上清、玻璃体液和剪切力对体外培养人RPE细胞syndecan-1和Egr-1表达的影响。从而了解syndecan-1和Egr-1在RPE细胞及其相关眼病中的作用,为其防治提供新的思路。方法1.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测RRD患者SRF和玻璃体液中可溶性syndecan-1的水平,并采用多元线性回归方法来评估可溶性syndecan-1的水平与RRD临床参数[年龄、性别、眼别、患眼的屈光状态、RD的程度(累及象限数)、RD发生的时间、是否合并PVR]的相关性。2(.1)分别用40 ng/ml TNF-α、20μg/ml LPS、10 U/ml IFN-γ、30% THP-1细胞上清和50%正常人玻璃体液刺激RPE细胞0、10 h、24 h和48 h,采用免疫荧光染色法、western blot定性定量检测syndecan-1蛋白的表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测syndecan-1 mRNA的表达变化,ELISA测定RPE细胞上清中可溶性syndecan-1的水平。(2)用2 dyns/cm2的剪切力作用于RPE细胞分别达0、15 min、30 min、45 min、1 h和3 h,采用免疫荧光染色法观察细胞骨架肌动蛋白的变化,通过免疫荧光染色法和western blot检测syndecan-1蛋白的表达变化,RT-PCR检测syndecan-1 mRNA的表达。3(.1)分别用40 ng/ml TNF-α、20μg/ml LPS、10 U/ml IFN-γ、30% THP-1细胞上清或50%正常人玻璃体液刺激RPE细胞达0、10 min、20 min、30 min、40 min和60 min,采用免疫荧光染色法和western blot检测Egr-1蛋白的表达水平,RT-PCR检测Egr-1 mRNA的表达变化。(2)用2 dyns/cm2的剪切力作用于RPE细胞达0、15 min、30 min、45 min、1 h和3 h,用western blot和RT-PCR分别检测Egr-1的蛋白和mRNA的表达。结果1.对照组、SRF组和玻璃体液组标本中可溶性syndecan-1的水平分别为0.2236±0.0951 ng/ml,1.4989±0.1836 ng/ml和2.5770±0.5777 ng/ml,与对照组相比,RRD患者SRF和玻璃体液中的可溶性syndecan-1水平分别升高了6倍和11倍。与对照组比较,SRF和玻璃体液组syndecan-1的水平差异均有统计学意义(P=0.006,P=0.000)。SRF组和玻璃体液组可溶性syndecan-1的水平相比,差异也有统计学意义(P=0.015)。在SRF组中,可溶性syndecan-1的水平与RD的发生时间呈正性相关(P<0.0001,r=0.737)。2.(1)在未受刺激的RPE细胞,syndecan-1在细胞膜和细胞浆呈强阳性表达,为强绿色荧光。在TNF-α、LPS、IFN-γ、THP-1细胞上清和玻璃体液刺激后,syndecan-1表达减弱。western blot和RT-PCR结果表明,TNF-α、LPS、IFN-γ、THP-1细胞上清和玻璃体液可下调体外培养人RPE细胞syndecan-1蛋白和mRNA的表达,且使细胞上清中可溶性syndecan-1的水平呈升高趋势。(2)2 dyns/cm2的剪切力作用后,RPE细胞的形态发生变化,细胞间隙增大,细胞皱缩、脱落,骨架肌动蛋白增强、变粗,且沿流动方向重新排列;且剪切力可下调RPE细胞syndecan-1的表达。3.(1)在未刺激的RPE细胞,Egr-1在细胞浆呈弱阳性表达,为淡黄绿色荧光;随着刺激因子的作用,Egr-1的表达明显增强,细胞浆和部分细胞核呈强绿色荧光。western blot和RT-PCR结果表明,TNF-α、LPS、IFN-γ、THP-1细胞上清和玻璃体液刺激1 h内可迅速增强体外培养人RPE细胞Egr-1蛋白和mRNA的表达。(2)2 dyns/cm2的剪切力作用后,RPE细胞Egr-1 mRNA的表达在短时间内迅速增强,并在3 h时降至基线水平。结论1.与正常人玻璃体液中可溶性syndecan-1的低水平相比,RRD患者SRF和玻璃体液中的可溶性syndecan-1水平显著升高;且SRF中可溶性syndecan-1的升高与RD发生的时间呈正性相关。这提示RRD患者SRF和玻璃体液中高水平的可溶性syndecan-1是RRD过程中的损伤修复和炎症反应的结果。2.病理微环境中常见的刺激因子TNF-α、LPS、IFN-γ、单核/巨噬细胞上清、玻璃体液和剪切力可下调体外培养人RPE细胞syndecan-1的表达,且使细胞上清中可溶性syndecan-1的水平呈升高趋势。这与我们观察到的PVR增生膜标本中syndecan-1表达减少或缺失[6]、RRD患者SRF和玻璃体液中可溶性syndecan-1水平升高的结果是一致的。这些结果提示RPE细胞syndecan-1表达的减少或缺失可能降低细胞的黏附性,增加细胞的通透性,从而改变细胞的结构和功能。RPE细胞在常见的刺激因子的作用下,即刻早期基因Egr-1在短时间内快速被激活且持续很短的时间,这一重要转录因子的激活可能参与调节细胞的分化、增生和凋亡。3.剪切力作用后,RPE细胞的形态发生变化,黏附分子syndecan-1的表达减低,Egr-1短时间内被迅速活化并很快降至基线水平。这些改变可能导致RPE细胞黏附、形态和功能的变化,增加了细胞的通透性;Egr-1在细胞转录水平上的调节,可能参与细胞的病理生理过程。
参考文献：
[1]. 剪切力对鼠脑微血管内皮细胞骨架蛋白和黏附分子的影响及其机制研究[D]. 宋晓燕. 北京工业大学. 2000
[2]. 几种细胞因子和剪切力对人视网膜色素上皮细胞syndecan-1及早期生长反应因子-1表达的影响[D]. 王静波. 第四军医大学. 2007