李晓斌[1]2006年在《骨髓干细胞诱导分化的肝细胞移植对大鼠肝切除术后肝衰治疗作用的实验研究》文中研究指明研究背景和目的： 原位肝移植(orthotopic liver transplantation, OLT)是目前治疗急性肝功能衰竭、终末期肝病和代谢性肝病最有效的方法，但由于供肝缺乏等原因在临床广泛开展仍有一定的困难。肝细胞移植(hepatocyte transplantation，HCT)与原位肝移植比较，具有价廉、操作简单、可重复进行、移植细胞可以体外培养增殖及冷冻保存，还可以进行基因修饰等优点。研究发现HCT可以纠正先天性肝脏代谢缺陷、辅助肝功能支持和替代受损肝实质。随着HCT在理论与技术方面不断发展，已逐渐呈现出替代OLT治疗肝病的潜力，当前肝细胞来源短缺、肝细胞移植后增殖能力差及免疫排斥等问题是限制HCT发展的主要原因。 骨髓干细胞(bone marrow stem cell, BMSC)可以横向分化为肝前体细胞和肝细胞，并具有取材容易；增殖能力强；体外培养、传代及扩增容易；可以直接取材于患者本人，能避免移植后免疫排斥反应的发生等特点。用BMSC替代成熟肝细胞进行移植治疗肝病，有望使细胞移植在肝病治疗方面取得重大突破。 BMSC可以通过两种方式对肝脏进行修复，一是直接进行BMSC移植，然后BMSC在体内分化为肝细胞并增殖，从而使肝脏得以修复；二是体外诱导BMSC定向分化为肝细胞或肝前体细胞并传代扩增后再进行移植。目前的研究大都直接进行BMSC移植，关于移植骨髓干细胞体外诱导分化的肝细胞治疗急性肝衰的研究国内外尚无相关报道。 本实验主要研究目的：探讨骨髓干细胞诱导分化的肝细胞移植对肝切除术后肝衰大鼠的治疗作用。 研究方法： 1、复苏大鼠骨髓干细胞诱导分化的肝细胞及检测其功能
梁冬明[2]2004年在《HGF在肝细胞移植治疗大鼠急性肝功能衰竭中的表达》文中研究表明目的: 掌握应用胶原酶溶液作肝脏原位循环灌注,分离、纯化肝细胞的技术;通过同种异体肝细胞经脾脏移植,探讨对于用D-氨基半乳糖诱导的急性肝功能衰竭(Acute liver failure ALF)大鼠治疗作用的机理。方法: 急性药物性肝衰模型:10%D-氨基半乳糖溶液按1.6g/kg一次性大鼠腹腔注射;用叁种不同的液体对肝脏原位灌注,先用含EDTA的D-Hanks液,再用D-Hanks液,最后用胶原酶溶液,分离、纯化的肝细胞制备成肝细胞悬液,浓度为4×107/ml,2小时内经脾脏移植;56只用D-氨基半乳糖诱导急性肝衰大鼠,24小时随机分为两组。Ⅰ组行脾内移植0.5ml(2×107肝细胞)肝细胞悬液,Ⅱ组脾内注入等量盐水,分别于术后6小时、12小时、24小时、48小时观察肝内肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor HGF)、肝功能和肝脏HE染色的变化。结果: 分离纯化的肝细胞悬液细胞总量为2-2.5×108/只,经胎盘兰染色鉴定其活率在95%以上;肝细胞移植组与对照相比较,肝内HGF在24小时内移植组高于对照组(P<0.05),在12小时达高峰,48小时二者无明显区别(P>0.05);肝功能测定,行肝细胞移植后,在12小时内移植组谷丙转氨酶和总胆红素较对照组高(P>0.05),二者差别均有统计学意义,24小时后移植组逐渐恢复正常。各组血清白蛋白的变化不大,二者无统计学意义(P>0.05)。结论: 用上述方法分离的肝细胞活率较高,达95%以上;同种异体肝细胞移植在早期24小时内可刺激受体HGF的产生,从而促进受体肝再生肝功能的恢复。
徐哲[3]2003年在《微载体粘附培养肝细胞的生物学特性及其移植治疗大鼠急性肝衰竭的实验研究》文中提出近年来对急性肝功能衰竭的治疗进展甚微，急性肝功能衰竭病死率依然维持在60％～80％这一令人难以接受的水平。 原位肝移植为急性肝功能衰竭的有效疗法。然而，由于供肝短缺、高费用、高风险、技术要求高、术后需终生免疫抑制治疗等缺点，原位肝移植的实施受到了极大的限制。 为此研究者们提出体外肝脏灌注、生物型人工肝、肝细胞移植等技术，以期为肝功能衰竭患者度过肝脏供体等待期或为肝脏自行修复提供代谢支持。与OLT比较，肝细胞移植操作技术简单、侵袭性小、费用相对低廉、风险小，移植肝细胞可发挥肝脏解毒、合成功能。因此，肝细胞移植有着良好的发展前景。 肝细胞的质与量为肝细胞移植研究中的关键问题，如何方便的获得足够数量和功能良好的肝细胞已成为广大学者关注的焦点。微载体培养技术作为一项体外高密度细胞培养技术，兼有单层培养和悬浮培养的优点，已被用于多种贴壁细胞的培养。 本实验对原代SD大鼠肝细胞行微载体粘附培养、观测其生物学特性，第四军医大月卜布反创匕学位士仑文并将微载体粘附培养肝细胞移植到D一GalN诱导的急性肝功能衰竭大鼠腹腔内，观察其存活率、肝功能生化指标及肝脏病理改变，以评估微载体粘附肝细胞腹腔内移植的疗效，为肝细胞材料的研究打下一定的实验基础，为微载体粘附培养肝细胞移植的临床应用提供实验依据。实验结果如下1.采用Seigen改良二步灌注法，平均每只大鼠分离到的肝细胞数为(1 .21士0.45)xlos，台盼蓝染色示平均活力为93.6%士2.8%。微载体粘附培养肝细胞的正常形态及白蛋白、尿素合成功能可维持1周以上，LDH漏出量、白蛋白及尿素水平一周内呈波动性变化，在培养第3天白蛋白及尿素水平最高、LDH漏出量最低。2.根据不同剂量组(l .8、2.0、2.2叭g)不同时间实验大鼠的临床表现、存活率、肝脏生化指标及肝脏病理方面的变化，选用2.0叭gD一GalN，腹腔注射后24小时作为制备成年SD大鼠急性肝衰竭模型的最适药物剂量和最佳时间。3.微载体组(组3)存活率明显高于空载体组(组l)的同期存活率，移植5天后及以后各时间点两组率比较有显着统计学差异(P<0.05)。微载体粘附肝细胞腹腔内移植组移植14天后57.1%大鼠存活，肝细胞悬液组移植14天后大鼠存活率为41.7%，而同期空载体组大鼠存活率仅巧.4%。4.微载体组肝功能各项指标逐渐下降，移植5天以后肝功能各项指标渐趋正常，与移植第1日有显着统计学差异(P<0.05)。空载体组肝功能各项指标无下降趋势，总胆红素及ALT水平于移植第3日达最高峰。微载体组移植后第3、5天肝功能各项指标均低于空载体组同期水平，两组TBIL水平比较有显着统计学差异(P<0.05)。5.微载体组移植后载体在大鼠上腹部聚集成团，HE染色示肝细胞在微载体周围成团，在移植后第9天这些团块仍能观察到。细胞悬液组移植后肝细胞被大网膜包裹，可短期存活。微载体组肝脏组织学检查示:移植第3一3一第四军医大学布皿士学位士仑文天后肝组织损伤逐渐恢复，移植14天后肝脏除小范围点状坏死外、肝脏基本恢复正常。空载体组幸存鼠的肝脏病变恢复较微载体组及细胞悬液组慢。 结论:胶原酶消化法是肝细胞分离的可行方法，微载体培养肝细胞兼有单层培养及悬浮培养的优点，微载体培养肝细胞在培养第3天有较好功能。腹腔内移植微载体粘附培养肝细胞可对急性肝衰竭大鼠提供代谢支持作用，显着提高急性肝衰竭大鼠的存活率、改善肝功能、减轻肝脏病理改变。
杨耀国[4]2004年在《转化生长因子-β_1在肝细胞移植中的变化及意义》文中认为目的：探讨同种异体肝细胞经脾脏移植对大鼠急性肝功能衰竭的治疗作用；探讨肝组织中转化生长因子-β1mRNA（TGF-β1mRNA）在肝细胞移植治疗肝功能衰竭时的变化及意义。方法：建立大鼠急性药物性肝衰竭模型：10％D－氨基半乳糖（D-gal）溶液按1.6g/kg一次性腹腔注射；肝细胞的分离和纯化：采用肝脏原位灌注法，制备成肝细胞悬液，肝细胞浓度为4×107个/ml，于2小时内经脾脏移植；动物分组：健康成年Wistar大鼠56只制备成急性肝功能衰竭模型并随机分为两组。Ⅰ组为实验组行脾内肝细胞移植，肝细胞悬液的量为0.5 ml/只，Ⅱ组为对照组在脾内注入0.5ml生理盐水。另外取6只用作分离新鲜肝细胞。术后6小时、12小时、24小时、48小时每组分别取5只检测肝脏功能、肝脏病理改变及应用原位杂交技术检测肝脏组织中TGF-β1 mRNA的变化。结果：肝功能变化：血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）6小时和12小时Ⅰ组高于Ⅱ组，差别有统计学意义，P<0.01；ALT在24和48小时Ⅰ组均低于Ⅱ组，差别有统计学意义，P<0.01。总胆红素（TBil）在6小时Ⅰ组高于Ⅱ组，差别有统计学意义, P<0.01；12小时Ⅰ组高于Ⅱ组，差别无统计学意义,在24和48小时Ⅰ组均低于Ⅱ组，差别有统计学意义，P<0.01。肝组织的破坏程度在48小时Ⅰ组比Ⅱ组有较明显的减轻。在各时间点，两组间的白蛋白（ALB）差别无统计学意义。肝脏组织中TGF-β1 mRNA的变化：12小时内两组间无明显区别，24和48小时Ⅰ组均低于Ⅱ组，差别有统计学意义，P<0.01。结论：同种异体肝细胞移植可以改善D-gal诱导的急性肝功能衰竭大鼠的肝脏功能；在24和48小时肝脏组织中的TGF-β1 mRNA Ⅰ组均低于Ⅱ组，可能有利于肝细胞的增殖。
尹川[5]2007年在《肝细胞核因子4诱导肝细胞功能的体外和体内研究》文中研究指明背景与目的:肝细胞移植(hepatocyte transplantation,HCT)是治疗晚期肝硬化和肝功能衰竭的重要方法,但存在的主要问题是供体细胞功能不完善。肝细胞核因子4(hepatocyte nuclear factor, HNF4)是调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能的重要转录蛋白。本实验利用表达HNF4α的腺病毒AdHNF4α对HNF4诱导的肝细胞功能进行了体外和体内的初步研究。方法:本研究首先比较不同肝细胞中HNF4α和肝细胞相关功能基因的表达情况,然后构建了表达HNF4α的腺病毒AdHNF4α,并体外感染人肝肿瘤细胞株(HepG2和Hep3B)以及小鼠胚胎干细胞,分别观察HNF4α基因上调对其生物学功能的影响;并应用HNF4α基因修饰HepG2细胞治疗急性肝功能衰竭小鼠,初步观察小鼠生存率和肝功能改善情况。结果:HNF4α在正常成熟的肝细胞中表达最高,同时肝细胞生物学功能基因表达水平与HNF4α的表达密切相关。将外源HNF4α基因导入肝肿瘤细胞可增强正常肝细胞重要功能基因表达。上调小鼠胚胎干细胞HNF4α表达,可明显提高正常肝细胞如CYP1a2、G-6-P、PAH以及ALB等功能基因的表达,糖原合成和ICG代谢功能显着增强,ES细胞向肝细胞定向分化的能力明显提高。利用HNF4α基因修饰的HepG2移植治疗急性肝功能衰竭小鼠可明显提高动物模型的生存率,有效改善肝功能。结论:HNF4α是调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能的重要转录蛋白。上调供体肝细胞中HNF4α的表达,可明显增强肝细胞功能,因此HNF4α基因修饰肝细胞有望成为治疗急性肝功能衰竭的有效工具。
姚紫州[6]2013年在《胚胎干细胞来源的肝细胞移植对小鼠慢性肝衰竭的治疗作用》文中进行了进一步梳理[目的]在急性或慢性肝衰竭中,肝细胞移植被推荐作为一种改善肝功能的辅助方法,并作为“细胞疗法”用于肝脏代谢性疾病的治疗。诱导胚胎干细胞分化成肝细胞,行肝细胞移植治疗肝脏疾病,有着诱人的前景。本研究,通过构建小鼠慢性肝衰竭模型,体外实验成功诱导人胚胎干细胞分化为肝细胞,然后对慢性肝衰竭小鼠进行肝细胞移植。观察肝细胞移植对慢性肝衰竭小鼠的影响,为慢性肝衰竭提供一种新的治疗思路。[方法]1.小鼠慢性肝衰竭模型的构建：采用腹腔注射50%四氯化碳植物油溶液诱发小鼠慢性肝衰竭。观察造模后相应时相点各组小鼠的一般情况、肝功能生化指标及小鼠组织病理学改变。2.体外实验诱导胚胎干细胞向肝细胞分化：将人胚胎干细胞株BG0BG02细胞集落接种到预先包被有Matrigel的培养板上贴壁4d后,加入含有激活素A(ActivinA)的基础分化液诱导5d；然后将诱导液换为肝分化液诱导6d；在肝分化液中添加HGF和OSM继续诱导分化5～7d。分别于不同诱导阶段,采用RT-PCR和Western blot法检测hESC不同诱导阶段肝细胞标志物甲胎球蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)的表达,倒置相差显微镜观察hESC诱导分化后细胞的形态学变化。3.肝细胞移植对小鼠慢性肝衰竭的治疗作用：用成功分化的肝细胞移植入慢性肝衰竭的小鼠,从小鼠尾静脉直接穿刺后移植约6.0×106细胞；分别在相应处理后第1天,7天及15天,采用全自动生化仪直接检测小鼠肝功能指标丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)；同时留取相应时相点动物肝脏组织,置液氮保存或直接进行冰冻切片作病理学观察。[结果]1.肝衰竭模型肝脏病理学变化及肝脏生化指标变化①正常组小鼠肝脏正常,呈鲜红色,表面光滑、边缘锐利；病理切片示肝小叶形态结构正常,汇管区形态完整,未见变性和坏死。模型组肝脏体积明显缩小,颜色黯淡,边缘钝,质硬,表面有大量纤维渗出物,与周围组织粘连；病理切片显示肝细胞出现典型的胞浆疏松化、气球样变,可见散在的点状、碎片状坏死及炎性细胞浸润；还伴有明显的纤维化改变。②模型组的血清ALT和AST水平均明显升高,显着高于正常组。2. hESC诱导分化后细胞的形态学变化及RT-PCR、Western blotting检测AFP、 ALB的表达情况①经细胞活化素A、FGF-1、骨形态发生蛋白4(BMP-4)、OSM连续诱导10天后细胞形态学改变,细胞变大,呈椭圆形或多边形。诱导15后,一些细胞有2个或3个核,呈现肝细胞特有的形态。②hESC诱导分化后细胞表达肝细胞特异性蛋白ALB、ALP,并随诱导时间的延长表达量逐渐增加。3.人胚胎干细胞移植后肝组织学改变正常组肝组织切片HE染色,显示肝小叶结构清晰,肝小叶以中央静脉为中轴,肝细胞索呈放射状排列,肝血窦清晰。模型组：7d,肝小叶结构部分破坏,肝细胞大量溶解,有炎性细胞浸润,窦状隙堵塞,内皮细胞损坏,肝细胞核浆边缘不清,肝细胞内出现大量空泡；15d,有大量炎性细胞浸润,肝细胞仍可见空泡化结构。治疗组：1d,肝小叶结构以中央静脉为中心呈区域性溶解,肝细胞部分溶解,有少量炎性细胞浸润；7d,肝细胞双核增多,并出现炎性细胞浸润；15d,肝细胞以变性和炎性细胞浸润为主,坏死灶小、充血以及出血现象减轻。4.人胚胎干细胞移植后肝脏生化指标变化在肝细胞移植后第1d,治疗组与模型组无显着性差异(P>0.05),但治疗组与模型组肝功能指标(ALT、AST、ALP)均显着高于正常组(P<0.05),在第7d时相点,模型组与治疗组除了ALB无显着改变外,其余指标均有显着差异(P<0.05)。在第15d,除ALP、ALB外,ALT、AST存在差异(P<0.05),同时,治疗组与正常组比较中,治疗组小鼠AST基本趋于正常范围,其余指标有所改善,但仍未恢复。[结论]1.应用每隔叁天一次,连续7周腹腔注射50%四氯化碳溶液1ml/kg体重可诱导小鼠的慢性肝衰竭模型,病变稳定,操作简单,可供实验研究应用。2.在特定的在体外培养条件下,肝细胞生长因子(HGF)等细胞因子能诱导人胚胎干细胞BG02向肝细胞分化,并表达表达肝细胞特异性蛋白ALB及AFP。3.经小鼠鼠尾静脉的肝细胞移植能明显改善慢性肝衰竭小鼠的肝功能,促进肝功能恢复,改善小鼠肝脏病理状况。
赵磊[7]2010年在《骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的诱导和肝细胞极化分子表达与调节》文中认为研究背景和目的：经过20多年的发展,肝细胞移植作为肝移植的替代疗法,已经成为一种治疗急、慢性肝功能衰竭和肝脏相关遗传代谢疾病的有效方法。但是目前肝细胞移植仍面临许多问题,如肝细胞的来源短缺、移植细胞数量有限、肝细胞移植后的增殖、受损肝细胞的替代程度及免疫排斥等诸多问题。2002有人报道,BMSC可以在体外诱导成肝细胞。而BMSC以自身独特优点有望使细胞移植在肝病治疗方面取得实质性的突破,临床应用前景突出。本实验室已经掌握各种方法诱导BMSC向肝细胞分化,并取得了成功。为了临床应用方便,我们探讨了更简单、可控、成分明确的培养方法。我们用人血清白蛋白代替了FBS,用无血清的培养方法来提供肝细胞移植临床应用更好的细胞来源。肝脏生理功能的实现有赖于肝细胞极化的形成和维持。但是,目前我们对肝细胞极化的认识非常有限。肝细胞极化研究在很大程度上受限于缺乏理想的体外肝细胞极化模型。因此我们应用了骨髓间充质干细胞来源的肝细胞,对体外肝细胞的极化进行了研究。以便用骨髓间充质干细胞来源的肝细胞建立良好的体外肝细胞极化模型。熊去氧胆酸(UDCA)具有利胆、抗肝细胞凋亡和拮抗疏水性胆汁酸的细胞毒性等多种作用,在临床上用于治疗肝胆系统多种疾病。但目前对UDCA细胞内作用机制认识有限,UDCA对肝细胞极化的调节作用尚缺少研究。本研究选择了SR-B1、MRP2和NTCP叁个极化分子进行检测,来研究UDCA在mRNA水平对肝细胞极化分子表达的调节作用的作用。实验方法：1.提取成人骨髓间充质干细胞在无血清培养下向肝细胞诱导分化。通过与有血清诱导分化组和非诱导分化组比较,使用光学显微镜观察细胞分化0天、7天、14天、21天的细胞形态；使用白蛋白生化检测试剂盒检测肝细胞特异性标记物ALB的蛋白表达；使用免疫荧光染色,荧光显微镜下观察白蛋白在肝细胞内的合成、分布情况,观察无血清培养诱导的肝细胞是否具有与有血清诱导分化组细胞相似的成熟肝细胞的特征。2.使用实时定量PCR方法来检测分化7天、14天、21天和最后7天加用50μmol/L UDCA(21+U组)诱导的肝细胞的MRP2、NTCP、SR-B1叁个极化分子的表达；使用免疫荧光染色方法在共聚焦显微镜下观察MRP2、SR-B1在细胞上的定位,以此观察骨髓间充质干细胞相肝细胞诱导分化过程中MRP2、NTCP、SR-B1的mRNA表达和MRP2、SR-B1的定位情况。研究结果：1.成人骨髓间充质干细胞在无血清培养下诱导分化21天后具有成熟肝细胞形态(无血清诱导分化组,A组),与非诱导分化组(C组)差别明显,而与有血清的诱导分化组(B组)相近。分别检测叁组细胞的白蛋白表达,在分化7,14,21天的A组和B组白蛋白逐渐升高,14天后维持在较高水平,叁个时间点A组和B组白蛋白表达量明显高于C组(p<0.05)。A组和B组细胞在诱导分化14天后,白蛋白免疫荧光染色发现,细胞内有大量点状、颗粒状或者均匀分布的绿色荧光,较自身未加一抗的对照及C组比较明显为阳性。2.实时定量PCR检测分化7天、14天、21天和最后7天加用50μmol/L UDCA(21+U组)诱导的肝细胞的MRP2、NTCP、SR-B1极化分子的mRNA表达发现,7天、14天、21天和21+U组四组细胞MRP2、NTCP、SR-B1的mRNA表达随时间增加而升高,14天、21天组明显高于7天组(p<0.05),21+U组明显高于21天组(p<0.05)。免疫荧光染色显示细胞诱导14天后MRP2、SR-B1两种极化蛋白分别定位于肝细胞膜的不同部位,呈现明显的极化特征,而对照组细胞未观察到特异性分布。研究结论：1.无血清条件下培养骨髓间充质干细胞在特定诱导因子下可以分化为有一定功能的肝细胞,与诱导分化培养基诱导的肝细胞类似。从而为肝细胞临床移植准备了的良好的细胞来源。2.成人骨髓间充质十细胞具有向极化肝细胞分化的潜能。骨髓问充质十细胞分化的肝细胞可以作为研究肝细胞极化形成和调节机制的良好模型。UDCA可以促进肝细胞极化分子的表达。
滕光菊[8]2003年在《大鼠原代肝细胞的培养、功能鉴定及其在肝细胞移植中的初步应用》文中研究指明肝功能衰竭是各类重型肝炎和晚期肝硬化患者的主要死因，虽然，肝移植术已明显改善了肝功能衰竭患者的预后，但是由于健康供肝短缺及昂贵的价格，该项手术在未来数年内还难以在国内外普遍开展。生物人工肝支持治疗技术和肝细胞移植的兴起，为许多肝功能衰竭患者带来了新的希望，许多学者成功地应用肝细胞移植或肝细胞为基础的生物人工肝治疗了严重的肝衰竭及晚期代谢性肝病患者，研究表明原代肝细胞是肝细胞移植和生物人工肝最理想的生物材料。 离体培养的肝细胞在短期内形态和功能会发生明显变化，为了了解这些变化，探讨其短期内培养的最佳功能状态，为临床进行肝细胞移植和生物人工肝治疗提供实验依据，我们采用Seglen报道的改良二步胶原酶灌流法并略加修改进行大鼠肝细胞的分离及纯化，获取的肝细胞在含有多种辅助因子的Williams'E培养基中进行单层培养。通过台盼蓝排斥法计算细胞产量和细胞活率；MTT比色法检测连续培养8d肝细胞的活力；光镜、HE染色以及SABC免疫组化方法动态观察细胞形态学改变，透射电镜观察其超微结构；用细胞化学方法测定G-6-Pase活性；并收集不同时期培 第四军医大学硕士学位论文养上清检测肝细胞白蛋白分泌、尿素合成功能及LDH漏出量。结果显示平均每只大鼠肝可获取 1二 1土 0．45 XIO’个肝细胞，平均活力为 93石土 2．8％。MTT实验结果显示肝细胞培养第 3d A值较高，细胞活力处于最佳状态。光镜下可见肝细胞呈多角形生长，有双核，连接成片状或岛状，能存活3周左右。HE染色显示细胞清晰，胞浆红染、胞核呈蓝色，可见双核。透射电镜下可见大量内质网、车轮状线粒体、糖原颗粒、细胞紧密连接及胆小管等肝细胞特征性结构。免疫组化结果显示细胞角蛋白18阳性表达。镜下观察表达G－6－Pase的肝细胞阳性表达，细胞胞浆呈棕黑色颗粒。肝细胞功能检测显示LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成功能在1周内出现波动性变化，第 3d LDH漏出量最低，白蛋白分泌及尿素合成功能在第3、4d时较好。 肝细胞移植已开始用于临床，并取得了一定的疗效，但用于移植肝细胞的最佳状态和适宜时机，目前还不太清楚。为此我们用剂量为2刀g／kgD－氨基半乳糖制备大鼠急性肝衰模型，24h后随机分为3组进行肝细胞移植治疗，1 组：经脾内移植体外培养3d的肝细胞：11 组：经脾内移植预孵育 sh的肝细胞悬液 IX 10’；Ill 组：经脾内注射生理盐水 lml。连续2周观察移植后大鼠存活率，自动生化分析仪检测肝脏生化指标（ALT、AST、TBil），HE、PAS染色观察肝脏组织学及移植后脾内肝细胞的生物学特性，以比较体外短期培养的肝细胞和新分离的肝细胞悬液经脾内移植治疗急性肝衰竭大鼠的疗效，为探索移植肝细胞的最佳状态和适宜时间提供实验依据。资料显示，I组、11组大鼠存活率阿8％，71％）与Ill组大鼠存活率＊3％）相比具有显着性差异（尸＜0．of，尸t 0．05人 各项肝功能指标均有明显改善，肝组织病理改变较轻。但1组与＊组大鼠的存活率、肝功能等方面比较，没有显着性差异。经HE和PAS染色证实，移植的肝细胞在受体脾内结构和功能保持较好。 ．4． 第四旱医大学硕士学位论文 本研究结果表明：1、体外原代培养的大鼠肝细胞的形态和功能具有一致性，原代大鼠肝细胞在培养第3、4d功能较好，可能为肝细胞移植和生物人工肝应用的最佳时机。2、采用又刀g／kgr氨基半乳糖，腹腔注射24h后作为制备大鼠急性肝衰竭模型的最适药物剂量和最佳时间。3、经脾内移植的体外短期培养肝细胞和肝细胞悬液均能提高大鼠药物性肝衰竭的存活率、改善肝功能及肝脏组织病理变化。两组移植细胞比较，虽然在上述移植治疗效果上无显着差异，但培养肝细胞似优于孵育sh肝细胞。 以上结果为异体肝细胞的分离、最佳功能状态及应用时机的判定提供了实验依据。
江海洪[9]2006年在《小鼠胚胎干细胞向肝前体细胞诱导分化及其对实验性急性肝衰竭的移植治疗研究》文中提出背景在各种干细胞(stem cells, SC)的应用研究中,胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES细胞)由于具有发育全能性、种系传递能力(形成嵌合体)以及便于进行遗传学的基因改造而最引人注目,发展最快,且ES细胞作为研究的基本工具和潜在的细胞治疗来源继续强烈吸引着人们的注意力。在国外,1981年英国的Evans等和美国的Martine分别成功地分离和体外培养了小鼠ES细胞,建立了小鼠ES细胞系,而且证实了该ES细胞系具有发育全能性,能在体外诱导分化为各种类型的组织细胞。特别是继1998年James Thomson博士建立人ES细胞系之后,世界上其他许多科学家也相继成功地从囊胚内细胞团分离并建立了ES细胞系。目前,在NIH注册的ES细胞有83个系,分别来自不同的国家。据报道,ES细胞目前已有在体外培养两年,连续传代达450次以上,而胚胎生殖干细胞传代次数最多可达70~80次。更令人兴奋的是,科学家们已经开始对ES细胞进行基因改造,实现了转基因表达和基因的同源重组,这意味着将可以有针对性地改变ES细胞的遗传表型,如采用基因敲除技术等。所有这些重要突破都使ES细胞用于各种终末期疾病的治疗更接近于现实的需要。我国早在80年代就开始了ES细胞的研究,近几年来,ES细胞的研究更是发展迅猛,国内不少研究机构以及政府职能部门对ES细胞的研究也表现出高度的重视和极大兴趣,为ES细胞研究专门组织了“973项目”和“863项目”。目前在全国范围内已形成了一支干细胞研究的庞大队伍。李凌松教授在北京成立了干细胞研究中心,筹建组织干细胞库,进行了组织干细胞的诱导分化以及干细胞对疾病治疗的动物实验和临床试用,如神经干细胞对帕金森氏病和角膜干细胞对角膜损伤的治疗等。卢光绣教授在湖南湘雅医学院自1999年以来一直致力于治疗性克隆的研究。广州中山大学黄绍良教授等利用人受精卵发育形成的囊胚内细胞团建立了3株人类ES细胞系。上海中科院亦于1999年投资建立了盛慧珍教授主持的上海市发育生物学重点实验室,集中进行治疗性克隆的研究,在2003年就曾报道采用细胞共培养技术已将小鼠ES细胞诱导为类肝细胞,该肝细胞能表达成熟肝细胞标志物如酪氨酸氨基转移酶、葡萄糖-6-磷酸酶
王帅[10]2006年在《骨髓干细胞移植治疗终末期肝病的研究》文中指出目的及意义原位肝移植是目前治疗终末期肝病和急性肝功能衰竭的唯一有效治疗手段,但肝源短缺等限制了其应用,故干细胞移植治疗的潜在临床应用价值越来越引起关注。本研究旨在阐明同种异体骨髓MSCs移植对肝损伤大鼠肝功改善情况及移植后MSCs体内分布,探讨肝动脉插管自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化的安全性、可行性及疗效,为终末期肝病的治疗探索新的途径。方法应用2-AAF建立大鼠急性肝损伤模型,采用经门静脉注射途径进行同种异体骨髓MSCs移植,检测大鼠血清ALB、ALT及AST变化,并通过荧光标记、免疫组化及巢式PCR等方法观察移植细胞分布。入选201例肝硬化患者,对其中131例进行自体骨髓干细胞移植。骨穿采集适量骨髓,采用密度离心法分离干细胞后经肝动脉插管进行移植,观察移植后患者血清ALB、CHE、PTA、TBil和临床症状的变化及患者并发症及预后情况。结果2-AAF可导致大鼠肝组织弥漫性损伤,经骨髓MSCs移植后3w,治疗组血清ALB明显高于对照组。体内分布研究显示:移植后1w受体鼠肝、肺及脾脏中均可见DAPI阳性细胞,移植后3w仅在肝损伤大鼠肝内发现DAPI阳性细胞组成的细胞簇,形态与正常肝实质细胞相近;SRY蛋白及基因检测结果与之一致。肝硬化患者自体骨髓干细胞移植后,无明显不良事件发生。治疗组患者血清ALB于治疗后2、4、8、12及24w均明显高于对照组(P<0.05),Child-Pugh A与B级患者ALB提高程度有大于C级的趋势。血清CHE及PTA的变化情况与ALB一致。24w内治疗组临床症状改善较对照组显着(P<0.05)。而治疗后24w内血清TBil变化与对照组相比无显着性差异(P>0.05)。两组患者24w内并发症发生率及预后情况无显着性差异(P>0.05)。结论2-AAF可造成大鼠肝组织弥漫性损伤,经门静脉异体骨髓MSCs移植对2-AAF所致大鼠肝损伤有一定的治疗作用。2-AAF所致大鼠肝损伤环境有助于经门静脉移植的骨髓MSCs的定植。体外传代培养的骨髓MSCs具有免疫耐受性,同种异体移植后无免疫排斥。自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化患者有良好的安全性。它能显着提高肝硬化患者
参考文献：
[1]. 骨髓干细胞诱导分化的肝细胞移植对大鼠肝切除术后肝衰治疗作用的实验研究[D]. 李晓斌. 中国协和医科大学. 2006
[2]. HGF在肝细胞移植治疗大鼠急性肝功能衰竭中的表达[D]. 梁冬明. 山西医科大学. 2004
[3]. 微载体粘附培养肝细胞的生物学特性及其移植治疗大鼠急性肝衰竭的实验研究[D]. 徐哲. 第四军医大学. 2003
[4]. 转化生长因子-β_1在肝细胞移植中的变化及意义[D]. 杨耀国. 山西医科大学. 2004
[5]. 肝细胞核因子4诱导肝细胞功能的体外和体内研究[D]. 尹川. 第二军医大学. 2007
[6]. 胚胎干细胞来源的肝细胞移植对小鼠慢性肝衰竭的治疗作用[D]. 姚紫州. 昆明医科大学. 2013
[7]. 骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的诱导和肝细胞极化分子表达与调节[D]. 赵磊. 中国协和医科大学. 2010
[8]. 大鼠原代肝细胞的培养、功能鉴定及其在肝细胞移植中的初步应用[D]. 滕光菊. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[9]. 小鼠胚胎干细胞向肝前体细胞诱导分化及其对实验性急性肝衰竭的移植治疗研究[D]. 江海洪. 第叁军医大学. 2006
[10]. 骨髓干细胞移植治疗终末期肝病的研究[D]. 王帅. 第叁军医大学. 2006