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【摘要】 目的：探讨lncRNA PVT1通过调控TGFβ通路的激活影响结肠癌细胞的增殖和侵袭行为及其机制。方法：qPCR检测PVT1在不同结肠癌细胞株中的表达情况；分析PVT1和结肠癌患者的临床病理资料之间的关联；MTT增殖实验和Transwell侵袭实验检测PVT1对结肠癌细胞的生长转移行为的影响，Western blotting检测抑制PVT1后TGF-β信号通路蛋白的表达情况。结果：在不同类型的结肠癌细胞中，SW620和HCT8细胞中PVT1的表达差异显著，PVT1和结肠癌患者的临床病理学参数相关，抑制PVT1的表达后可以促进结肠癌细胞的增殖和侵袭能力；抑制PVT1的表达后，TGF-β信号通路蛋白被相应的抑制。结论：lncRNA PVT1可以调控TGF-β信号通路干扰结肠癌细胞的生长和侵袭情况。
【关键词】 PVT1；结肠癌；TGF-β；转移
【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）09-0057-03
随转录组测序技术的发展，大多数恶性肿瘤基因组DNA表现为缺乏蛋白质编码能力，从而导致加工转录过程更明确。长链非编码RNA是最近发现的一类主要类型的非编码RNA，其长度超过200个核苷酸[1]。近年来，不断有新出现的证据表明，一些lncRNA如PVT1在调节基因表达和调控基因表达方面发挥重要作用。通过表观遗传调控的生物学功能，包括甲基化，乙酰化和泛素化等相关作用[2]。
PVT1位于12q14.1上的基因位点，长度为1567nt，已被发现在多种人类恶性肿瘤中存在过表达情况。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，PVT1的表达增加通过与表观遗传蛋白相互作用调节下游靶标的转录[3]。转化生长因子β（TGF-β）被定义为致癌蛋白，可以一定程度上促进肿瘤生长和转移，使其成为恶性肿瘤的预后和治疗靶点。此前，证明TGF-β在肝细胞癌中通过H3K27修饰进行表观遗传学调节[4]。然而，PVT1在结肠癌中与TGF-β的相互作用不甚清楚。
本实验通过假设lncRNA PVT1通过TGF-β通路蛋白表达影响结肠癌细胞的生物学行为。为了验证这一假设，首先明确PVT1在结肠癌组织和细胞系中的表达水平。通过进行体外和体内实验测定，进一步研究了PVT1在结肠癌的生物学功能相关性
1.材料和方法
1.1 细胞株及相关材料
人结肠癌细胞株HT-29，SW 480，SW620及RKO购买于上海中科院，RPMI-1640培养基和胰酶购买于美国Gibco公司；胎牛血清和双抗购买于美国海克隆公司；PBS磷酸盐缓冲液购买于美国Gibco公司。
1.2 组织样品
结肠癌组织收集2018年1月—8月经病理检查确诊为结肠癌组织50例。肿瘤组织离体后，去除血迹，放入4%多聚甲醛中固定。
1.3 miRNA提取和qPCR试验
使用来自TRIzol试剂按照制造商的说明分离来自组织或细胞系的miRNA。根据制造商的说明，分别使用miRNA逆转录试剂盒和PrimeScirpt RT试剂盒进行逆转录。使用SYBR Premix进行定量实时PCR（qRT-PCR）。U6内参用作标准化对照。通过2-△△Ct法计算miRNA的相对表达水平。实验重复3次。本研究中使用的引物如下：PVT1序列F：5'-AGGCTGGGATGGCGAGGGGCA-3'，R：5'-TTGAGCGGCGAGGGAGGGCTAG-3';U6：5'-TAGGCGGATGCGGGCGGATC-3'，R：5'-GATCTATTTCGAGCGATGGA-3'。
1.4 MTT增殖实验
通过比色MTT增殖能力测定。将实验组和对照组的结肠癌细胞以初始密度为2×104细胞/孔接种到96孔板中。24小时后，48小时及72小时后，然后使用无菌吸管吸出上清液，每孔加入150μl二甲基亚砜，在室温下搅拌10min保证晶体充分溶解。然后在96h进行MTT测定波长为490nm时的吸光度，计算结肠癌细胞的增殖情况。实验重复3次。
1.5 Transwell侵袭试验
使用孔径为8μm的Transwell室进行细胞迁移和侵袭检测。 用si-PVT1或NC转染36小时后，将无血清DMEM培养基中的细胞悬浮液（5×104细胞）置于上室中，其预先涂有Matrigel（用于侵袭测定）。将包含10％FBS的培养基加入下室作为化学引诱物。将细胞在37℃下孵育24小时，然后用棉签除去上室上的剩余细胞。下室表面上的入侵或迁移的细胞用100％甲醇固定，用0.5％结晶紫染色。在倒置显微镜下，从每个室中随机选择的5个视野中观察并计数侵袭细胞的数量。实验重复3次。
1.6 蛋白质印迹
在干预处理后收获接种在6孔板中的细胞，并使用RIPA裂解缓冲液提取细胞蛋白质。根据制造商的方案进行蛋白质印迹分析。通过使用BCA试剂盒定量蛋白质浓度。将每个样品的40±20μg蛋白质进行10％SDS-PAGE并转移到PVDF膜上。用含5％脱脂牛奶的Tris基生理盐水-吐温20（TBST）室温封闭膜1小时。TGF-β（1:1000）、Smad2（1:1000）和α-SMA（1:1000）和GAPDH（1:2000）与膜在4℃温育过夜。用TBST洗涤三次后，将二抗（1:2000）针对相关的一级抗体在室温下与膜孵育2小时。使用电化学发光（ECL）使蛋白显影。
1.7 统计学分析
本实验所有数据统计使用软件DPS v9.50进行处理，计量资料用均数±标准差表示，t检验。P＜0.05差异具有统计学意义。
2.结果
2.1 PVT1在结肠癌组织和细胞株中的表达情况。
qPCR结果表明：（图1A）与矮胖正常组织相比，结肠癌组织中PVT1 mRNA表达水平较高[（1.28±0.18）vs （2.78±0.12），P＜0.05]；与其他细胞株相比（图1B），HCT8和SW620细胞中PVT1 mRNA表达水平较高[（3.58±0.18）vs（3.05±0.28），P＜0.05]，差异有统计学意义；PVT1在HCT8和SW620细胞株中表达水平比其他结肠癌细胞株较高，考虑PVT1在结肠癌中可能扮演起促癌作用。
图1（A）结肠癌组织和癌旁正常组织中PVT1的表达水平。
（B）不同类型结肠癌细胞株中PVT1的表达水平。*P＜0.05。
2.2 PVT1与结肠癌患者的临床病理参数之间的关系
本实验把50例结肠癌肿瘤组织样本和癌旁正常组织进行统计分析。在不同性别和年龄段的结肠癌患者之间PVT1的表达水平差异不明显，无统计学差异（P＞0.05；表1）。随着结肠癌分期越高，结肠癌患者组织中的PVT1的表达水平越明显，存在结肠癌淋巴结转移的患者组织中PVT1的表达越明显，差异具有统计学意义（P＜0.05；表1）。
表1 结肠癌患者组织中PVT1的表达与其临床病理特征之间的关系
图4 PVT1对TGF-β信号通路激活的影响
3.讨论
过去肿瘤研究的方向是通过研究分子的化学抗性和细胞作用机制，这是治疗晚期癌症类型失败的主要原因之一。然而，自21世纪以来，关于各种蛋白分子的相关进展甚微。因此，新型分子特征的发现似乎在肿瘤表征中具有很大的前景，并且可以用作潜在的治疗靶标。为了确定lncRNA是治疗恶性肿瘤潜在分子生物标志物及与下游相关蛋白通路的功能相关性，本研究结果针对PVT1通过与TGF-β结合并激活信号通路的活性表达，从而调节肿瘤生长及细胞生长行为。
研究表明基因过度扩增和PVT1的阳性诊断率有直接的关联，可以导致恶性肿瘤的预后结果较差。尽管目前诊断lncRNA的靶向治疗仍然是临床辅助治疗，不算做标准治疗方案，但对化疗药物获得性耐药的存在是一个严重的问题，通过对抵抗机制的研究理解可能有助于克服临床化疗耐药抵抗的难题。
LncRNA PVT1最近被证实是非小细胞肺癌和胃癌中的致癌基因，但未报道在结肠癌中的表达。在这项研究中确定了PVT1的表达水平，并研究了其在结肠癌中的功能作用。与先前的报道一致，本实验结果显示PVT11在结肠癌中表达上调并促进肿瘤生长活性。本实验通过研究下游蛋白通路靶点的激活情况，推测PVT1通过介导TGFβ参与结肠癌的侵袭和迁移过程，从而促进肿瘤增殖，抑制细胞凋亡和发展，可以参照这一分子特性，进一步探讨PVT1分子在临床化疗治疗过程的参与机制。Shi等学者研究报道抑制TGF-β通路蛋白的活性可以有效减少乳腺癌小鼠模型的肺转移，并降低CCL5蛋白的表达。通过本实验研究推测，TGF-β被PVT1调控后可能对PVT1功能有一定反向影响，表明PVT1通过靶向TGF-β调节结肠癌细胞生物学活性有一定的实验推论。
最近相关证据表明，lncRNAs可以作为染色质修饰复合物的支架，并作为响应DNA损伤的信号，表明lncRNAs的调节功能依赖于其相互作用的蛋白质。TGF-β是具有组蛋白乙酰转移酶活性的转录共激活因子，其被证明对组蛋白乙酰化很重要。最近，据报道lncRNA的部分亚型与TGF-β结合，通过修饰组蛋白乙酰化来影响基因表达。在本研究中，我们验证了PVT1可以调控TGF-β的表达，进一步激活TGF-β信号通路。最后，我们将进一步探讨了PVT1在结肠癌患者中的潜在转化应用。
【参考文献】
[1] Chiu H S,Somvanshi S,Patel E,et al.Pan-Cancer analysis of lncRNA regulation supports their targeting of cancer genes in each tumor context[J].Cell reports,2018, 23(1):297.
[2] Guan Y,Zhang M,Chen X,et al.Lnc RNA SNHG20 participated in proliferation, invasion, and migration of breast cancer cells via miR‐495[J].Journal of cellular biochemistry,2018,119(10):7971-7981.
[3] Fan H,Zhu J H,Yao X Q.Knockdown of long non?coding RNA PVT1 reverses multidrug resistance in colorectal cancer cells[J].Molecular medicine reports,2018,17(6):8309-8315.
[4] Terra M,Oberkampf M,Fayolle C,et al.Tumor-derived TGF-β alters the ability of plasmacytoid dendritic cells to respond to innate immune signaling[J].Cancer research, 2018:canres.2719.2017.
论文作者:魏蔚1，2,杨淑改2
论文发表刊物:《医药前沿》2019年9期
论文发表时间:2019/5/27
标签：结肠癌论文; 细胞株论文; 细胞论文; 蛋白论文; 组织论文; 结肠论文; 癌细胞论文; 《医药前沿》2019年9期论文;