方香玲[1]2008年在《昆虫病原线虫共生菌的鉴定、培养及其抑菌活性研究》文中研究说明昆虫病原线虫共生菌代谢产物在医药卫生和农业领域具有抗细菌、抗真菌、杀虫、杀线虫、抗病毒、抗癌等多种生物活性,是一类新型的具有较大开发潜力和广泛应用前景的生物资源。前期研究发现,从陕西杨凌、太白山筛选的3株昆虫病原线虫中分离的共生菌YL001、YL002和TB菌株代谢物具有较强的抑菌活性,为进一步确定其分类及系统进化地位,并为该生物资源的后续研究及开发应用奠定基础,本论文对其分类地位、培养及抑菌活性进行了研究,得出以下主要研究结果与结论:1. PCR扩增、克隆并测定了YL001、YL002和TB菌株16S rRNA全序列,将此序列与GenBank中该类菌部分已知种的16S rRNA序列进行同源性比较及聚类分析。在构建的系统发育树中,3株菌与嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)种内菌株形成一个类群,序列同源性均大于99%,且位于不同分支。结合前期生理生化等特征的鉴定结果,认为YL001、YL002和TB菌株属于嗜线虫致病杆菌种内的不同菌株。2. 3株菌对供试的26种病原真菌均有不同程度拮抗作用,不同菌株对不同病菌的拮抗作用不同,但均对辣椒疫霉病菌有很强的拮抗作用;3株菌胞外代谢物对病原菌菌丝生长的抑制作用有较大差异,但其10倍稀释液对辣椒疫霉、番茄灰霉、油菜菌核和小麦根腐病菌的抑制率都在90%以上;对金黄色葡萄球菌抑制作用最强,抑菌圈直径达30 mm;活体组织试验表明3菌株对番茄灰霉病防效均在65%以上,不同菌株治疗和保护效果存在差异,其中YL002菌株治疗效果最好(77.31%),TB菌株保护效果最好(75.30%);对番茄灰霉病、辣椒疫霉病和黄瓜霜霉病的防效均在60%以上,其中YL001菌株对黄瓜霜霉病治疗效果最好(78.21%),YL002菌株对番茄灰霉病保护效果最好(77.73%),TB菌株对辣椒疫霉病保护效果最好(76.13%),TB菌株对小麦白粉病防效在60%以上,优于其他菌株,仅TB菌株对玉米大斑病有一定的保护效果。3株菌胞外代谢物甲醇提取物对供试菌菌丝生长均有较强抑制作用,其中YL001菌株对辣椒疫霉病菌、YL002菌株对番茄灰霉病菌、TB菌株对油菜菌核病菌菌丝生长的抑制作用最强,EC50分别为:35.11、42.16和18.95 mg/L;对供试菌孢子萌发亦有较强抑制作用,其中对玉米大斑病菌抑制作用最强,EC50分别为28.03、36.77和26.40 mg/L;1000 mg/L时,对番茄灰霉病的防效均在70%以上(活体组织法),对番茄灰霉病和辣椒疫霉病的防效均在65%以上,不同菌株治疗和保护效果存在差异(盆栽试验)。3株菌胞内代谢物乙醇提取物抑菌活性测定结果表明:1000 mg/L时,对辣椒疫霉病菌菌丝生长的抑制率在80%以上;不同菌株乙醇提取物对番茄灰霉病的防效不同,其中YL002菌株的治疗和保护效果最好,分别为79.16和61.66%(活体组织法);盆栽试验表明YL002菌株对番茄灰霉病、辣椒疫霉病和黄瓜霜霉病的治疗效果最好,分别为82.19%、70.75%和81.12%,TB菌株对其保护效果最好,分别为74.40%、65.87%和78.92%。3.培养特性研究结果表明YL001、YL002和TB菌株的生长符合细菌生长的一般规律,发酵液中主要营养成分还原糖和氨基氮含量的变化趋势相似:在培养前期还原糖和氨基氮含量均迅速下降,后期保持相对稳定;其适宜发酵周期分别为54、66和60h。4.综合运用Plackett–Burman设计和响应面等方法对TB菌株发酵工艺进行了整体优化。TB菌株最佳发酵培养基组成为(g/L):蛋白胨25.60、葡萄糖5.00、NaCl 5.00、K2HPO4 2.50;最佳发酵条件为:发酵时间54.07 h、初始pH 7.59、接种量9.95%、种龄(OD600: 2.00),装液量(100/250 mL)、转速150 rpm、温度25°C。最佳工业发酵培养基组成为(g/L):麸皮10.00、棉饼粉24.20、豆饼粉6.41、NaCl 5.00、K2HPO4 5.00;最佳发酵条件为:发酵时间72 h、种龄(OD600: 2.00)、装液量(50/250 mL)、初始pH 7.96、接种量10.02%、转速150 rpm。优化后TB菌株的抑菌活性较优化前分别提高了73.52%和82.58%。5.不同培养方式对TB菌株生长和抗菌活性的研究结果表明70L发酵罐培养最有利于TB菌株的生长,DCW达16.70 g/L,较摇瓶和5L发酵罐分别增加25.85%和41.41%;摇瓶培养最有利于抑菌物质的产生,抑菌活性达358.3 U/mL,较5L和70L发酵罐分别增加10.83%和14.36%。6.以番茄灰霉病菌和枯草芽孢杆菌为靶标菌,采用活性跟踪法,对TB菌株代谢物抑菌活性成分进行了分离。从胞内代谢物中分离出1种具有抑菌活性的化合物,结构已初步确定,为双(1-羟基-2-甲氧基乙酯)邻苯二甲酸酯;从胞外代谢物中分离出5种具有抑菌活性的化合物,其结构正在鉴定之中。活性测定结果表明:0.5 mg/mL时,4#和5#对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用较强,分别为69.1%和72.8%;4#、5#和6#对枯草芽孢杆菌的抑制作用较强,抑菌圈直径分别为10.9、11.6和10.2 mm。
俞晗[2]2017年在《致病杆菌Xenorhabdus bovienii SN84次生代谢产物对三种植物病原真菌抑菌作用的研究》文中研究表明随着人类社会的不断发展,人们对生活质量、生存环境的要求也不断提高,虽然人类的种种要求推动了科学技术的发展,但也随之带来很多环境问题。在农业生产中,化学农药是最主要也是最为有效防治病虫害的方式,由于环境的不断恶化以及人们环保意识的不断提高,寻找代替化学农药的替代品已成为热点。生物农药因其低残留、低毒、不易产生抗药性、选择性强等优点已成为世界各国的研究重点。农用抗生素主要指生物农药中的微生物源农药,目前在杀虫和杀菌方面已取得显著的防治效果,成为当今研究的热点。本试验从土壤中分离得到一株昆虫病原线虫共生菌Xenorhabdus bovienii SN84,研究发现该菌株的次生代谢产物可有效抑制番茄灰霉菌、辣椒疫霉菌和大豆疫霉菌的生长。通过试验测定了致病杆菌Xenorhabdus bovienii SN84发酵液、粗提物以及分离得到的7种纯化合物对番茄灰霉菌、辣椒疫霉菌和大豆疫霉菌三种植物病原真菌的抑制效果,并利用致病杆菌Xenorhabdus bovienii SN84的发酵液对番茄幼苗进行生物测定,以期得到一株能够抑制植物病原真菌的新型农用抗生素或其前导活性产物的菌株,为解决生产中缺少对三种靶标菌株具有安全高效的农用抗生素品种提供可能。主要研究结果如下:测定致病杆菌Xenorhabdus bovienii SN84菌株发酵液对三种植物病原真菌的抑菌效果,结果显示,Xenorhabdusbovienii SN84菌株无菌发酵液对三种靶标病原真菌均有显著的抑制效果。当Xenorhabdusbovienii SN84无菌发酵液的浓度达到2%时,对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制可达到近50%;当Xenorhabdus bovienii SN84无菌发酵液的浓度达到0.6%时,对辣椒疫霉病菌和大豆疫霉病病原菌菌丝生长的抑制可达到近50%。测定致病杆菌Xenorhabdus bovienii SN84菌株发酵粗提物对三种植物病原真菌的抑菌效果,结果显示,得到A、B、C和D四个组分中仅B组分有抑菌效果,且对番茄灰霉菌的抑制效果最佳,对另外两种植物病原真菌的抑制效果不佳,固将番茄灰霉菌作为下一步试验研究重点,并探究抑菌效果较发酵液有所降低的原因。测定从致病杆菌Xenorhabdus bovienii SN84菌株发酵产物中分离得到的7种纯化合物对番茄灰霉菌孢子萌发的抑制作用,结果显示仅C2-2对番茄灰霉病病菌孢子萌发的抑制作用最强,且持续作用时间最为持久,若其进行更加深入研究,有望得到一株对番茄灰霉病病菌抑制活性较强的生物农药或其先导化合物。测定致病杆菌Xenorhabdus bovienii SN84菌株发酵液对番茄灰霉病的抑制作用,进而检测该菌株发酵液对番茄幼苗的保护作用。结果显示,随着加入无菌发酵液的量的增多,灰霉病的发病率逐渐降低。当Xenorhabdus bovienii SN84无菌发酵液的浓度为8%时,对番茄幼苗起到有效的预防番茄灰霉病的效果。表明了进一步研究致病杆菌Xenorhabdus bovienii SN84菌株作为生物农药或其先导化合物的重要意义。
许鹏[3]2016年在《嗜线虫致病杆菌YL001抑菌活性成分研究》文中提出昆虫病原线虫共生菌次生代谢产物具有抑菌、杀虫、抗病毒、抗癌等多种生物活性。目前,已从致病杆菌中分离鉴定出11类40多种具有生物活性的代谢产物,这些代谢产物化学结构多样,在医药和农业上有广泛的生物活性,具有较大的开发引用潜力。西北农林科技大学无公害农药研究服务中心前期研究发现嗜线虫致病杆菌YL001(Xenorhabdus nematophila YL001)发酵液对多种植物病原菌具有较好的抑制作用,并从发酵上清液中分离得到1种对番茄灰霉病菌具有较好抑制活性的环肽类化合物。为了进一步研究嗜线虫致病杆菌YL001的抑菌活性,本论文在前期研究的基础上,采用活性追踪法,对嗜线虫致病杆菌YL001胞外产物的抑菌活性成分进行了提取、分离、鉴定;在此基础上,采用HPLC定量分析方法,初步研究了菌种、发酵条件(发酵方式和培养基初始pH)及cpxR基因突变对抑菌活性成分产生的影响。研究结果如下:1.YL001发酵上清液经D101大孔吸附树脂后,以甲醇洗脱得总提取物;抑菌活性结果表明,总提取物乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相及水相对枯草芽孢杆菌均具有一定抑菌活性。采用活性追踪法,结合硅胶柱层析、凝胶柱层析、结晶等分离技术,对YL001胞外代谢产物乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物进行活性成分分离、鉴定,分离得到5个化合物,并鉴定出3个化合物的结构,分别为:C1:亚苄基丙酮(benzylideneacetone),C3:3-吲哚乙基(3’-甲基-2’-酮)戊酰胺(Nematophin),C5:色胺(Tryptamine)。水相抑菌活性成分分离方法初步研究表明,样品经不同pH(2.0,3.0,4.0,5.0,6.0)酸化处理后,进行732阳离子交换树脂动态吸附,以0.5 mol/L氨水洗脱,洗脱液过D101大孔树脂除盐后得水相不同pH处理粗制品,粗制品抑菌活性有较大差异,pH2.0~4.0粗制品具有较高的抑菌活性,其中pH2.0时,对蜡状芽孢杆菌抑菌圈直径为26.67 mm,对苹果树腐烂病菌抑菌活性为91.98%;pH 6.0时,对蜡状芽孢杆菌抑菌圈直径为15.33 mm,对苹果树腐烂病菌抑菌活性为53.30%,说明pH2.0~4.0时,阳离子树脂对主要抑菌活性物质有较大吸附。2.采用微量稀释法测定了nematophin与benzylideneacetone对7种病原细菌的MIC,结果表明,两种化合物都对7种供试病原细菌均表现出一定的抑菌活性,特别是对革兰氏阳性细菌具有较高的抑菌活性,对革兰氏阴性菌活性较差,其中nematophin和benzylideneacetone对金黄色葡萄球菌具有较好的抑制作用,其MIC分别为2.5μg/mL和12.5μg/mL。采用生长速率法测定了2种化合物对8种植物病原真菌的抑制作用,结果显示,在100 mg/L浓度下nematophin对番茄灰霉病菌、水稻纹枯病菌和苹果树腐烂病菌具有较好的抑制作用,其中对番茄灰霉病菌抑制作用最高,为88.63%。在此基础上测定了nematophin对番茄灰霉病菌、水稻纹枯病菌和苹果树腐烂病菌的室内毒力,其中对番茄灰霉病菌的EC50为22.7650 mg/L,对水稻纹枯病菌的EC50为36.2362 mg/L,对苹果树腐烂病菌的EC50为30.2270 mg/L。采用活体组织法,进一步测定了nematophin对番茄灰霉病的防治作用效果,结果表明,不同浓度(250 mg/L、500 mg/L、750 mg/L、1000 mg/L)nematophin对番茄灰霉病的保护作用为28.71%~76.79%,低于对照药剂(500mg/L多菌灵,84.07%);对番茄灰霉病的治疗作用为24.41%~55.38%,低于对照药剂(67.98%)。3.采用HPLC定量分析方法,初步研究了不同菌种、不同发酵条件(发酵方式和培养基初始pH)及cpxR基因突变对主要抑菌活性物质nematophin产生的影响。研究结果表明,致病杆菌属内嗜线虫致病杆菌可以产生nematophin,而伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovienii)不产生该化合物;嗜线虫致病杆菌的不同菌株产生的主要抑菌物质nematophin的产量有明显差异,其中YL001菌株发酵液中nematophin的产量最高,为115.23μg/mL;培养基初始pH对nematophin的产量有较大的影响,在一定的pH范围内(pH4.5~8.5),随培养基初始pH升高,nematophin的产量也逐渐增大,pH8.5时产量达到最大,为155.08μg/mL;不同发酵方式对nematophin的产生也有较大的影响,YL001菌株在5 L全自动发酵罐中发酵培养时,在搅拌转速250 rpm、通气量2.5 L/min条件下,随培养基初始pH升高,nematophin的产量也逐渐增大,pH8.5时最大,为206.97μg/mL,较摇瓶培养(250 mL)增加了79.85%;cpxR基因突变可以影响抑菌活性物质nematophin的产量,发酵72h后,YL001野生菌种中nematophin产量为115.23μg/mL,是cpx R突变株中nematophin产量(67.84μg/mL)的1.7倍,这说明CpxR正向调控nematophin产生。上述结果表明,YL001代谢物中抑菌活性成分较为复杂,正丁醇及水相活性成分值得进一步分离;发酵方式、培养基初始pH及cpxR基因突变可以影响嗜线虫致病杆菌主要抑菌活性物质的产量。
王永宏[4]2005年在《昆虫病原线虫共生菌培养与活性研究》文中指出昆虫病原线虫共生菌是寄生于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌,属肠杆菌科(Enterobacteriaceae ),包括致病杆菌属(Xenorhabdus)和光杆状菌属(Photorhabdus),分别与斯氏线虫属(Steinernema)和异小杆线虫属(Heterorhabditis)线虫共生。据报道,Xenorhabdus 和 Photorhabdus 能产生多种代谢产物,这些代谢产物不仅具有多种化学结构,而且在医疗卫生和农业上具有广泛的生物活性,如抑菌、杀虫、杀线虫、抗溃疡、抗肿瘤和抗病毒活性。特别是具有较高杀虫活性的胞外毒蛋白及其基因的发现,为生物农药的开发和抗虫基因工程提供了新的微生物杀虫资源和杀虫基因。昆虫病原线虫共生菌已成为一类新型的具有较大开发潜力和广泛应用前景的生物资源。关于昆虫病原线虫共生菌的代谢产物及其生物活性已有较广泛的研究,但对于昆虫病原线虫共生菌的培养发酵与次生代谢物产生关系的系统研究还是空白。因此,本研究以从陕西杨陵筛选的昆虫病原线虫 Steinernema sp YL001 和 Steinernema sp YL002 为材料,对其共生菌进行了分离鉴定,并对共生菌的培养发酵与生物活性进行了系统的研究,现将结果总结如下。 1. 昆虫病原线虫 Steinernema sp YL001 和 Steinernema sp YL002 共生菌的形态及生化特征分析表明,两种线虫共生菌的形态及生化特征分别与已描述的 X. nematophilus 和X.bovienii 种的特征基本一致,将其分别定名为 X. nematophilus YL001 和 X.bovieniiYL002。 2. X.nematophilus YL001 和 X.bovienii YL002 代谢物的生物活性研究表明,两菌株对大蜡螟和粘虫具有较高的血腔毒性,处理 48h 两菌株在不同培养时间的无菌滤液对大蜡螟的致死率均为 100%,粘虫的死亡率随共生菌培养时间的延长逐渐降低;对小菜蛾和棉铃虫的胃毒活性较低;两株共生菌的血腔毒素可能主要是蛋白类物质。 室内活性测定结果表明,YL001 和 YL002 对供试的 14 种植物病原真菌和 5 种病原细菌有不同程度的抑制作用。发酵液对烟草赤星菌、番茄早疫菌、南瓜枯萎菌、黄瓜炭疽菌、稻瘟菌、小麦纹枯菌和辣椒疫霉菌有较强的抑制作用,抑制率在 75～100%;无菌滤液仅对辣椒疫霉菌有较强的抑制作用,稀释 10 倍后的抑制率为 100%,EC50 分别为 16.3 ml/L 和 13.0 ml/L。盆栽实验表明,辣椒种子用 YL001 和 YL002 发酵液处理后,辣椒幼苗的疫霉病病株减退率分别为 60.6%和 73.2%;100ml/L 的发酵液处理土壤后,辣椒幼苗的疫霉病病株减退率分别为为 48.72%和 74.34%,而甲霜灵的病株减退率为64.10%。YL001 和 YL002 对水稻白叶枯菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用,对大肠杆菌和沙门氏菌抑制作用较弱。两菌株的抑菌活性物质对热较稳定,无菌滤液在 121℃(1.4Pa/cm2)处理 15min,对蜡状芽孢杆菌的抑菌圈直径较对照分别减小了 35.2%和<WP=6>摘 要31.7%;无菌滤液 PH 在 8.0 左右时,抑菌活性较高。 3. 以抑菌圈直径和 DCW(干细胞重)为指标,筛选出 YL001 菌株的基础培养基为 YSG 培养基。在 YSG 培养基的基础上,通过单因子分析表明,YL001 菌株的最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为蛋白胨;玉米粉和豆饼粉可分别作为发酵培养基的碳源和氮源。 利用响应面优化设计分析法对 YL001 菌株的发酵动力学和发酵培养基进行了优化,结果表明,氮源对 YL001 菌株代谢物抑菌活性的影响尤为显著;其发酵动力学和发酵培养基的组成分别为(g/L): 葡萄糖 6.13、蛋白胨 21.29、MgSO41.50 、(NH4)2SO42.46、KH2PO4 0.86 、K2HPO4 1.11、Na2SO4 1.72 和玉米粉 9.69、豆饼粉 51.57、棉饼粉 6.88、鱼粉 13.75、酵母粉 4.30、MgSO41.07 、(NH4)2SO41.79、KH2PO40.63 、K2HPO40.80、Na2SO41.25。 利用响应面优化设计分析法对 YL001 菌株的摇瓶发酵条件进行优化,结果表明,摇床转速和装液量为影响发酵的主效因子,最佳摇瓶发酵条件为:PH 7.25、装液量25ml/250ml 摇瓶、 摇床转速 220r/min、温度 26.2℃、接种量 9.1%。优化条件和初始条件相比较,抑菌活性有了一定程度的提高,抑菌圈直径增大了 23.3 %,DCW 增加了52.97% YL001 菌株的摇瓶发酵过程及发酵动力学特征分析表明,发酵 0～24h 是糖的利用高峰,消耗了总糖的 83%,此阶段细胞生长较快,6h 细胞的比生长速率最大(0.21h-1),生长量在 54h 达到最大(23.81g/L),抑菌物质的活性单位在 60h 达到最大(28.6U/ml)。 4. YL001 菌株在摇瓶中的逐级放大过程中,在相同的装液系数及摇床转速下,随着摇瓶体积的增大,体积氧传递系数(KLa)逐渐增大;细胞生长量(X)、抑菌物质的活性单位(P)和最大产物比合成速率(qp)逐渐减小;达到最大活性单位的时间逐渐增大;最大细胞比生长速率(μmax)逐渐增大。摇瓶体积为 250ml 时,P、qp 、X 及 μmax分别为 23.8 U.ml-1、0.27 h-1、15.7 g.L-1、和 0.16h-1较 3000ml 摇瓶分别增加了 39.2%、70.4%、56.4%和减小了 30.4%。 从摇瓶到 7L 发酵罐的放大过程中,共生菌在发酵罐中培养时,在搅拌转速为300r/min、通气量 2.5L/min 条件下,KLa 为 185.7 h-1,产物活性单位(P)为 23.2 U.ml-1与摇瓶无明显差异(摇瓶培养条件:摇床转速 180r/min?
李岚岚[5]2014年在《Xenorhabdus Stockiae溶血素基因的克隆、表达及其活性研究》文中提出致病杆菌(Xenorhabdus sp.)与昆虫病原线虫——斯氏线虫(Steinernema)互惠共生,存在于昆虫病原线虫肠道内,属肠杆菌科,具有广谱高效杀虫、抑菌及抗肿瘤等生物活性,在体外培养过程中会发生可逆的型变,根据表型不同被分为初生型(Ⅰ型)和次生型(Ⅱ型)。嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)的溶血素)XhlA是一种细胞表面溶血素,可以降解昆虫的两种主要免疫细胞(浆血细胞和粒性白细胞),而且溶血素XhlA对菌株高效杀死烟草天蛾(Manduca sexta)幼虫是必要的。Xenorhabdus Stockiae HN_xs01是本实验室从湖南省分离出来的一株新的昆虫病原线虫共生菌,此菌种在世界范围内鲜有报道,其天然产物具有较强的杀虫、抑菌与抗肿瘤活力。本研究针对性的以致病杆菌HN_xs01菌株的基因组为模板,以HN_xs01菌株溶血素基因序列设计引物,PCR扩增获得了溶血素基因xhlA,克隆至诱导表达载体pET28a中。将含溶血素基因的表达载体pET28a-xhlA转化至大肠杆菌Rosetta (pET28a-xhlA)中,通过IPTG诱导表达了溶血素蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果显示,表达的重组蛋白约为155kDa,通过液相色谱-质谱(LC-MS)进一步鉴定了表达的溶血素蛋白。通过对初始诱导时机、诱导时间、IPTG浓度、诱导温度等条件的优化研究,发现重组菌的最佳诱导条件为：37℃发酵2h后,加入0.1mmol/L的IPTG,37℃导4h,可获得高效表达。进一步检测重组工程菌的溶血活性和磷脂酶活性,发现其超声破碎后的上清液对兔血细胞有较强的溶血活性,也能水解卵磷脂,表明工程菌能诱导表达具有溶血活性和磷脂酶活性的溶血素蛋白。同时,抗肿瘤活性检测发现重组工程菌异源表达产物对小鼠乳腺癌4T1细胞人有微弱的抑制作用,而对人肝癌Hep-3B细胞和小鼠黑色素瘤B16-F10细胞无明显的抑制作用。对从大蜡螟尸体内分离到的致病杆菌HN_xs01新菌株全基因组测序,进行序列分析,获得了溶血素基因,并在大肠杆菌中成功表达了具有溶血活性的溶血素蛋白,摸索出了最佳的表达条件,成功地建立了溶血素的表达体系。为进一步纯化出致病杆菌溶血素蛋白提供了前期研究基础,为研究致病杆菌的共生与致病机理及溶血素的应用打下了坚实的基础。
张文波, 石丹姝, 张春珍, 于志国[6]2017年在《伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovienii SN52中两个新的Rhabduscin类似物》文中研究指明采用硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备高效液相色谱技术对伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovienii SN52的次生代谢产物进行分离纯化,得到2个新的rhabduscin类似物.通过NMR和HR-ESI-MS等波谱技术和相关文献数据对照确定了它们的结构为4-O-(4-乙酰胺-β-L-鼠李糖苷)-苯甲醛(1)和4-O-(4-乙酰胺-β-L-鼠李糖苷)-(Z)-N-苯乙烯基甲酰胺(2).同时对化合物1和2的昆虫酚氧化酶抑制活性进行了评价.
刘霞[7]2006年在《昆虫病原线虫共生菌YL001菌株的代谢产物及其抑菌活性研究》文中指出昆虫病原线虫共生菌Xenorhabdus和Photorhabdus能产生多种具有抑菌、杀虫、杀线虫、抗溃疡、抗肿瘤和抗病毒活性的代谢产物,因此在农业和医药卫生领域具有较大开发潜力和应用前景,已成为一类重要的新型生物资源。本研究以从陕西杨凌筛选的昆虫病原线虫Steinernema sp中分离鉴定的共生菌X. nematophila YL001菌株为试验材料,对其代谢产物的农用抑菌活性、抑菌活性成分的分离与鉴定、抑菌作用方式及作用机理和制剂等进行了系统研究,得出以下主要研究结果及结论:1.采用抑制菌丝生长速率法、抑制孢子萌发法、活体组织法和盆栽试验法系统测定了YL001菌株细胞外代谢产物对植物病原真菌的抑制作用。结果表明,在离体条件下,其对供试的15种植物病原真菌菌丝生长均有一定抑制作用,对番茄灰霉病菌和辣椒疫霉病菌的抑制作用最强,EC_(50)分别为53.54mg·L~(-1)和90.39mg·L~(-1);对供试的6种植物病原真菌的孢子萌发均有一定抑制作用,其中对番茄灰霉病菌和烟草赤星病菌孢子萌发有较强的抑制作用,EC_(50)分别仅为16.97mg·L~(-1)和21.87mg·L~(-1);活体组织法测定表明,在0.389g·L~(-1)剂量下,其对番茄灰霉病的保护效果为74.98%,治疗效果为63.50%;盆栽试验表明,对番茄灰霉病的保护效果为65.11%,治疗效果为54.64%。以上结果说明,YL001菌株的细胞外代谢产物具有较广的抑菌谱和较强的抑菌活性。2.采用抑制菌丝生长速率法、抑制孢子萌发法和活体组织法系统测定了YL001菌株细胞内代谢产物的乙醇提取物对植物病原真菌的抑制作用。结果表明,YL001菌株细胞内代谢产物的乙醇提取物对供试的10种植物病原真菌的菌丝生长有不同程度的抑制作用,其中对番茄灰霉病菌和辣椒疫霉病菌菌丝生长的抑制作用最强,72h的EC_(50)分别为54.29 mg·L~(-1)和58.96mg·L~(-1);对供试的7种植物病原真菌的孢子萌发均有一定的抑制作用,其中对番茄灰霉病菌和番茄叶霉病菌的孢子萌发抑制作用最强,EC_(50)分别是267.36mg·L~(-1)和96.48mg·L~(-1);供试浓度为10mg·mL~(-1)时对番茄灰霉病的保护效果为64.81%,治疗效果为62.03%。说明YL001菌株的细胞内代谢产物亦具有较广的抑菌谱和较强的抑菌活性。3.以番茄灰霉病菌和蜡状芽孢杆菌为示踪生物,对YL001菌株的细胞内代谢产物和细胞外代谢产物进行了抑菌活性成分的分离。从细胞内代谢产物中分离出5种具有抑菌活性的化合物,其中4种(1#,3#,4#和5#)结构已初步确定,分别为,6-α,β,γ亚甲基-N~2-1,3,N~2,N~4-环丁二内酰胺、2,3-二甲基-β-氨基丁酸-甘氨酸环二肽、β,γ亚甲基取代γ内酯和N-甲基-乙二酰胺,6#化合物的结构正在鉴定之中。生测结果表明,在0.5mg·mL~(-1)的供试浓度下,1#、3#、4#和5#化合物对番茄灰霉病菌菌丝生
田晓美[8]2016年在《伯氏致病杆菌SN52菌株次生代谢产物分离纯化及结构鉴定》文中提出昆虫病原线虫共生菌(entomopathogenic bacteria)与土壤中的线虫共生,主要包括与异小杆线虫共生的发光杆菌和与斯氏线虫共生的致病杆菌属。最近研究表明,致病杆菌能够产生丰富的次生代谢产物,特别是小分子毒素,具有杀虫、抗菌、除草等生物活性,已成为重要的新型农用抗生素来源。近年来,我国对致病杆菌的研究主要集中在发酵液活性、杀虫机理等方面,而对其次生代谢产物的分离纯化及生物活性研究较少。本文重点对致病杆菌进行相关研究,主要包括：分离昆虫病原线虫共生菌、筛选活性菌株并鉴定其种属、分离纯化次生代谢产物及鉴定单体化合物、测定单体化合物的生物活性等方面,为开发新型的微生物源农用抗生素奠定基础。结果如下：1.昆虫痫原线虫共生菌的分离：在辽宁地区采集土样146个,以NBTA为分离培养基采用white-tra P法,共分离43株共生菌,其中包含41株初生型菌株和2株次生型菌株。2.具有生物活性的共生菌菌株筛选：对这43株菌进行液体培养,采用大孔树脂吸附的方法提取共生菌的粗提物,采用HPLC检测技术,进行化学筛选,共筛选出9种产物各不相同的菌株发酵粗提物,记为ETi, ET2, ET3, ET4, ET5, ET6, ET7, ET8, ET9。以麦根腐平脐蠕孢、番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、玉米大斑病菌、辣椒疫霉、禾谷镰刀菌、立枯丝核菌为靶标菌,以100 μg/mL浓度时的菌丝生长抑制率作为参考,采用平板对峙培养法对以上9种粗提物做活性筛选,抑制率最大的粗提物为ET4,其对番茄灰霉病菌的抑制率为85%,所对应的菌株为SN52。3.SN52菌株的鉴定：对SN52菌株进行生理生化特性测定和16S rRNA序列分析。PCR扩增SN52菌株的16S rRNA序列,选择同源序列进行Clustal比对,采用Mega 6.0软件构建系统发育树,结果显示SN52菌株与Xenorhabdus bovienii聚在一起,同源性为100%,同时结合生理生化特征结果,显示SN52菌株与Xenorhabdus bovienii为同种,将其编号为Xenorhabdus bovienii SN52。4.SN52菌株次生代谢产物的分离纯化：对伯氏致病杆菌SN52进行大批量发酵,采用活性追踪法对其活性成分进行追踪。分别采用硅胶柱层析、凝胶LH-20柱层析和半制备高效液相色谱技术对SN52菌株的活性次生代谢产物进行分离纯化,最终得到6个单体化合物,并分别命名为Mi， M2， M3, M4， Ms， M6。通过波谱综合解析和文献数据对照方法对其进行结构鉴定。结果显示,上述6种单体化合物均为吲哚类化合物,其中5个为已知化合物,分别鉴定为:xenocyloins A(Ms), xenocyloins B(M6). xenocyloins C (M3). xenocyloins D(M4)和xenocyloins E (M2);1个为新化合物,命名为xenocyloinsF(M1)。5. SN521菌株次生代谢产物生物活性测定：以番茄灰霉病菌为靶标病原真菌,百菌清原药为阳性对照,采用平板对峙培养法设置5个浓度梯度测定该6个单体化合物生物活性。结果表明,M1的EC5o为88.44 μg/mL, M2的EC5o为100.94μg/mL, M3的EC50为43.90μg/mL, M4的 EC50为60.15μg/mL, M5的EC5o为21.78 μg/mL, M6的EC5o为34.43μg/mL。
杨保军[9]2005年在《嗜线虫致病杆菌北京变种CB6菌株杀虫蛋白的分离和纯化》文中进行了进一步梳理嗜线虫致病杆菌北京变种(Xenorhabdus nematophila var.pekingensis)CB6菌株是从北京郊区土壤中分离的小卷蛾斯氏线虫(Steinernema carpocaposae)肠道内所分离到的共生细菌,已经鉴定并定名。研究表明该菌株具有良好的杀虫活性。为挖掘这一本土细菌资源,本研究将其与另9个昆虫病原线虫共生细菌菌株进行了杀虫活性比较,对10个不同来源的昆虫病原线虫共生菌菌株胞内和胞外产物进行分离,将各产物的可溶性蛋白提取,并分别进行生物测定,结果表明CB6菌株产杀虫蛋白性能好。在此基础上以CB6菌株作为研究材料,分离纯化其胞内和胞外的杀虫活性蛋白,建立一套纯化该活性蛋白的技术参数,并对杀虫蛋白的特性进行了初步鉴定。现将主要研究结果总结如下: 1.测定的10个菌株发酵液均对棉铃虫和甜菜夜蛾幼虫有口服毒性,活性物质的产生部位在菌体胞内和胞外均有。不同菌种或同一菌种的发酵液、胞内或胞外产物和菌体碎片的杀虫活性不尽相同,一般胞内产物的活性要高于胞外。胞内胞外总蛋白的生测结果初步断定10个供试菌株所表现出的杀虫活性物质主要是蛋白类。 2.建立了一条有效纯化CB6菌株杀虫蛋白的技术路线,通过该纯化层析方案能获得纯化倍数较高的目标蛋白。其基本参数包括: 硫酸铵盐析:最佳硫酸铵饱和度为20～50%;离子交换层析:使用DEAE Sepharose FF层析柱,洗脱低盐为25mM Tris-HCl(pH7.4),高盐为1mol/L NaCl;洗脱高盐体积范围15～30%;疏水层析:使用Butyl FF层析柱,洗脱高盐为3mol/L NaCl+25mM Tris-HCl(pH7.4),低盐为25mM Tris-HCl(pH7.4)。凝胶层析:使用Sephacryl S-200 16/10层析柱,洗脱buffer:25mM Tris-HCl(pH7.4)。 通过该纯化技术路线所获得的目标蛋白浓度为4.134μg/mL,表现出对棉铃虫初孵幼虫97.9%的生长抑制率。 3.从CB6菌株胞内和胞外所获得的目标蛋白native-PAGE表明分子量都大于669kD,电泳带位置相同。该目标蛋白SDS-PAGE表明,2个目标蛋白都只出现一条分子量约为220kD的带。纯化该目标蛋白的层析技术完全相同。这说明CB6菌株胞内和胞外所产的目标蛋白可能是同一种蛋白。 4.目标蛋白的紫外吸收光谱在250～290nm下有吸收值。蛋白染色试验结果表明,目标蛋白不是脂蛋白,也不是糖蛋白。 CB6菌株发酵液中具有杀虫活性的物质为蛋白质,该种蛋白质具有较高的生物活性,严重抑制棉铃虫幼虫的取食和生长发育。本研究首次报道了CB6菌株胞内和胞外所产杀虫蛋白具有相似性,为开展胞内胞外杀虫蛋白的来源关系的研究奠定基础。本研究所建立的纯化该类杀虫蛋白的技术路线,为研究该菌株杀虫蛋白的作用机理以及为该杀虫蛋白基因的克隆提供了依据和基础。
方启, 孙丹丹, 俞银贤, 邓子新, 林双君[10]2015年在《线虫共生致病杆菌PacYellow的吲哚抗生素》文中认为【目的】研究特殊生境的微生物——嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus bovienii Pac Yellow)的次级代谢产物,为微生物药物或农用抗生素开发提供结构多样的化合物。【方法】通过16S r RNA基因比对鉴定菌株;利用薄层层析、硅胶柱层析、凝胶层析、液相制备等技术进行分离纯化;利用质谱、红外光谱与核磁共振等光谱技术鉴定化合物结构。【结果】Pac Yellow菌株被鉴定属于致病杆菌属bovienii种。从该菌株中分离纯化了4个单体化合物,它们的结构被鉴定为吲哚类衍生物,可能源于色氨酸与缬氨酸或异亮氨酸的缩合产物。【结论】从嗜线虫致病杆菌——Pac Yellow菌株中分离鉴定了4个吲哚生物碱类抗生素,它们具有中等到高的抗菌活性。
参考文献：
[1]. 昆虫病原线虫共生菌的鉴定、培养及其抑菌活性研究[D]. 方香玲. 西北农林科技大学. 2008
[2]. 致病杆菌Xenorhabdus bovienii SN84次生代谢产物对三种植物病原真菌抑菌作用的研究[D]. 俞晗. 沈阳农业大学. 2017
[3]. 嗜线虫致病杆菌YL001抑菌活性成分研究[D]. 许鹏. 西北农林科技大学. 2016
[4]. 昆虫病原线虫共生菌培养与活性研究[D]. 王永宏. 西北农林科技大学. 2005
[5]. Xenorhabdus Stockiae溶血素基因的克隆、表达及其活性研究[D]. 李岚岚. 湖南师范大学. 2014
[6]. 伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovienii SN52中两个新的Rhabduscin类似物[J]. 张文波, 石丹姝, 张春珍, 于志国. 有机化学. 2017
[7]. 昆虫病原线虫共生菌YL001菌株的代谢产物及其抑菌活性研究[D]. 刘霞. 西北农林科技大学. 2006
[8]. 伯氏致病杆菌SN52菌株次生代谢产物分离纯化及结构鉴定[D]. 田晓美. 沈阳农业大学. 2016
[9]. 嗜线虫致病杆菌北京变种CB6菌株杀虫蛋白的分离和纯化[D]. 杨保军. 中国农业科学院. 2005
[10]. 线虫共生致病杆菌PacYellow的吲哚抗生素[J]. 方启, 孙丹丹, 俞银贤, 邓子新, 林双君. 微生物学通报. 2015