（1.武汉市第三医院 湖北武汉 430000） （2.武汉市武昌医院 湖北武汉 430000）
（湖北省自然科学基金资助项目(面上基金) 项目编号 2014CFB450）
（武汉市卫生计生委临床医学科研资助项目 项目编号 wx15D21）
【摘要】目的：探讨用于亨廷顿病治疗提供的药物筛选模型，为亨廷顿病的药物治疗提供理论支持和实验依据。方法：SD大鼠45只，分为正常对照组、毁损组、移植组3组，每组15只。正常组不予以处理，其余两组均用奎宁酸（QA）脑内注射，移植组在QA毁损模型建立后进行人诱导多能干细胞hiPSC移植。hiPSC在大鼠脑内存活了7周，通过阿扑吗啡诱导旋转实验等行为学实验，观察各组大鼠运动功能情况；通过高十字迷宫、新环境抑制进食实验，观察各组焦虑类似的行为变化。结果：与QA组相对比，观察到hiPSC移植组大鼠运动功能得到改善，大鼠焦虑类似的行为明显减少。hiPSC移植组大鼠的活动减少。结论：hiPSC移植可以有效的改善HD大鼠的行为缺陷，hiPSC在治疗神经退行性疾病特别是HD亨廷顿病，是一种理想的多潜能干细胞来源。
【关键词】诱导多能干细胞；亨廷顿病；细胞移植；运动和非运动功能检测
Transplantation of human induced pluripotent stem cells in the rat
model of Huntington 's disease
Bo Chen1，Caikui Luo *,Xiaoxiang Yu
(The Third Hospital of Wuhan，Wuhan 430000，China)
Abstract：Aim: To explore the drug screening model for the treatment of Huntington's disease and provide theoretical support and experimental basis for the drug therapy of Huntington's disease. Methods: Forty - five SD rats were divided into three groups: normal control group，damaged group and transplanted group，each of 15. Normal control group without any treatment，and the other two groups were treated with QA injection. The transplanted group was transplanted with human induced hiPSC after the establishment of the QA lesion model in the normal control group. The rats were induced to undergo pluripotent stem cells survival for 7 weeks. The motor function of the rats was observed by apomorphine-induced rotation test. By Maze，the new environment inhibition of eating experiments，to observe similar behavioral changes in various groups of anxiety. Results: Compared with the QA group，the motor function of the hippocampal neurons in the hippocampal neurons of the hippocampus was improved，and the behavior of anxiety-like behavior in the hippocampus was significantly reduced. The activity of the hippocampal neurons in the hiPSC group was reduced. Conclusion: HiPSC transplantation can effectively improve the behavioral deficits of HD rats. HiPSC is an ideal multipotent stem cell source for the treatment of neurodegenerative diseases，especially Huntington's disease.
Keywords：Induced pluripotent stem cells ;HD; transplantation ; Motion and non-motor function testing
亨廷顿病（Huntington 's disease,HD）是一种以纹状体和大脑皮质中型棘状神经元大量丢失为特点疾病，而皮层神经元的丢失、变性会导致HD大鼠模型出现认知和情绪方面的改变[1][2]。尽管亨廷顿病的致病基因和相关蛋白都已清楚，但到目前为止，确切的致病机理仍不清楚。研究表明，将兴奋性毒性物质奎宁酸（Quinic acid,QA）注射至纹状体内可以模拟亨廷顿病病理改变，进行移植治疗的研究[3][4]。
随着细胞治疗技术的发展，细胞移植被认为是HD治疗最有前景的方法，尤其是人诱导多能干细胞（Human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）的出现，揭开了再生医学领域新篇章。通过将外源性转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)[5]导入人或动物体细胞诱导其逆分化而形成多能干细胞，具有多能分化潜能及自我更新能力，不仅规避了应用胚胎干细胞的伦理学争议，也解决了细胞来源有限的问题，为细胞移植治疗神经变性疾病带来了新的希望。近年来应用iPSC技术进行细胞移植治疗或构建疾病细胞模型的研究报道逐渐增多。Hargus等[6]利用PD患者自体来源的iPSC分化为多巴胺能神经元后移植至PD大鼠模型中，发现了明显的行为学改善，Jeon等[7]使用HD患者自体来源的iPSC分化而成的神经前体细胞移植治疗HD大鼠，获得了明显的行为学改善，并在宿主靶区探测到分化形成的GABA能神经元。在本研究中，我们移植iPSC至QA毁损的HD模型大鼠，观察其对大鼠运动和非运动功能的改善作用。
1 材料和方法
1.1实验动物
所有的动物测试和训练过程符合医学伦理委员会批准，所有的动物随机分笼，每笼5只大鼠，饲养条件为21℃，65%的湿度，昼夜节律为12h，不限食水。分为三组，n=15（a）对照组：不予以任何处理（b）QA毁损组：QA毁损的HD大鼠模型（c）hiPSC移植组：在建模成功后移植hiPSC。
1.2 方法
1.2.1 人诱导多能干细胞用含标记基因病毒的转导
用重组慢病毒液来转导人诱导多能干细胞，将第3代人诱导多能干细胞以3×106个接种至T75培养瓶中，2天后开始转导，转导的效率通过荧光显微镜检测GFP和JRed基因的表达，转导72h后用加含有嘌呤霉素培养基培养。
1.2.2 奎宁酸注射毁损纹状体、诱导多能干细胞移植
大鼠腹腔麻醉后，除对照组外单次注射QA至单侧纹状体，7天后将大鼠随机分为2组，一组移植人诱导多能干细胞至纹状体毁损侧，另一组在毁损侧纹状体注射碱性磷酸盐。
1.2.3 运动功能测试
1.2.3.1阿扑吗啡诱导的旋转实验
所有的大鼠按照1.0mg/kg注射阿扑吗啡，放置在有机玻璃圆筒中，每60min记录一次动物的旋转运动，在移植后2、4、6周分别进行测试一次。计算损毁侧同侧和对侧身体旋转次数：毁损同侧的净旋转百分比=同侧旋转次数-对侧旋转次数/总旋转次数×100。
1.2.3.2 悬挂实验
大鼠咬住粗0.5cm线，线距离地面高度为30cm，记录在60s内跌落次数。测试每周进行3天，每次3个实验，取平均成绩。悬挂实验在移植后1-6周进行作为最后的运动测试结果。
1.2.4 非运动测试
1.2.4.1 高架十字迷宫实验
测试前将每只大鼠放置在迷宫中适应5min，实验观察员在距装置2m远处观察大鼠的行为。在预实验完成后，将大鼠置于装置的中间面对开放的臂，测试焦虑相关的行为包括在开放和封闭的臂中所用总时间，在开放臂中花费更长时间预示焦虑程度低，测量总运动距离来评价自发活动水平。
1.2.4.2 新环境进食抑制实验
将糖丸放置在新环境的中央，记录每只大鼠离开角落的等待时间和在达到并开始进食糖丸的时间和记录喂食的情况，后将大鼠放回至原笼子中，记录在5、15、30时三个点大鼠摄入食物量，作为衡量摄食的动力。
1.2.5 组织学分析
向腹腔内注射胺碘酮（100mg/kg）和盐酸赛拉嗪（5mg/kg），然后固定脑组织并称重，用10%福尔马林固定7天后切除后脑，将前脑石蜡包埋后在显微镜下薄片切片机下连续切片，采用苏木素-曙红和0.5%紫罗兰进行染色，盖上玻片在10倍的普通显微镜和荧光显微镜下观察。
1.3 数据分析
所有的数据分析均采用多重测量方差分析，所有的多重比较均采用图基（tukey）事后比较法来进行分析比较，确定哪些组有统计学意义。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 阿扑吗啡诱导旋转实验行为学分析
和对照组相比，注射1.0mg/kg阿扑吗啡后HD大鼠模型非对称旋转行为具有统计学意义（P <0.0001），hiPSC移植组在移植后两周表现旋转运动减少。只有QA组表现随着时间表现出旋转运动的次数不断增加，hiPSC移植组表现出减少的趋势，在所有的移植后阶段具有统计学意义（图1）。
移植后的时间
图1 hiPSC移植组在移植后2-6周，旋转次数明显减少（P≦0.0001）
2.2 悬挂测试
在移植后6周，毁损组和hiPSC移植组从线上跌落的潜伏期时间表现出达到预期的效果与hiPSC组相比，毁损组在线上悬挂的时间更短（图2）。结果表明移植hiPSC能显著的改善运动功能方面的缺陷。
图2 hiPSC移植组在移植后2-6周大鼠持续的时间更长（P≦0.001）
2.3 高架十字迷宫来检测大鼠的焦虑水平
将QA毁损组和hiPSC组在封闭的臂中所花总的时间进行单因素方差分析，具有统计学意义（P≤0.05）。在移植后3周和QA组相对比，hiPSC组在封闭臂中花的时间更短。hiPSC移植组和未手术对照组在焦虑程度上没有区别（图3）。
图3 和QA毁损组大鼠相比，hiPSC移植组从第3周起在封闭的臂中花费的时间更短(*P≦0.05)
2.4 新环境进食抑制实验中的焦虑类似的表现
QA毁损组变现出明显的焦虑类似的表现。在目前的研究中，和QA毁损组大鼠相比，在新环境进食移植实验中，hiPSC移植组大鼠在旷场实验的仪器中进食等待时间（310.8+23.7s）明显短于QA毁损组（图4）（438.7+25.8s）（P≦0.01）。
图4 将hiPSC移植至HD大鼠模型中有抗焦虑的作用
3 讨论
HD可导致运动功能和精神方面的异常，目前研究主要通过动物模型探索改善行为的神经学方面机制，这些机制包括神经元的分化和替代治疗、生长因子的释放等，且都可能与损伤修复的过程有关。根据之前的研究发现，hiPSC移植至HD大鼠模型中可能缓解运动功能和认知功能的缺陷[7]，且hiPSC相对其他细胞移植手段，可以通过采用患者自体来源的细胞，重编程为hiPSC，避免移植后的免疫排斥反应，是一种极好的细胞来源[8]。
在本研究中，将hiPSC移植至HD大鼠模型，采用QA毁损模型进行对比，通过阿扑吗啡诱导的旋转、悬挂实验以及高架十字迷宫实验来进行测试，着重观察其运动功能和非运动功能能否得到改善。结果表明在QA组中，大鼠的功能缺失会随着时间越来越严重，而将hiPSC移植至QA毁损的HD模型中没有出现免疫排斥反应，由纹状体退化所导致的运动和探索功能得到了显著的改善，运动功能的损害和情绪的缺陷很少。尽管可以观察到探索的形式如站立、排泄的次数、恐惧的次数较少等改变，QA毁损的大鼠运动基线水平没有限制大鼠的行为学改变，且相对于hiPSC移植组大鼠来说运动更加频繁。在探索新环境中，大鼠的通过测试站立和排泄的次数提示情绪觉醒增多了，随着过程的不断熟练而情绪状态觉醒减少。在移植hiPSC至QA毁损的大鼠后6周，重建了情绪状态的水平。
尽管hiPSC的移植治疗呈现出极有前景的发展趋势，但是在临床上HD疾病利用细胞替代治疗正处于审查的阶段，虽然理论上可行，细胞替代治疗的局限性仍备受关注[9]。对于将hiPSC移植至HD大鼠中，目前面临的难题还有移植细胞的存活、理论的可行性和异体移植后的排斥反应[10]。总之，hiPSC移植治疗研究的结果初步证实，向HD大鼠模型纹状体内移植hiPSC可能可以缓解HD的运动和非运动缺陷，其作为理想的药物筛选模型及移植治疗干预手段的运用和推广有待更深层次的研究。
参考文献：
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论文作者:陈波1,杜谢琴2*,余小祥1
论文发表刊物:《中医杂志》2016年12月
论文发表时间:2017/6/1
标签：大鼠论文; 纹状体论文; 干细胞论文; 诱导论文; 模型论文; 功能论文; 细胞论文; 《中医杂志》2016年12月论文;