【摘要】目的：以前期较成熟湿阻中焦证动物模型为研究平台，研究湿阻中焦证动物模型对水盐协同转运蛋白的影响以及燥湿和胃及利水渗湿两种常用的治湿方法干预后的影响，揭示湿阻中焦证动物模型对水液代谢的影响的机制，从系统生物学水平揭示肾脏在调节水液代谢方面分子机制以及燥湿和胃及利水渗湿两种临床上常用治湿之法对水盐协同转运蛋白的影响。方法：模拟外湿过盛、困阻脾胃，饮食不节、湿从内生，情志不遂，气机受阻，水湿不运三大致湿病因，建立湿阻中焦证模型。用酶联免疫法（ELISA）测定KCC1、KCC3、KCC4、NKCC1的含量。结果：湿阻中焦证模型KCC1、KCC4含量呈上升趋势，KCC3、NKCC1的含量呈下降趋势，经自然恢复后KCC1、KCC3、NKCC1的含量呈下降趋势，KCC4略有上升，但无统计学意义，给药干预后KCC1、KCC3、KCC4、NKCC1的含量均显著下降（P＜0.01）。结论：湿阻中焦证可能影响机体水液代谢，导致水盐代谢失调，而中医燥湿和胃及利水渗湿两种治疗湿阻中焦的方法可能通过调节机体水盐代谢从而改善湿阻中焦症状。
【关键词】湿阻中焦证；水盐协同转运蛋白；不换金正气散；利水渗湿
【中图分类号】R259 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）35-0220-03
Eliminating dampness and diuresis and stomach wet treatment of dampness obstructing spleen stomach syndrome of the synergistic effect of the transporter protein on renal salt water
ChenFang, Huang Xiusheng, Zhang Kaiwen,Yu Yi, Xu Meng.
Chengdu universityof TCM Sichuan Chengdu 611137,China.
【Abstract】Objective To early mature wet resistance in middle Jiao animal model as the research platform, research the dampness obstructing spleen stomach syndrome animal model of dampness two commonly used treatment methods of wet intervention effect on water and salt transport proteins and the synergistic effect of dampness and stomach and diuresis, revealing the mechanism of dampness obstructing spleen stomach syndrome animal model effect the water metabolism of the kidney revealed dampness two commonly used in clinical treatment of wet method on water and salt cotransporter effect in the regulation of water metabolism and molecular mechanism of dampness and gastric and water from the level of system biology. Methods Simulation ofThe dampness is too high, trapped spleen and stomach, improper diet. In the wet, emotional upset, gas is blocked, water is not shipped approximately three wet cause, establish the dampness obstructing spleen stomach syndrome model. Using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) determination of KCC1, KCC3, KCC4, NKCC1 respectively. Results The dampness obstructing spleen stomach syndrome model of KCC1, the content of KCC4 increased, KCC 3, the content of NKCC1 decreased, the natural recovery after KCC1, KCC3, NKCC1 content decreased, KCC4 increased slightly, but there was no significant drug intervention of KCC1, KCC3, KCC4, NKCC1 were significantly decreased (P< 0.01). Conclusion The dampness obstructing spleen stomach syndrome may affect the body water metabolism, resulting in water and salt metabolism disorders, while TCM dampness and stomach and dampness of two methods in the treatment of dampness obstructing spleen may regulate the metabolism of water and salt to improve the symptoms of dampness obstructing spleen.
【Key words】Dampness obstructing spleen stomach syndrome;Water salt cotransporter;Does not change the gold wendlandii;Dampness
人体的水液代谢是一个复杂的生理过程，中医学对人体的水液代谢在《黄帝内经》就已经有了一定的认识，津液的生成，是通过胃对饮食物的游溢精气和小肠的分清别浊，上输于脾而成的全身津液的输布和排泄主要是以三焦为通道肺、脾、肾三脏的协同作用完成。其中肾为水脏，主水，蒸腾气化水液，调节全身水液代谢。湿阻中焦是指是指湿邪困阻脾胃，阻遏气机，水津输布失调所表现的脘腹胀满，不思饮食，口淡无味，口干不欲饮，恶心呕吐，头身困重，怠惰嗜睡，便溏腹泻，舌苔厚腻，脉缓等一系列症状。燥湿和胃及利水渗湿法为治疗湿阻中焦证两种重要方法，研究小组采用前期综合造模法进行造模[2]，选用不换金正气散及平胃散加泽泻两个重要的治疗湿阻中焦的方剂级西药利尿剂呋塞米作用于湿阻中焦证大鼠，研究燥湿和胃及利水渗湿对湿阻中焦证大鼠肾脏水盐协同转运蛋白的的影响，揭示湿阻中焦对大鼠水电解质的影响及燥湿和胃及利水渗湿对湿阻中焦证水液代谢的改善机制。为治疗湿租中焦证提供实验依据。
1.材料与方法
1.1 动物SPF大鼠90只，雌雄各半,体质量180-220g,购于成都达硕生物科技有限公司，合格证号：SCXK（川）2015-6。适应性饲养三天，自由饮食，动物房温度维持在18～25℃。
1.2 药物
1.2.1造模用药 成都人人乐超市购买熟猪油，自制4℃冰水。
1.2.2治疗用药不换金正气散的制备 藿香12g,制半夏12g苍术8g，厚朴8g，陈皮8g,炙甘草4g,以上均购于同仁堂成都分店。经成都中医药大学生物教研室老师鉴定均为正品。先将药物加水浸泡1h，然后与大枣两枚，生姜两片同煮，最后熬制成流浸膏，分装，-20℃保存备用。
平胃散加泽泻：苍术8g、厚朴6g、陈皮4g、泽泻20g、炙甘草2g，购于四川新荷花中药饮片股份有限公司，经成都中医药大学制剂室鉴定合格；
呋塞米片，江苏亚邦爱普森药业有限公司，生产批号：13H125
1.3 试剂KCC1试剂盒，（上海尚乐生物科技有限公司，生产批号：LOT201507）； KCC3 ELISA试剂盒（上海尚乐生物科技有限公司，生产批号：LOT201507）；KCC3 ELISA试剂盒（上海尚乐生物科技有限公司，生产批号：LOT201507）；NKCC1 ELISA试剂盒（上海尚乐生物科技有限公司，生产批号：LOT201507）。
1.4 仪器
自制造模箱；T－5000型电子天平(常熟双杰测试仪器厂)；酶标定量测定仪(美国ThermoFisher公司Varioskan TM)；高速低温离心机(上海科学仪器厂，TGL-16G)；DY89－2型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
2.方法
2.1 分组造模及给药
SPF大鼠70只，雌雄各半，按体重分层随机分为空白组、模型组、自然恢复组、不换金高、低剂量组，平胃散加泽泻组，西药呋塞米组每组10只。空白组正常饲养，其余各组模拟外湿过盛，困阻脾胃、饮食不节，湿从内生、情志不遂，气机受阻，水湿不运三大致湿病因，建立湿阻中焦证模型。将造模大鼠放在温度18～25℃，湿度90%±5%的造模箱内饲养，模拟“久居湿地，外湿过盛”；造模大鼠单日禁食并给予4℃冰水（2ml/只）灌胃一次，双日供应充足饲料并给予猪油（4ml/只）灌胃一次，模拟“饮食不节，饥饱失常”；每日9:00～16:00令大鼠站在4cm深的水中，控制睡眠时间7小时，打乱其生物钟，模拟“情志不遂”。连续20日。造模结束后，模型组与空白组处死取材，自然恢复组给予常温饮用水2ml/只/天灌胃处理3天后，用药组给予相应浓度的药物2ml/只/天灌胃处理3天后处死取材。
2.2 取材并检验
大鼠脱颈椎处死后打开腹腔,根据解剖位置找到大鼠肝脏，用手术剪从根部剪下，锡箔纸包好，4℃冰箱保存。分别将大鼠肾组织称重，(1：9)匀浆，离心(2500r/min，20min)，抽取上清液，酶联免疫法(ELISA)测定KCC1、KCC3、KCC4、NKCC1的含量。实验严格按说明书操作。
2.3 统计方法
本实验用SPSS 21.0统计,所有的数据用x-±s，行单因素方差分析处理,先正态性差齐性检验，检测同时满足正态性和方差齐性时用LSD检验；检测不同时满足正态性和方差齐性时，采用非参数检验法检验。
3.结果
3.1 一般状态湿阻中焦证大鼠明显出现毛色晦暗、懒动、食欲不振等情况而空白组大鼠毛色润泽，较为活泼。
3.2 湿阻中焦证肾脏水盐协同转运蛋白KCC1、KCC3含量及运用燥湿和胃及利水渗湿法治疗后的变化。如表1所示与空白组相比，湿阻中焦后大鼠肾脏KCC1含量明显升高，自然恢复组降低明显，差异有统计学意义（P＜0.01）。经药物治疗后，各给药组均有明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）且不换金正气散KCC1含量下降幅度较大。与空白组相比，模型组和自然恢复组大鼠肾脏KCC3含量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，自然恢复组肾脏KCC3含量继续降低，经药物干预后，KCC3含量均显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。
表1 肾脏水盐协同转运蛋白KCC1、KCC3、KCC4含量
（n=10，x-±s，单位：pg/ml）
3.3 湿阻中焦证肾脏水盐协同转运蛋白KCC1、KCC3含量及运用燥湿和胃及利水渗湿法治疗后的变化。如表2所示，与空白组比较湿阻中焦后KCC4。
的含量略有上升，经自然恢复后持续上升（P＜0.01），经药物干预后，KCC3含量均显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；且经不换金正气散治疗后KCC3含量降低幅度小于平胃散加泽泻组和呋塞米组；与空白组比较，湿阻中焦后NKCC1的含量则略有下降，自然恢复后持续降低，经药物干预后，NKCC1含量均显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；且经不换金正气散治疗后NKCC1含量降低幅度小于平胃散加泽泻组和呋塞米组。
表2 肾脏水盐协同转运蛋白KCC4、NKCC1含量
4.讨论
膜蛋白对水的转运主要通过渗透和协同转运两种方式完成。KCCs和NKCC1完全依赖协同转运。在生理状态下，细胞内钟、氯离子高于胞外，钟离子主要由纳系供给。同理KCCs转运子对K+、Cl-和水的协同转运动力也来自于此。KCC1是一个有功能特性的协同转运蛋白，表达在非洲爪赡卵母细胞和HEK293细胞，在细胞体积调节方面起着重要作用。KCC3在多个脏腑器官有表达,KCC3磷酸化位点位于质膜，而不是来源于内部协同转运载体口[2]。在功能方面，KCC3能够调节肾脏功能和血压。作为肾脏重吸收机制调节，缺乏KCC3会导致近端小管重吸收减少。KCC4作为Cl-的重要调节器，在间质细胞酸碱平衡重吸收有重要作用，KCC4和H+-K+-ATP酶突变会表现为肾小管酸中毒，以及耳聋由于耳蜗外毛细胞的退化[3]。NKCC1协同转运蛋白主要功能是为细胞提供Cl-，促进其在细胞顶端分泌；NKCC1转运子是分泌细胞水转运的重要部分，对水的协同转运起着重要作用，NKCC1转运子协同方式转运的水量约占最终分泌液中水量的80％，此时分泌液中的Na+:Cl-:H2O比例约为1:1:370。非上皮细胞NKCC1由于细胞体积激活调节机制，而产生调节细胞体积的作用。NKCC1转运体对水的协同转运构成了分泌细胞水转运总量的重要部分。分泌模型中，NKCC1转运体对氯离子的转运通量决定着细胞层离子的分泌速率。[4]KCCs转运子通过K+或Cl-从细胞内向细胞外排出，会协同转运500个水分子；NKCC1转运子通过Na+或Cl-从细胞外向细胞内内流时，会带动295个水分子协同转运，由此可见KCCs及NKCC1偶联转运对于维持细胞水液代谢稳态起着重要作用。
实验结果显示，湿阻中焦后毛色晦暗、懒动、食欲不振，小便偏黄而尿多，可能是由于湿阻中焦后导致水冶代谢失常造成的。课题组前期实验发现湿阻中焦后肾脏Na+-K+-ATP酶的活性降低，[5]由此推测湿阻中焦后，KCC1含量增多，从而导致水液排出增多，回吸收障碍，另一方面，大量的Na+进入细胞内，根据渗透压必然会引起过多水分进入细胞内，导致细胞内外离子分布异常形成细胞内水钠潴留，K+丢失，水液平衡失调。Na+-K+-ATP酶的活性降低，机体相应表现出懒动、食欲不振，多尿。经自然恢复后，KCC1、KCC3、NKCC1含量降低，肾脏主水并维持细胞渗透压状态，水液平衡失调后机体通过调节，KCC1、KCC3、NKCC1的含量来维持基本代谢。用燥湿和胃及利水渗湿法对湿阻中焦证大鼠进行治疗后KCC1、KCC3、KCC3、NKCC1的含量均显著降低，这可能是利尿剂和祛湿剂能够减少细胞内K+或Cl-的排出和细胞外Na+或Cl-的进入，改善水盐代谢紊乱并抑制水液在肾小管的重吸收，调节并促进间质液水分排出，通过排出多余的水液改善机体的水液代谢情况，同时这也体现了中医中“治湿不利小便，非其治也”的基本思路。
本研究对燥湿和胃及利水渗湿法两类治湿法对湿阻中焦水水盐代谢影响做了初步的研究，下一步，本课题组将继续对这两种治湿法对机体水糖代谢代谢及机体水液代谢相关激素的影响作更加深入的研究。为临床上治疗湿困脾胃证提供新思路。
【参考文献】
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[5]徐萌.平胃散对湿阻中焦证大鼠水协同转运蛋白SLC12家族影响的研究[D].成都中医药大学, 2015.
论文作者:陈芳,黄秀深（通讯作者）,张凯文,于毅,徐萌
论文发表刊物:《医药前沿》2017年12月第35期
论文发表时间:2018/1/11
标签：中焦论文; 含量论文; 燥湿论文; 肾脏论文; 细胞论文; 大鼠论文; 金正论文; 《医药前沿》2017年12月第35期论文;