付正[1]2004年在《酪丝亮肽抗肝癌作用及对肿瘤细胞内钙稳态影响机制的研究》文中研究指明目的:观察叁肽化合物酪丝亮肽的抗肿瘤作用,初步探讨其可能的作用机制。 方法:建立裸鼠人肝癌BEL-7402移植瘤模型,观察酪丝亮肽对荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用;应用透射电镜研究酪丝亮肽对裸鼠人肝癌BEL-7402移植瘤细胞超微结构的影响。应用激光扫描共聚焦显微技术,观察酪丝亮肽对体外培养人肝癌BEL-7402细胞和人正常肝细胞株Chang氏肝胞浆游离钙离子浓度瞬时变化的影响;应用流式细胞仪研究酪丝亮肽对体外培养人肝癌BEL-7402细胞胞浆游离钙离子浓度长时相的影响;应用流式细胞仪分析酪丝亮肽对体外培养的肿瘤细胞BEL-7402线粒体膜电位的影响;观察酪丝亮肽对BEL-7402细胞Ca~(2+)-Mg~(2+)ATP酶活力的影响。应用流式细胞仪、透射电镜及原位末端标记技术观察酪丝亮肽在体内和体外对肿瘤细胞BEL-7402的促凋亡和坏死作用。 结果:酪丝亮肽能显着抑制人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤的生长,80μg/kg/d、160μg/kg/d和320μg/kg/d给药剂量组的肿瘤生长抑制率分别为,21.66%、34.78%和41.34%,电镜观察发现酪丝亮肽可引起移植瘤细胞的坏死和凋亡,细胞器线粒体和内质网损伤,并出现钙沉积。 激光扫描共聚焦显微镜与流式细胞仪观察表明,酪丝亮肽可引起体外培养BEL-7402细胞胞浆钙离子浓度在短时间内大幅升高,10μg/ml药物在400s内引起胞浆钙离子升高的最高幅度可达239.13%,酪丝亮肽持续作用1hr后胞浆钙离子维持在高水平,作用2hrs后胞浆钙离子浓度开始下降,4hrs和24hrs时的胞浆钙离子水平均低于对照(P<0.05),1μg/ml与10μg/ml酪丝亮肽对于BEL-7402细胞胞浆钙离子的影响有相同的变化趋势,相同剂量的药物对人正常肝细胞株Chang氏肝无明显影响;酪丝亮肽可影响BEL-7402细胞线粒体跨膜电位,药物作用1hr后线粒体跨膜电位无明显变化,作用2hrs后膜电位开始下降,作用4hrs和24hrs时的线粒体跨膜电位明显低于对照(P<0.05);10μg/ml酪丝亮肽作用24hrs对BEL-7402细胞Ca~(2+)-Mg~(2+)ATP酶活力无明显影响。 酪丝亮肽在体内对裸鼠人肝癌BEL-7402移植瘤细胞有较明显的促凋亡作
姚智[2]2006年在《酪丝亮肽抗肿瘤作用及其机理的研究》文中研究指明酪丝亮肽可以明显延长腹水型肝癌H22小鼠生存时间,可以显着抑制人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤的生长。组成酪丝亮肽的叁种氨基酸(酪氨酸、丝氨酸、亮氨酸)同比例混合物不能抑制裸鼠人肝癌BEL-7402移植瘤的生长,酪丝亮肽的抗肿瘤作用机制与其小分子多肽结构有关。酪丝亮肽对于化疗药物阿霉素在治疗人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤上,具有增效减毒作用。光镜及电镜显示出酪丝亮肽对肿瘤细胞细胞核及细胞器的损害,以及肿瘤细胞的凋亡与坏死。基因芯片分析结果表明,酪丝亮肽能够影响一系列肿瘤细胞增殖相关基因、信号转导相关基因,呼吸链相关基因以及癌基因/抑癌基因的表达。同时电镜结果显示:酪丝亮肽治疗组裸鼠人肝癌BEL-7402移植瘤肿瘤细胞内质网池内有钙过载现象发生;癌细胞出现凋亡与坏死现象。进一步研究发现酪丝亮肽能够降低BEL-7402细胞线粒体膜电位,抑制线粒体呼吸链相关基因NDUFA2、NDUFA10,NDUFS1,SUCLG1 mRNA的表达,损伤肿瘤细胞线粒体。酪丝亮肽可以明显提高肿瘤细胞胞浆内游离Ca2+浓度,抑制钙稳态调节基因Calreticulin mRNA和蛋白的表达,从而影响肿瘤细胞的钙稳态;可使BEL-7402移植瘤肿瘤组织中发生钙过载、细胞膜、细胞器损害,肿瘤细胞凋亡与坏死。酪丝亮肽可使人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤细胞S期比例明显下降,G0/G1比例明显上升,细胞凋亡指数明显增加;酪丝亮肽可使肿瘤组织中细胞凋亡细胞明显增多,增殖细胞明显减少。对于肿瘤增殖相关基因,酪丝亮肽能够增加肿瘤组织中抑癌基因PTEN、P21、P27 mRNA与蛋白的表达,抑制癌基因AKT的表达。
傅正, 陆融, 李国立, 赵岚, 高卫真[3]2005年在《酪丝亮肽对人肝癌BEL-7402细胞钙稳态影响的实验研究》文中认为目前寻找有效的药物仍是治疗肿瘤的关键环节之一.酪丝亮肽为中国新近研发并具有自主知识产权的叁肽化合物.观察了酪丝亮肽的抗肝癌作用,并研究了其对肿瘤细胞钙稳态的影响,以初步探讨它的抗肿瘤作用机制.结果发现,酪丝亮肽能显着抑制人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤的生长,160μg/(kg·d)治疗组肿瘤生长抑制率可达41.34%,电子显微镜观察发现酪丝亮肽可引起移植瘤细胞的坏死和凋亡,细胞器线粒体和内质网损伤,并出现钙沉积.应用激光扫描共聚焦显微镜及流式细胞仪观察发现,10μg/mL酪丝亮肽在400s内可引起体外培养BEL-7402细胞胞浆钙离子浓度迅速升高,最高幅度可达239.13%;持续作用1h后BEL-7402胞浆钙离子维持在高水平,作用2h后胞浆钙离子浓度开始下降,4和24h时的胞浆钙离子水平均低于对照,相同剂量的药物对人正常肝细胞株Chang氏肝无明显影响;酪丝亮肽还可使体外培养的BEL-7402细胞线粒体跨膜电位明显下降,提示其抗肝癌机制可能是通过影响肿瘤细胞的钙稳态,诱导其发生坏死或凋亡.
傅正[4]2007年在《酪丝亮肽对肝癌的治疗作用及影响肿瘤细胞信号传导的机理研究》文中研究说明目的：研究叁肽化合物酪丝亮肽(YSL)在体内外的抗肝癌作用，并初步探讨其损伤肿瘤细胞线粒体，抑制其增殖和诱导死亡的机制。方法：1．以人肝癌细胞株BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B、HepG2、SK-HEP-1和人正常肝细胞株Chang氏肝、HL7702为研究对象，应用MTS法和中空纤维测定法观察YSL在体内外对肝癌细胞和正常肝细胞增殖的影响；建立裸鼠移植瘤模型，观察YSL对BEL-7402肿瘤生长的抑制作用，并以透射电镜观察YSL对裸鼠移植瘤肿瘤细胞超微结构的影响。2．应用流式细胞术观察YSL体外对人肝癌BEL-7402细胞周期的影响；并以流式细胞术、DNA Ladder检测和Nucleosome ELISA的方法观察YSL体外对人肝癌BEL-7402细胞的诱导凋亡作用。3．应用基因芯片技术分析YSL对人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤肿瘤细胞基因表达谱的影响。4．以流式细胞仪和荧光检测仪观察YSL体外对人肝癌BEL-7402细胞线粒体通透性转变孔开放，线粒体膜电位和细胞内钙离子浓度的影响。5．应用Western Blot方法，观察YSL体外对人肝癌BEL-7402细胞线粒体凋亡抑制因子Bcl-2和Bcl-X_L蛋白表达的影响；分离肿瘤细胞的胞浆组分，观察YSL对BEL-7402细胞线粒体释放促凋亡物质细胞色素C和激活半胱天冬酶Caspase-3的影响；观察YSL对肿瘤细胞钙稳态调节蛋白钙网蛋白(Calreticulin)和内质网凋亡通路的Capase-12蛋白表达的影响6．应用实时荧光定量PCR和Western Blot方法观察，观察YSL体外对人肝癌BEL-7402细胞PI3K信号通路调节和效应因子PTEN、Akt、PDK1、P21、P27、PDK1、MDM2、P53和Bad的mRNA和蛋白表达，以及磷酸化修饰的影响。结果：1．YSL在体外(0.4～3.2mg／ml)和体内(320～640μg／kg╱d)均能够明显抑制前述五种人肝癌细胞株的增殖(P＜0.05)，但对正常人肝细胞株HL7702和Chang氏肝则没有明显影响(P＞0.05)；组成酪丝亮肽叁种氨基酸等摩尔比混合物对肿瘤细胞的增殖没有抑制作用，YSL的抗肿瘤作用机制与其小分子多肽的结构有关；YSL(320μg／kg／d、640μg／kg╱d)能够明显抑制人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤的生长(P＜0.05)，肿瘤生长抑制率分别为40.04％和52.85％。超微结构研究发现，YSL可引起肿瘤细胞的染色质溶解，线粒体肿胀，溶解，内质网扩张，细胞出现坏死和凋亡。2．基因芯片分析结果显示YSL可以抑制肿瘤细胞线粒体呼吸链功能相关基因表达，影响钙稳态调节基因以及与肿瘤细胞增殖相关基因的表达，影响肿瘤细胞的信号转导通路基因，还可调节与药物代谢相关基因、癌基因／抑癌基因的表达。3．YSL(0.8，1.6mg／ml)能够在体外阻抑人肝癌BEL-7402细胞的细胞周期，使G_0／G_1期细胞百分比明显增高，S期百分比明显降低(P＜0.05)；能够使凋亡细胞数明显增多，增加肿瘤细胞凋亡核小体DNA的产生数量，形成明显的DNA Ladder。4．YSL(0.8，1.6mg╱ml)能够在体外激活BEL-7402细胞线粒体通透性转变孔的开放，降低线粒体膜电位，影响线粒体膜的通透性，增加肿瘤细胞中的钙离子浓度。5．YSL能够在体外抑制BEL-7402细胞中抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-X_L的蛋白表达，诱导线粒体释放促凋亡物质细胞色素C，增加活化Caspase-3的数量；YSL能够增加BEL-7402细胞中内质网钙稳态调节蛋白Calreticulin和内质网凋亡通路的Capase-12的蛋白表达。6．YSL能够上调肿瘤细胞中抑癌基因PTEN的表达和活性，抑制癌基因Akt的表达和活性，以及Akt相关蛋白激酶PDK1的活性。并籍此影响Akt通路的下游事件达到抗肿瘤效应：增加P21、P27的表达阻抑细胞周期，抑制肿瘤增殖；通过使癌基因MDM2蛋白产物失活，稳定抑癌因子P53的数量，促进肿瘤死亡；解除对促凋亡因子Bad的磷酸化抑制，损伤肿瘤细胞线粒体，诱导肿瘤凋亡。结论：YSL能够在体内外明显抑制肝癌细胞的增殖，阻抑肿瘤细胞的细胞周期，诱导凋亡和坏死，而对正常肝细胞无明显影响。其作用机制可能是通过损伤肿瘤细胞线粒体膜，激活MPTP孔开放，降低线粒体膜电位，进而影响线粒体膜通透性，使线粒体中的钙离子，细胞色素C等促凋亡物质释放到胞浆中，激活线粒体凋亡途径和内质网应激凋亡反应，诱导肿瘤细胞凋亡。同时使肿瘤细胞PI3K信号转导途径内抑癌基因表达增加，癌基因表达下降，达到抗肿瘤细胞效应。
参考文献：
[1]. 酪丝亮肽抗肝癌作用及对肿瘤细胞内钙稳态影响机制的研究[D]. 付正. 天津医科大学. 2004
[2]. 酪丝亮肽抗肿瘤作用及其机理的研究[D]. 姚智. 天津大学. 2006
[3]. 酪丝亮肽对人肝癌BEL-7402细胞钙稳态影响的实验研究[J]. 傅正, 陆融, 李国立, 赵岚, 高卫真. 中国科学C辑:生命科学. 2005
[4]. 酪丝亮肽对肝癌的治疗作用及影响肿瘤细胞信号传导的机理研究[D]. 傅正. 天津医科大学. 2007