（广东三九脑科医院神经内一科 广东 广州 510510）
【摘 要】目的：探讨蛋白酶体功能障碍对散发性帕金森疾病的发病机制研究。方法：将蛋白酶抑制剂注入大鼠的左侧黑质致密部位，构建蛋白酶体功能障碍模型作为观察组，对照组采用生理盐水注射，观察两组大鼠的行为学改变情况，通过HE染色检测路易（小）体形成率，RT-PCR、Western blotting分子生物学方法检测黑质部位α-突触核蛋白（α-Syn）表达情况。结果：HE染色结果均显示路易（小）体形成率观察组高于对照组，两组间相比具有统计学差异（P＜0.05）；RT-PCR、Western blotting分子生物学检测结果显示α-突触核蛋白观察组显著高于对照组，两组间相比具有统计学差异（P＜0.05）。结论：蛋白酶体功能障碍可以导致路易（小）体形成率及黑质部位α-突触核蛋白（α-Syn）形成是散发性帕金森疾病的危险因素。
【关键词】路易（小）体形成率；α-突触核蛋白（α-Syn）；散发性帕金森；发病机制
【中图分类号】R742 【文献标识码】A 【文章编号】1004-6194（2015）02-0330-02
To investigate the impact of proteasome dysfunction in sporadic Parkinson's disease pathogenesis
【Abstract】Objective: To investigate the proteasome dysfunction in the study of the pathogenesis of sporadic Parkinson's disease. Methods: Protease inhibitor injection site in substantia nigra of rat left the building proteasome dysfunction model as the observation group, the control group with saline injection, observe the behavior of the two groups of rats changes the situation, by HE staining Louis (small) formation rate, RT-PCR, Western blotting molecular biology methods to detect the substantia nigra α- synuclein (α-Syn) expression. Results: HE staining showed Louis (small) formation rate were higher, compared with the significant difference between the two groups (P <0.05); RT-PCR, Western blotting molecular biology test results show that α- synuclein observation group were significantly higher compared with the significant difference between the two groups (P <0.05). Conclusion: The proteasome dysfunction can lead Louis (small) formation rate and the substantia nigra α- synuclein (α-Syn) is a risk factor for sporadic form of Parkinson's disease.
【Keywords】Louis (small) formation rate; α- synuclein (α-Syn); sporadic Parkinson; Pathogenesis
原发性帕金森是一种慢性的神经系统疾病，是一种中老年的常见性疾病，临床上主要表现为震颤、肌肉强直、运动迟缓等，主要的病理特征是出现黑质的致密部位多巴胺能神经元的选择性丧失，出现残存路易小体，该病包括帕金森病痴呆和路易体痴呆，其中90%的患者呈现散在发生，即散发性的帕金森[1]。目前该病主要的治疗方法包括药物及外科手术治疗，但是都只是针对病症，并不能阻止疾病的进程，该病的致残率相当高。该病的病机尚未完全明确，与遗传及环境因素有关，研究发现蛋白纤维化是散发性帕金森导致神经元死亡的重要原因[2]。在疾病形成的过程中α-突触核蛋白是与该病最为密切的相关蛋白，具有一定的神经毒性，同时受到脂肪酸的作用，在蛋白酶体功能障碍时会发生结构和构象变化，泛素-蛋白酶体系是细胞蛋白的重要系统，可以参与降解蛋白质和氧化蛋白质[3]。帕金森患者中黑质致密部位氧化损伤的蛋白质表达升高。多项研究都表明蛋白酶体可诱导神经细胞凋亡，同时促进胞质内泛素/α-共核蛋白免疫反应阳性包涵体形成[4]。提示蛋白酶体障碍对神经系统发病起着重要作用，本研究通过探讨蛋白酶体功能障碍对散发性帕金森疾病发病机制的影响效果，以期为其在散发性帕金森发病机制提供依据，现报道如下。
1 材料和方法
1.1主要试剂、细胞与仪器
广东动物实验中心的Wistar大鼠100只雄性作为本研究对象，体重在250-300g，逆转录试剂盒（MBI公司，美国），辣根过氧化物酶（horseradish peroxidas，HRP）标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗小鼠IgG（碧云天生物技术有限公司），Goat anti-rabbit Ig GHRP，Goat anti-mouse IgG-HRP，α-Syn rabbit polyclonal IgG和β-actin(C4)mouse monoclonal IgG1（购自美国Santa Cruz Biotechnology公司），避光4℃保存。半干式转移和电泳仪（购自美国BIO-RAD公司）。倒置相差显微镜(OLYMPUS，日本)、全能型高性能台式冷冻离心机(Heaeus，BiofugeStratos德国)、深低温冰箱(SANYO，AltraLow日本)、实时定量荧光PCR仪(Rotor-gene3000，澳大利亚)。
1.2实验方法
观察组的大鼠50只腹腔注射戊巴比妥钠25g/l进行麻醉，利用立体定向仪（Queue systems TM2711美国），切开大脑的脑颅部，暴露出颅骨，在坐标骨膜下完成钻孔ML=3.2 mm、AP=－5.2 mm、DV=7.2 mm，将Lactacystin10μg以速度每分钟0.5μL注射至大鼠右侧黑质中，留针10 min可进行缓慢退针；对照组大鼠50只进行同样的麻醉和定位，待钻孔完成将生理盐水以每分钟0.5μL的速度注入到大鼠右侧黑质中，留针10 min可进行缓慢退针。继续喂养大鼠21 d，将40 g/L多聚甲醛从左心室灌注固定，将大鼠断头取脑，将侧黑质分离，并在冰上进行组织匀浆器充分匀浆，之后将其转移至EP管中，以每分钟14000转进行离心30 min，取上清液移至新EP管保存，使用前经BCA法测定蛋白浓度。
1.3 HE染色
采用SP检测法，切片脱蜡，加入3%过氧化氢封闭阻断内源性过氧化物酶，50μl非免疫动物血清封闭，加HE染色剂，中性树胶固封。
结果判定：阳性细胞为细胞胞浆胞膜在倒置显微镜下出现深棕黄色的染色。
1.4 RT-PCR（半定量逆转录聚合酶链反应）方法
取组织100mg，提取总RNA。取2μg总RNA行逆转录cDNA，反应体系为20μl。吸取逆转录产物2μl，分别加入18sRNA、α-Syn的引物进行PCR反应。反应条件均为95℃预变性5mins，94℃变性30s，60℃30s，72℃60s，72℃7mins，循环30次。PCR产物溴化乙锭1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统下进行观察并拍摄电泳图像。以18sRNA作为内参照，进行PCR产物的半定量分析，测量各电泳条带之吸光度积分值（A值）。
1.5 Western blotting方法
取组织提取100mg总蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳，半干法转膜，加α-Syn一抗（1：500），4℃孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1：1000）37℃孵育1h。ECL光化学法显色，用彩色图像分析系统测定吸光度。
1.6统计学方法
采用spss20.0统计软件分析。正态分布资料采用（±s）表示，非正态分布资料采用中位数和四分位数间距表示。遵循正态分布而且方差齐性，两两比较采用LSD检验。α-Syn mRNA和α-Syn蛋白的表达的比较采用非参数检验，两两比较采用Mann-whitney U检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1路易（小）体形成的情况
HE染色结果均显示路易（小）体形成率观察组高于对照组，两组间相比具有统计学差异（P＜0.05），见表1。
注：与对照组相比，①P<0.05；与治疗前比较，②P<0.05
2.2 α-Syn mRNA表达的影响比较
RT-PCR检测结果显示α-突触核蛋白观察组显著高于对照组，两组间相比具有统计学差异（P＜0.05），见表2。
3 讨论
帕金森是临床上的常见神经退行性疾病，是以选择性的中脑黑质致密部位的多巴胺能神经元丢失和退化相关，主要特征是中枢神经系统的变性[5]。最新的研究发现蛋白酶体受到抑制可以导致神经细胞的死亡，形成胞质的泛素-α-共核蛋白免疫反应包涵体，使神经元退变，伴随着黑质致密部位多巴胺的丧失，出现神经元的损伤，本研究发现蛋白酶体受损之后，多巴胺能神经元会使蛋白酶抑制剂敏感性提高，个别神经细胞出现凋亡，通过选择性损伤的机制促使神经细胞的氧自由基的增多，需要蛋白酶体来清除这些受损的蛋白[6-8]。蛋白酶体抑制剂选择性损害多巴胺能神经元可能与α-共核蛋白削弱了突触囊泡对多巴胺的储存，从而进一步增加了胞浆内多巴胺及氧自由基，进而导致细胞氧化受损[9]。黑质致密部的多巴胺能神经元的路易（小）体是诊断帕金森病的重要依据，也是帕金森病主要病理特征，有研究发现大部分散发性帕金森病具有明显的路易（小）体形成，而染色体隐性遗传患者并无明显路易（小）体形成，提示路易（小）体形成情况利于提高家族型和散发性帕金森病的检出率[10,11]。
目前临床尚未明确α- 突触核蛋白在正常功能，在多数散发性帕金森病病例中未发现其基因突变，提示 α-Syn 可能在散发性帕金森病发病中起着重要作用。泛素蛋白酶体系统是α-Syn 的主要降解途径，如果发生障碍则会导致α-Syn 聚集，从而诱发散发性帕金森病的发病[12]。研究发现蛋白酶体成为影响细胞功能的重要药物靶点，该靶点的抑制剂在临床研究中被广泛应用，α-共核蛋白的生理功能尚不清楚，同时散发性帕金森患者的黑质致密部内α－共核蛋白量增多[13,14]。通过多种翻译后修饰形式，引起黑质多巴胺能神经元死亡，中脑黑质内多种细胞、生化及分子改变已被发现，散发性帕金森患者蛋白酶体α亚单位丢失，蛋白酶体活化因子表达下降，水解功能减弱[15]。大量的研究表明在帕金森病发病机制中蛋白酶体功能下降起重要作用，参与了黑质的神经元内蛋白质聚集及神经元变性[16]。本研究结果显示，HE染色结果均显示路易（小）体形成率观察组高于对照组，两组间相比具有统计学差异；RT-PCR、Western blotting分子生物学检测结果显示α-突触核蛋白观察组显著高于对照组，两组间相比具有统计学差异。蛋白酶体功能障碍可以导致路易（小）体形成率及黑质部位α-突触核蛋白（α-Syn）形成是散发性帕金森疾病的危险因素。蛋白酶体功能不能得到恢复，可以降解的氧化受损的蛋白质，从而降低了蛋白酶体的清除能力，同时氧化受损的蛋白集聚增多，从而造成恶性循环，导致神经元死亡[17]。
综上所述，蛋白酶体功能障碍可导致α-Syn 聚集及路易（小）体形成，是发生散发性帕金森病的重要危险因素，蛋白酶体功能下降可引起多巴胺能神经元内α-共核蛋白聚集导致细胞功能的紊乱，最终促进了多巴胺能神经元的凋亡，应引起相关医护工作者在临床中的高度重视。
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*通讯作者：
卢健军
论文作者:卢健军*,陈文明,王玉周,胡琼力,李志刚,罗旌攀
论文发表刊物:《中国慢性病预防与控制》2015年8月第2期供稿
论文发表时间:2016/3/22
标签：蛋白酶论文; 路易论文; 核蛋白论文; 帕金森论文; 神经元论文; 突触论文; 多巴胺论文; 《中国慢性病预防与控制》2015年8月第2期供稿论文;