冯 林
泸州医学院附属医院血液科 四川泸州 646000
【摘 要】目的：研究沙利度胺对于M7细胞（巨核细胞白血病细胞）的作用。方法：用Sigma公司生产的沙利度胺原料药。以0.1%DMSO（二甲基亚砜）为阴性对照组，以M7细胞为空白组，以不同浓度的沙利度胺作用于M7细胞，用CCK-8方法（细胞计数试剂盒方法）观察不同浓度不同时间沙利度胺对于M7细胞的增值抑制作用；以不同浓度沙利度胺分别作用M7细胞24h, 48h, 72h后，用ELISA方法检测上清液中VEGF（血管内皮生长因子）的浓度；以不同浓度沙利度胺分别作用M7细胞24h, 48h, 72h后，经HE及DAPI（二脒基苯基吲哚）染色后，用光学显微镜及荧光显微镜观察M7细胞形态变化，并应用统计学分析实验结果。结果：沙利度胺可明显抑制M7细胞分泌VEGF，并且抑制作用随着沙利度胺浓度及作用时间而增强；在CCK-8实验中，各组M7细胞与空白组相比，发现沙利度胺对M7细胞无明显抑制作用；光学显微镜观察不同时间段不同组，各组M7细胞与空白组相比较，细胞生长较好，呈圆形，细胞核大，核膜清晰。荧光显微镜下，未见明显凋亡小体。结论：1.沙利度胺能够明显抑制M7细胞分泌VEGF，并且呈时间浓度依赖性。2.沙利度胺对于M7细胞没有明显抗增殖效应及诱导其凋亡的作用。
【关键词】沙利度胺；VEGF；M7细胞; 凋亡小体；DAPI染色
【中图分类号】R52.5 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999（2015）9-0566-02
【Abstract】Objective：To research on the impact of thalidomide on M7 cell line. Methods：Thalidomide used as crude drug was bought from Sigma company. Take 0.1%DMSO as the negetive control group, and M7 cells as blank group, to treat M7 cell with thalidomide of different concentration and check the proliferative inhibition rate of M7 cell by CCK-8; to treat M7 cell with thalidomide of different concentration for 24hr ,48hr and 72hr respectively and check the VEGF concentration of supernatant by Elisa; to treat M7 cell with thalidomide of different concentration for 24hr ,48hr and 72hr respectively and check the forms and apoptotic state of M7 cells by light microscope and fluorescent microscope and analyze the experiment results by statistics. Results：Thalidomide can remarkablely inhibit the VEGF secreted by M7 cell and the inhibition increases as the time and concentration go by. In CCK-8 test, to compare each subject group with blank group, we find thalidomide has no remarkable inhibitory action on M7 cell. To compare each subject group of different times with blank group by light microscope and fluorescent microscope, we find cells grow well with round shape, large nucleus and limpid nuclear membrane with HE staining and there is no apparente apoptotic body with DAPI staining. Discussion：1.Thalidomide can remarkablely inhibit VEGF secretion by M7 cell, and the inhibition is time and concentration dependent. 2.Thalidomide has no notable anti-proliferative and apoptosis-induced effects on M7 cell.
【Key words】Thalidomide VEGF M7 cell Apoptitic body DAPI staining
急性巨核细胞白血病（acute megakaryocytic leukemia, AMKL）是一类较少见的白血病。该病是巨核系细胞恶性增殖所致，具有一般急性白血病的临床表现，主要有贫血、出血、感染、骨痛等症状，常见于3岁以内的幼儿和成年人。特发性血小板减少性紫癜（ITP），是一种获得性自身免疫性疾病，其发病机制目前认为是体液免疫功能障碍是主要致病原因，其中包括抗原递呈细胞、T细胞、和B细胞之间的相互作用，其体液免疫、细胞免疫、和血小板功能的异常已被公认。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取人成巨核细胞白血病株（Meg-01，即M7细胞株）为此次实验的细胞株，该细胞株购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。
1.2 方法 M7细胞株培养后，用CCK-8实验测定沙利度胺对M7细胞株抑制作用（用酶联免疫检测仪于450nm波长测定吸光度值（A值），细胞增殖抑制率（%）=（1- ）×100%），在450nm测定，按以上公式计算抑制率）；HE及DAPI染色观察细胞生长及凋亡情况；ELISA实验检测细胞上清液VEGF浓度，根据所测得的吸光度OD450值，将不同浓度的标准品按照OD450值绘制与OD450值关系曲线，根据标本的OD值，在曲线上查找相应的VEGF浓度。
1.3 统计学处理 数据使用SPSS13.0统计软件包进行统计分析。实验数据计算均值、标准差，各组应用方差分析，以a=0.05为检验水准，P<0.05被认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 沙利度胺能明显抑制M7细胞分泌VEGF。在ELISA方法试验中，检测不同浓度沙利度胺对M7细胞分泌VEGF的影响作用，发现不同浓度沙利度胺对于M7细胞分泌VEGF均有明显抑制作用，且呈时间浓度依赖性。0.1%DMSO组对M7细胞分泌VEGF无明显抑制作用（表1、2、3、4）。
2.2 M7细胞经HE及DAPI染色后，光学显微镜及荧光显微镜下观察。不同浓度沙利度胺对不同时间段各组M7细胞形态学改变无明显影响及无明显诱导凋亡的作用，且各组未见明显凋亡小体（图4、5、6）。（注：“A、B” 分别代表50ug/ml、25ug/ml浓度沙利度胺，“DMSO”代表DMSO组，“空” 代表空白组； 数字“1” 、“2”、“3” 代表24hr,48hr及72hr三个时间段。 例： A1表示“24hr时间段50ug/ml沙利度胺组”）
24hr各实验组M7细胞光镜下图片
72hr各实验组M7细胞光镜下图片
2.3 CCK-8法检测沙利度胺对M7细胞增值抑制作用。各实验组（24hr,48hr及72hr）CCK-8结果与空白组（24hr,48hr及72hr）相比，A值差异无统计学意义（P>0.05）,沙利度胺对M7细胞无直接抑制作用（表4、5、6）。
3 讨论
急性白血病（acute leukemia）是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病。最近的研究发现[1]，实体肿瘤的生长、播散和转移依赖于血管新生，血液系统恶性肿瘤同实体肿瘤类似，可以见到骨髓微血管密度的增加，而这与VEGF的关系十分密切。白血病细胞的髓外浸润是常见的并发症,也是导致白血病患者复发和死亡的重要原因。白血病细胞的髓外浸润是一个多步骤、多因素参与的复杂过程,而血管新生是其中的关键环节。临床上髓外浸润常见于急性淋巴细胞白血病（ALL），Veiga[2]等研究ALL细胞上清液、ALL骨髓基质细胞上清液以及ALL骨髓中分离出的血浆，发现它们都可以诱导血管内皮细胞和骨髓内皮细胞的增生，从而证明了ALL细胞和基质细胞都分泌血管生成调节因子。提示这些血管生成调节因子可能与ALL的髓外浸润有着密切的关系。此外，血液及组织中高水平的VEGF值往往提示预后不良[3]。肿瘤的生长及侵袭有诸多因素，而VEGF及其受体是其中非常重要的一环，干扰VEGF旁分泌或自分泌途径可能是有效地靶点治疗策略。因此找到一种可以有效干扰VEGF分泌的药物则成为了靶点治疗的关键。
近年来，沙利度胺作为一种抑制血管新生的抗肿瘤药物，受到越来越多的关注。在D’Amato、Verheul等[4]试验中，还发现沙利度胺能通过抑制碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达，从而减少兔角膜血管的生成。大量试验已经证明沙利度胺可以抑制血管新生，在临床治疗中亦取得一些疗效，但沙利度胺抑制血管新生的作用机制不是完全清楚。抑制促血管生成因子可能是其主要作用，通过阻断刺激VEGF、bFGF等促血管生成因子增值的信号途径[5]，达到抑制血管新生的目的。因此本实验通过体外对M7细胞株施加沙利度胺的影响，研究该药物对急性巨核细胞白血病的作用。肿瘤的发生及肿瘤细胞的增加都伴有新生毛细血管的生成[6]。
综上所述，体外研究表明沙利度胺可能是通过抑制M7细胞VEGF的分泌达到抗血管新生的作用，发挥抗白血病细胞的治疗效应。其抗血管新生的作用具有浓度时间依赖性。但沙利度胺对M7细胞无明显增值抑制及诱导凋亡的作用，这与其他研究结果得出的结论相似[7-9]，沙利度胺抗肿瘤的作用是间接的，推测其主要通过抗血管新生达到抗肿瘤的目的。以上均为体外研究的启示，而动物及人体体内实验仍需进一步研究证明。
参考文献：
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论文作者:冯林
论文发表刊物:《中医学报》2015年9月第30卷供稿
论文发表时间:2015/10/21
标签：细胞论文; 抑制论文; 作用论文; 浓度论文; 血管论文; 白血病论文; 细胞株论文; 《中医学报》2015年9月第30卷供稿论文;