本文联系人：白淑芝，
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（1．哈尔滨医科大学病理生理学教研室，2．黑龙江省森工总医院，3．哈尔滨医科大学附属第二临床医院，黑龙江 哈尔滨 150001）
[摘要] 目的：观察钙敏感受体（CaSR）在糖尿病大鼠心肌组织中的表达变化。方法：30只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、糖尿病4周组和糖尿病8周组。高糖高脂饮食4周后腹腔注射STZ（30mg/kg）建立糖尿病模型。通过Western blot检测心肌组织CaSR和SERCA蛋白的表达。结果：与对照组相比，随着病程的延长糖尿病组大鼠心肌CaSR、SERCA蛋白表达降低。结论：在糖尿病大鼠心肌组织中CaSR的表达降低，并可能导致钙稳态紊乱参与糖尿病心肌病的发生。
[关键词] 钙敏感受体；糖尿病；大鼠
*【基金项目】 黑龙江省教育厅科技研究项目资助（12541276）
△【通讯作者】 Tel：0451–86674548；E-mail：baishuzhi12@163.com
Expression of calcium-sensing receptor of myocardium in diabetic rats
BAI Shu-zhi1△，WU Hao2，JIANG Xiao-shu1，WU Yu3
（1. Department of Pathophysiology, Harbin Medical University; 2. Heilongjiang Provincial Forestry General Hospital; 3. The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Heilongjiang Harbin 150001）
【ABSTRACT】 Objective: To observe the expression of calcium-sensing receptor (CaSR) of myocardium in type 2 diabetic rats. Methods: Wistar rats were randomly divided into 3 groups including control,diabetic-4 week and diabetic-8 week groups.Rats in the diabetes group were fed a high-glucose and high-fat diet, and intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ,30mg/kg) was conducted 4 weeks later to establish a type 2 diabetes model. CaSR and SERCA protein expressions in cardiac tissue were detected by Western blot. Results: Compared with the control group, the myocardium of diabetic rats showed decreased expression of CaSR and SERCA protein, and gradually worsened with the prolongation of the course of the disease. Conclusion: The expression of CaSR protein in myocardium of diabetic rats was decreased, which can cause intracellular calcium disorder and lead to diabetic myocardiopathy.
【KEY WORDS】 calcium-sensing receptor；diabetes；rat
糖尿病的发病率逐渐增高，且呈年轻化趋势。累及到心脏可发生糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM），造成心功能不全，甚至心力衰竭 [1]，其发病机制复杂，迄今尚未完全阐明。钙敏感受体（CaSR）属于G蛋白耦联受体，国内对其研究主要集中在慢性肾衰和甲状旁腺等疾病上，在心血管系统研究的较少[2]。本实验旨在观察实验性糖尿病大鼠不同时间点心肌组织CaSR蛋白表达的变化规律，拟进一步揭示DCM的发生机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康 Wistar 雄性大鼠(180-250g)，由哈尔滨医科大学附属二院动物研究所提供。
1.2 主要试剂和器材
AP（北京索莱宝）、AA、TEMED、分离胶浓缩液、浓缩胶浓缩液、电泳缓冲液、转移缓冲液（北京普利莱）；蛋白定量试剂盒（北京碧云天）；CaSR抗体(Alpha Diagnostic International Inc.,USA);SERCA、GAPDH多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, CA)；其他试剂为国产分析纯。BECKMAN 低温离心机，酶标仪( DG3022 A)，Western blot电泳槽（北京六一厂），V-86℃超低温冰箱日本SANYO公司等。
1.3 2型糖尿病模型的制备
30只雄性糖尿病大鼠，饲养在22-24℃、12h：12h昼夜循环的安静环境中。适应一周后，动物随机分为3组，每组各10只。对照组大鼠给予正常的饮食饮水。糖尿病组大鼠给喂养高糖高脂饮食（成分：20%糖，10猪油%，2%胆固醇，1%胆酸钠，67%基础饲料）。一个月后，大鼠禁食12h，糖尿病组通过腹腔注射低剂量佐链脲菌素( STZ, 30mg/kg)。三天后检测血糖高于16.7mmol/L为造模成功。观察大鼠一般状态，每周监测血糖、饮食、饮水量，直至实验结束。
1.4 实验分组
①正常对照组(Control)；②糖尿病4周组（Dia-4w）；③糖尿病8周组（Dia-8w）。
1.5 血糖测定
实验结束后，通过大鼠尾静脉采血，用血糖仪检测血糖。
1.6 Western blot 检测蛋白的表达
取各组大鼠心室肌组织，液氮研磨后加入组织裂解液，4℃ 裂解 1 小时，4℃，12000 g 离心 15 分钟,取上清进行蛋白质定量。取 50ug 总蛋白样品于 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 随后转印至 PVDF 膜, 用 5% 无脂肪牛奶封闭 1 小时后，分别用 CaSR 抗体（1:2000)、PLN（1:500）、SERCA（1:1000）、GAPDH（1:500）4℃ 震荡过夜。 再用二抗（1：1000 的羊抗兔 IgG 二抗；1：1000 的兔抗鼠 IgG 二抗，碱性磷酸酶标记）孵育，室温下振荡 1小时。显色，在凝胶成像系统下拍照、分析。计算各蛋白条带的光密度值，蛋白表达水平以其与内参 GAPDH 光密度比值来表示。
1.7 统计学处理
实验数据用均值 ± 标准差(±S)，至少进行3次独立重复试验。采用方差分析和配对 t 检验判断其差异显著性。全部数据统计采用 SPSS 17.0统计软件包进行。
2 结果
2.1大鼠一般状态
实验期间，正常对照组大鼠精神状态良好，反应敏捷。糖尿病组大鼠全部出现了大量饮水，饮食增多（表1），精神萎靡不振，反应迟钝。
2.2 各组大鼠血糖的测定
与正常对照组大鼠血糖相比，糖尿病4周组和8周组大鼠随机血糖显著升高（P<0.05）（表2）。
2.3 心肌组织CaSR表达的变化
与正常对照组相比，糖尿病组大鼠心肌组织CaSR表达量随病程延长逐渐降低（P<0.05），同时SERCA表达逐渐减少，说明钙泵的活性逐渐降低（表3）。
3 讨论
本实验通过复制大鼠DCM 动物模型，观察大鼠的一般状态及饮食、饮水情况，并检测糖尿病大鼠心肌组织不同时间点CaSR及相关钙调控蛋白的表达来探讨钙敏感受体在DCM发生中的作用。我们采用高糖高脂饮食联合小剂量STZ腹腔注射的方法复制来大鼠2型DCM 动物模型。与对照组大鼠相比，糖尿病4周组和糖尿病8周组大鼠都出现多食和多饮，血糖水平也明显升高。
DCM 的发生机制十分复杂，迄今尚不十分清楚。CaSR是G蛋白偶联受体，其在DCM大鼠心肌的表达规律，迄今鲜见报道。本文采用Western blot 方法检测了糖尿病大鼠4周和8周时心肌CaSR蛋白的表达，结果发现糖尿病大鼠心肌CaSR蛋白的表达呈时间依赖性降低。Ward等用STZ复制的大鼠T1DM模型，2周后发现肾脏CaSR表达降低约50%[3]。由此可见，糖尿病或肥胖症大鼠其他器官同我们观察到的心肌一样，CaSR的表达也是降低的。
CaSR表达降低可造成细胞内钙的紊乱。目前认为，DCM与慢性心力衰竭一样，伴有Ca2+ 调控蛋白表达及活性异常[4]。SERCA是心肌细胞 Ca2+ 处理的重要蛋白[5]。本研究发现，2型糖尿病大鼠4周和8周心肌组织 SERCA表达减少，可引起SR摄取Ca2+能力下降，直接导致心肌细胞钙稳态紊乱从而造成心脏功能异常。以上研究表明2型糖尿病大鼠心肌组织CaSR表达呈时间依赖性降低，可引起钙稳态紊乱，造成心肌的进一步损伤，具体机制有待于进一步研究。
【参考文献】
[1] Qi K, Zhong J. LncRNA HOTAIR improvesdiabetic cardiomyopathyby increasing viability of cardiomyocytes through activation of the PI3K/Akt pathway[J]. Exp Ther Med. 2018,16(6):4817-4823.
[2] 徐长庆，张伟华. 心血管系统钙敏感受体的研究进展[J]. 中国病理生理杂志，2010，26（2）：409-413.
[3] Weston AH, Absi M, Harno E, et al. The expression and function of Ca2+-sensing receptors in rat mesenteric artery; comparative studies using a model of type II diabetes[J]. Br J Pharmacol. 2008，154(3)：652-662.
[4] Hamilton S, Terentyev D. Proarrhythmic Remodeling ofCalciumHomeostasisin Cardiac Disease; Implications for Diabetes and Obesity[J]. Front Physiol. 2018,9:1517-1526.
[5] Sims MW Pollak AJ, Liu C, Gudlur A, et al. A secretory pathway kinase regulates sarcoplasmic reticulum Ca2+homeostasisand protects againstheartfailure[J]. Elife. 2018,7: e41378-41400.
论文作者:白淑芝1△，吴昊2，姜哓姝1，吴昱3
论文发表刊物:《世界复合医学》2018年第12期
论文发表时间:2019/2/26
标签：大鼠论文; 糖尿病论文; 心肌论文; 蛋白论文; 受体论文; 组织论文; 血糖论文; 《世界复合医学》2018年第12期论文;