潘习龙[1]2000年在《清毒饮和养正片对白血病细胞凋亡的作用及其机理研究》文中指出急性白血病属于中医虚劳、血证、温病等范畴，其发病原因为精气内虚、温热毒邪炽盛，发病机理不外乎邪毒内蕴、正气虚弱、血行瘀滞、痰邪凝滞，临床采用辨证和辩病的方法，给予扶正、解毒、化瘀及砷剂等治疗。 导师组根据多年的工作经验，认为急性白血病的本质为正虚邪盛，正虚邪盛贯穿于白血病的全过程，治疗上应清热解毒、凉血止血、活血化瘀、化痰散结与补气养血、滋阴填精兼顾，在中医理论指导下，拟定了治疗急性白血病的两个复方清毒钦和养正片，清毒饮以清热解毒、凉血止血、活血化瘀、化痰散结的药物组成，养正片以益气养血、滋阴填精的药物组成，清毒饮中大部分药物具有抗肿瘤作用，即细胞毒作用，养正片以改善机体免疫功能的药物为主组成，通过改善机体的免疫功能而起到间接抗肿瘤的目的。根据中医辨证用于急性白血病的不同证型，可与化疗同时应用，起到增效减毒的作用，也可单独应用于化疗间歇期或不适宜化疗者，经临床观察证实有较好的疗效，以往的实验研究也证实清毒饮和养正片可延长荷瘤小鼠生存期，改善小鼠免疫功能，提高IL-2、IL-6、TNF-α活性及其mRNA表达。 细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制。机体通过细胞凋亡消除损伤、衰老与突变的细胞，维持生理平衡，当组织细胞凋亡异常时，可导致各种疾病的发生。目前，国内外对细胞凋亡的基础研究及其在疾病诊疗 －2．中的应用研究，正越来越受到医学界的重视。 细胞凋亡在白血病的发生发展中起重要作用，白血病细胞的凋亡是减少的，而细胞凋亡是由基因编程控制的，Be12、P53、Fas等癌基因与白血病细胞凋亡有较密切关系。诱导凋亡是白血病治疗的一个重要途经，某些中药可能具有诱导凋亡的作用，其作用机制是目前研究的一个热点。 我们采用L72 12白血病小鼠模型，用原位末端标记法（TUNEL）观察清毒饮、养正片及化疗对 L72的白血病细胞凋亡的影响，并同时观察了小鼠肝、脾指数的变化，结果发现清毒饮组、化疗组的肝、脾指数均较模型组有减小 （P＜0．05），清毒饮组优于养正片组，与化疗合用则肝脾指数减小更明显 叩刃），表明清毒饮、养正片有一定抗白血病作用，且与化疗合用有增效作用，TUNEL结果发现清毒饮组、养正片组、化疗组都可见较多凋亡阳性白血病细胞，清毒饮组优于养正片组，与化疗合用则更明显，凋亡指数均大于模型组（P（0．of），证明清毒饮、养正片具有诱导L7212的白血病细胞凋亡的作用，以清毒饮组较明显，且可以提高化疗的诱导凋亡作用。这或许是临床治疗白血病的机理所在。 用免疫组织化学方法检测小鼠L7212白血病骨髓有核细胞的BCL－2、P53、Fas的表达，结果显示 L72白血病细胞的 BCL－2蛋白表达明显增高，给予清毒饮、养正片处理后，BCL－2有所下降，以清毒饮组下降较养正片组明显，与化疗合用后下降更明显（P＜0．05）；L7212白血病有Fas表达减低，给予清毒饮、养正片、化疗处理后FAS有一定升高，清毒饮组亦较养正片组明显，清毒饮加化疗组则尤其明显（P＜0．oi），而 P53表达在 L7212白血病细胞稍减低，经清毒饮、养正片、化疗处理后，P53表达的阳性率及表达强度均有所升高，也以清毒饮组较明显，与化疗合用后升高更明显，但统计学处理差异无显著性意义（P＞0．05），酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测sEas显示与模型组比较，清毒饮组 SFas 明显降低（p＜0．05），养正片组则无明显变化：与空白组 －3－比较，清毒饮组则无明显变化，养正片组则明显升高…狈．05厂 以上表明清毒饮、养正片确能下调BCI。－2的表达水平，提高FAS的表达水平，而对P53作用不甚明显，清毒饮可使sEas的水平降低，养正片对sEas的作用较弱，这可能是清毒饮、养正片诱导细胞凋亡的机制所在。 总之，本研究表明清毒饮、养正片有诱导白血病细胞凋亡的作用，且清毒饮较养正片明显，清毒饮、养正片与化疗结合可以提高化疗的诱导凋亡作用，这也许是临床治疗自血病有较好疗效的原因之一，清毒饮、养正片通过下调BCLZ表达，提高FAS表达而诱导细胞凋亡，清毒饮、养正片对P53的影响尚不够明显。
杨洪涌[2]2006年在《清毒饮（片）和养正片联合化疗治疗急性白血病疗效及其分子机制的研究》文中研究指明急性白血病(AL)是严重危害人类健康和生命的重大疾病。上个世纪70年代以后,随着化疗策略逐渐完善,抗白血病新药的应用,造血干细胞移植技术的发展,免疫和基因疗法的使用,白血病的治疗有了巨大的进步。但是,欲真正明了其病因和发病机理,探求安全、高效而经济可行的防治方法,则仍然任重而道远。从祖国医药宝库里探求抗AL新药,仍具有重要的学术价值与经济价值。 据此,我院血证研究室从1991年至今,进行了中医药治疗白血病的临床和实验研究,本人作为主要研究人员之一,参与其中。在国家中医药管理局和广东省科委科研基金等的资助下,在自拟抗白血病中药Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号方治疗白血病取得较好疗效的基础上,我们制订了清毒饮和养正片两个中药复方,辨证用于AL化疗的不同阶段,取得良好效果;我们又进而利用AL动物模型和细胞株,开展了该二方抗AL疗效机理的研究,取得了一系列成果。但受限于病床数等原因,既往的观察病例数偏少;自2002年以后,我们在先前研究的基础上,为了便于患者服用和携带,进一步改良了清毒饮,并将其改为素片,即成为清毒片;并增加了观察样本,继续与养正片一道辨证应用于化疗的不同阶段,并取得了较满意的疗效。 研究目的 本研究旨在进一步观察中医药联合化疗治疗人类AL的增效减毒方案,并探讨其对人类白血病疗效的分子机制,为临床治疗AL提供安全、有效、廉价的更佳方案,并为将来开发抗AL中药新药打下基础。 研究方法与内容 本研究包括文献研究、临床研究与实验研究,在先前系列观察的基础上,进一步扩大临床观察样本,以观察中药清毒饮(片)和养正片联合化疗治疗AL近、中、远期增效减毒作用,并直接观察服用该二方后AL病人体内药物作用的分子机制。 文献研究:总结分析了近年来,特别是近5年来国内外AL中西医研究领域的一系列进展,并提出存在问题和可能的解决方案。 临床研究:1994年2月-2005年12月选取137例AL患者,随机分为中西医联合治疗组和单纯化疗组。中西医联合治疗组92例,再按中医辨证分为两组,治以辨证分期、序贯服用清毒饮(片)和养正片并联合化疗;与单纯化疗组45例作组间和自身前后比较,从临床疗效、提高生存质量、降低症候积分等进行分析;并比较了清毒片和清毒饮、中西医联合疗法对AL不同亚型的疗效差异。 实验研究:选取AL患者作为研究对象,采用自身前后对照,抽取化疗前患者用清毒饮和养正片治疗前、后的骨髓液,运用免疫细胞化学染色和原位杂交法检测观察了中药对其Bcl-2、p~(53)、Fas及其mRNA表达影响。
杨洪涌, 丘和明, 陈志雄, 胡莉文, 李振波[3]2002年在《清毒饮和养正片对L_(7212)白血病小鼠Fas基因及其可溶性受体的影响》文中认为[目的]探讨复方中药清毒饮和养正片抗急性白血病的疗效机理。[方法]采用L7212白血病小鼠模型,用原位末端标记法(TUNEL)观察清毒饮(由七叶一枝花、白花蛇舌草、大青叶、山慈菇等组成)、养正片(由黄芪、人参、补骨脂、赤灵芝、三七片等组成)和足叶乙甙(VP16)化疗对L7212的白血病细胞凋亡的影响;用免疫组化法检测L7212白血病小鼠骨髓有核细胞的Fas基因表达;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测可溶性Fas(sFas)。[结果]清毒饮组、养正片组、化疗组都可见较多凋亡阳性白血病细胞,清毒饮组优于养正片组,与化疗合用则更明显,凋亡指数均大于模型组(P<0.01);L7212白血病细胞Fas表达减低,给予清毒饮、养正片、化疗处理后Fas升高,清毒饮组亦较养正片组明显,清毒饮加化疗组则尤其明显(P<0.01);清毒饮组sFas较模型组明显降低(P<0.05),并接近正常空白组水平(P>0.05),养正片组则无明显变化。[结论]清毒饮、养正片能诱导L7212小鼠白血病细胞凋亡,并可促进化疗的诱导凋亡作用,以清毒饮尤为明显;清毒饮、养正片均能提高Fas的表达水平,清毒饮还可使L7212小鼠增高了的sFas水平降低。提示在急性白血病早期,采用祛邪攻毒中药可诱导其细胞凋亡并与化疗有协同作用;而此期采用扶正补虚中药则作用较差。
杨洪涌, 丘和明, 陈志雄, 胡莉文, 李振波[4]2002年在《清毒饮和养正片诱导L_(7212)小鼠白血病细胞凋亡及其对Bcl-2、P~(53)基因表达的影响》文中提出目的:探讨清毒饮和养正片抗白血病的作用机理。方法;采用L7212白血病小鼠模型,用原位末端标记法（TUNEL）观察清毒饮、养正片和化疗对其白血病细胞凋亡的影响。结果:清毒饮、养正片、化疗各组都可见较多白血病细胞凋亡。其中清毒饮组优于养正片组,合用化疗则更明显,凋亡指数均大于模型对照组（P<0.01）,证明清毒饮、养正片能诱导L7212白血病细胞凋亡,且以清毒饮较明显,并可提高化疗的促凋亡作用。用免疫组化法检测模型小鼠骨髓有核细胞中Bcl-2、P53基因的表达,其Bcl-2表达明显增高,予清毒饮、养正片处理后,Bcl-2有所下降,以清毒饮组较养正片组明显,合用化疗后下降更明显（P<0.05）;P53表达在L7212白血病细胞稍减低,经清毒饮、养正片、化疗处理后,表达阳性率及其强度均有所升高,但统计学处理差异无显著性意义（P>0.05）。结论:清毒饮、养正片确能下调Bcl-2表达,而对P53作用不够明显。
马月[5]2001年在《清毒饮、养正片配合化疗治疗急性白血病的序惯性用药方案的临床观察及诱导白血病细胞凋亡的机制》文中研究表明急性白血病（Acute leukemia，AL）是一种以骨髓和血中幼稚细胞急剧增生为特征的恶性肿瘤，属祖国医学“虚劳”、“热劳”、“急劳”、“百日痨”、“血证” 的范畴。现代医学治疗AL以联合化疗为基础，并认为细胞凋亡在AL的发生、发展中起重要作用，与bcl-2、c-myc、p53、Fas等基因密切相关，而化疗药物也通过诱导细胞凋亡发挥作用。研究表明中药配合化疗治疗AL能减轻化疗的毒副作用，增强化疗的疗效，延长缓解期，减少复发，其治疗急性白血病的机制是多方面、多环节的，也与诱导细胞凋亡有关。 我们认为AL的发病机理乃虚实夹杂，表现为脾肾亏虚、热毒炽盛、血瘀痰凝，并自拟清毒饮、养正片两个中药复方。清毒饮能清瘟败毒、凉血止血、活血化瘀，具有抑制白血病细胞的作用；养正片能够补益气血、补肾填精，减少骨髓抑制，促进骨髓正常造血功能的恢复。临床研究表明在化疗前应用清毒饮，化疗后应用养正片能对化疗起到增效减毒作用，改善白血病患者生存质量。二方能够改善荷瘤小鼠的免疫功能，诱生细胞因子（白细胞介素-2、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子）从而证明它们能作为生物反应调节剂应用于临床。清毒饮、养正片具有诱导L_(7212)白血病细胞凋亡的作用，可能是通过降低bcl-2蛋白表达促进白血病细胞的调亡，并且清毒饮能降低可溶性Fas水平，使白血病细胞膜表面的Fas能与FasL结合，从而介导调亡。在前人研究的基础上，为了更好的发挥中药的优势，我们又采用二方的序惯性用药方案配合化疗治疗AL，并在以下方面进行了初步探讨： 1．临床研究 采用历史对照，以广州中医药大学第一附属医院血液内科2000.1-2001.4住院病人为治疗组，以广州中医药大学第一附属医院血液内科1995.1-1999.12住院病人对照组。 治疗组用序惯性用药方案配合化疗治疗急性白血病，根据症状轻重积分，使辨证更加准确，把清毒饮、养正片的用量与辨证相结合；对照组在化疗前应用清毒饮，化疗后应用养正片。本研究对两组的疗效、毒副作用、化疗骨髓抑制及恢复情况进行了比较。治疗组9例，其中CR 7例，PR 1例，死亡1例，即CR率为77.8％，有效率为88.9％；对照组11例，其中CR 8例，PR 1例， 毕业论文死亡 2例，即 CR率为 72．7％，有效率为 sl．8％。治疗组 CR率、有效率均高于对照组，但差异无统计学意义。治疗组治疗后证候积分为 13．25LI．83，对照组治疗后证候积分为16．44士3刀5，两者有显著性差异（P＜o．05）。治疗组白细胞开始降低时间、白细胞达最低值时间均早于历史对照组（P＜o．05），化疗最低值低于历史组（＞＜o刀5），而白细胞恢复较历史组快（P＜o刀5）。由此可见，序，惯性疗法在疗效上同过去治疗方法相当，但在改善症状、增效减毒、改善生存质量方面具有明显的优越性，体现了白血病治疗的个体化，能够更好地发挥两个复方的作用。 对9个病人治疗前后癌基因表达的检测发现，9例病人皆有比－2的高表达、C－1llyC高表达、FCS蛋白降低，6例病人p53缺失，说明这些基因以不同方式参与白血病的发病。经治疗后bC12蛋白下调，FSS蛋白升高，治疗前后差异有枯考性（P＜0刀1人治疗后p53蛋白升高，卜m”下降，但治疗前后差别没有显著性意义u＞0刀5入推测我们的治疗不是通过直接抑制c－m弘的表达，而是旭过下调h毛的表达增加 c－myc的诱导细胞凋亡的作用。 ＊实验研究 采用血清药理学方法与流式细胞术相结合，观察清毒饮、养正片诱导人白血病M62细胞凋亡率及对细胞周期的作用。实验结果表明人白血病o62细胞存在自然凋亡，空白血清组无诱导细胞凋亡的作用，清毒饮组、清加养组、Ara．c组皆有诱导细胞凋亡作用，且都随时间延长凋亡率升高（P＜0刀 1），清毒饮组、清加养组各时段高剂量组细胞凋亡率皆高于低剂量组。各组中以Ara－c组凋亡率最高，清加养组72 ’J’时高浓度组诱导细胞凋亡率等于Ara－c中浓度组 （卜＞0刀5）。如果时问继续延长，清加养组诱导细胞凋亡的作用能否进一步提高有待研究。清毒饮组细胞周期发生改变，S期下降，GI PB升高，说明其诱导细胞凋亡的作用机制可能为抑制K562细胞S期DNA合成，干扰蛋臼质代谢，从而抑制肿瘤细胞分裂。
陈怡宏[6]2005年在《清毒片、养正片治疗急性白血病的临床及实验研究》文中研究表明急性白血病(Acute Leukemia,AL)是起源于造血系统干细胞的克隆性恶性疾病,目前国内外治疗AL最有效的治疗方法主要为联合化疗和骨髓移植,骨髓移植临床难于普及应用,故联合化疗为临床常规使用的最有效方法。化疗具有较严重的毒副作用,长期反复使用必然造成许多系统的损伤,生存质量差等问题,使病人难于耐受而化疗难于继续,是化疗失败的主要原因。发挥中医辨证施治的特点,辨证、辨病用药,以及充分利用中药毒副作用少的独特优势,开发应用,为此课题从文献、临床、实验三方面对清毒片、养正片减毒增加疗效作用进行探讨。 文献研究 祖国医学文献中“热劳”、“急劳”、“血证”、“湿毒”、“症瘕”的证候与白血病相似。如《普济方》提出“热劳”具有急性白血病的发热、骨痛、出汗、口腔发炎、消瘦的常有症状,所指的热劳,热毒攻注骨髓发热与肿瘤性的发热是一个特征。 多数中医学者临床施治是在明确疾病诊断的基础上进行化疗,结合中医辨证,四诊合参,辨证论治,临床分为气阴两虚,毒热炽盛、瘀血痰结三种证型为主临床治疗急性白血病通常分为化疗期、化疗间歇期、临床缓解期,各期治疗各有侧重。辨证辨病分期用药,是把中医辨证施治的精髓与现代医学对白血病的分期治疗有机地结合起来,是对白血病辨证施治的进一步深化。而常用单方单药的用药原则有清热解毒法,如以癌灵Ⅰ号治疗M_3型效果最为显着。中医药治疗急性白血病理论和实践依据充足,有一定的研究价值。 临床研究 目的:通过清毒片和养正片配合化疗治疗急性白血病的临床观察,就清毒片、养正片对急性白血病的治疗作用进行再评价,并探讨临床使用的安全性。 方法:选择合格AL患者22例,按简单随机方法分为两组:观察组(清毒片、养正片加化疗组)17例,对照组(单纯化疗组)5例,按常规化疗方案(ANLL用DA或MA或HAE方案,ALL用VDP方案)进行化疗,如出现感染、出血等情况,则按常规抗感染及止血治疗。同时根据不同中医证型辨证服用中药煎剂,每日1剂。口服清毒片每日3次,每次4至6片加养正片每日3次,每次4至6片,持续4周。观察对比患者治疗前及治疗四周后血分析、尿分析、骨髓象、肝肾功能、凝血四项等实验室检查项目,以及患者临床症状及体征积分情况。 结果:清毒片和养正片加化疗组17例治疗四周前后对比完全缓解4例,部分缓解11例,无缓解2例。单纯化疗组5例治疗四周后完全缓解1例,部分缓解2例,无缓解2例。清毒片和养正片加化疗组治疗后肝功能、肾功能、凝血四项、外周血象均较治疗前有明显改善,而本组患者临床症状有显着性效差P<0.05。 结论 1 以往诸家报道分析,中西医结合治疗急性白血病的临床疗效略高于单纯西药化疗组。
杨洪涌, 游江, 马月, 孙金芳, 刘安平[7]2003年在《清毒饮和养正片对急性白血病人Bcl—2、P~(53)、Fas基因及其mRNA表达的影响》文中指出目的:探讨清毒饮和养正片抗人类白血病的作用机理。方法:选取急性白血病初治或未缓解的病人以清毒饮和养正片治疗,采用免疫组化法检测治疗前后Bcl-2、P~(53)、Fas基因;用原位杂交法检测上述基因mRNA水平表达。结果:治疗后,患者Bcl-2基因及其mRNA水平表达下调,Fas基因及其mRNA水平表达上调,P~(53)mRNA水平表达下调。治疗前后比较,差异有显著或非常显著性意义(P<0.05～<0.01);P5~(53)基因似略有上调,但差异无显著性意义(P>0.05)。结论:清毒饮和养正片通过以上作用可介导白血病细胞凋亡。
杨洪涌, 游江, 马月, 孙金芳, 陈志雄[8]2003年在《清毒饮和养正片对急性白血病人Bcl-2、P~(53)、Fas基因及其mRNA表达的影响》文中研究表明目的探讨清毒饮和养正片抗人类白血病的作用机理。方法选取经清毒饮和养正片治疗前后急性白血病初治或未缓解住院病人,采用免疫组化法检测其Bcl-2、P~(53)、Fas基因;用原位杂交法检测上述基因mRNA水平表达。结果经清毒饮和养正片治疗后,患者Bcl-2基因及其mRNA水平表达下调,Fas基因及其mRNA水平表达上调,P~(53)mRNA水平表达下降,差异有显著性意义(P值分别<0.01,<0.05和<0.0 1=;P~(53)基因似略有上调,但差异无统计学显著性意义(P>0.05)。结论清毒饮和养正片能下调急性白血病患者Bcl-2及其mRNA水平表达,上调Fas基因及其mRNA水平表达,下调P~(53)mRNA水平表达,但对P~(53)基因的影响不明显。
方东行, 娄国菁, 刘立公[9]2005年在《治疗白血病方剂的研究与探讨》文中研究指明白血病是一种起源于造血前体细胞的造血系统恶性增生性疾病,近年来发病率、病死率呈逐年上升趋势。中医药治疗本病的研究开展较多,在1997~2004年8年间,相关的期刊文献每年有80余篇,其中涉及药理实验及临床治疗机理研究的报道约占30%,有许多研究获得科研基
胡莉文[10]2010年在《清毒扶正方药对ANLL-CR患者BMNC来源DC的诱导作用》文中研究指明第一部分文献研究急性白血病(AL)是血液科常见肿瘤之一,具有病情较重,发展较快,缓解后易于复发,长期生存率不高等特点,随着中、西医理论的完善、白血病的治疗方法不断开发和发展,使急性白血病的完全缓解率(CR)和长期生存率有了相当程度的提高,甚至完全治愈。但大部分患者即使完全缓解仍有复发,其根本原因就在于微量残留的白血病细胞的存在,对这种白血病的微小残留状态(MRD)防治是目前白血病研究的热点之一。国内外比较一致的意见认为,微小残留白血病的存在除了与机体免疫功能有关外,与白血病细胞本身的免疫逃逸机制有更密切关系,所以杀灭微小残留白血病细胞必须依靠机体自身的免疫监视功能的正常发挥。而在微小残留白血病阶段,肿瘤负荷较小,并且经过长期化疗后残存下来的白血病细胞对药物的敏感性已经很低,此时应用免疫治疗辅助机体杀灭残存的肿瘤细胞是最好的时机。中医基于对急性白血病正气虚弱,邪毒内侵的病因病机认识,目前对微小残留病的病理机制的认识基本一致,机体处于“邪去正衰”、“正气虚弱”而“余邪未尽”的病理生理状态。基于正气虚弱而邪毒未净是微量残留白血病的基本病理,多认为扶正祛邪治法是其基本的治疗。第二部分实验研究清毒扶正方药对ANLL-CR患者BMNC来源DC的诱导作用1.研究目的本实验用清毒饮、养正片含药血清配合细胞因子对急性髓细胞性白血病缓解期患者骨髓单个核细胞(BMNC)进行体外培养,观察树突细胞(DC)的诱导转化情况。以诱导转化的DC与纯化的正常人T细胞、患者自体T细胞共同培养,以激发T细胞,观察激发后的T细胞对人白血病细胞株K562细胞的杀伤作用。清毒饮、养正片是本院研制的治疗急性白血病的有效中药制剂,本实验从中医药结合免疫治疗白血病的新途径出发,从提高缓解后患者的树突状细胞抗原提呈能力的新切入点,探讨中医药抗白血病的新作用机制,寻求中医治疗缓解后白血病并防止其复发的有效方法。2.研究方法：2.1标本来源2.1.1骨髓单个核细胞来源于广州中医药大学第一临床医学院血液科住院急性髓系白血病患者缓解后(AML-CR)骨髓两例。患者均符合急性白血病诊断标准经标准方案化疗后完全缓解,符合急性白血病完全缓解标准。2.1.2 T细胞来自正常成人外周血及白血病患者完全缓解后外周血各一例。2.1.3白血病细胞株K562细胞。2.2制备中药含药血清取新西兰兔分组,分别以清毒饮、养正片、清毒饮合养正片按低、中、高剂量灌胃动物,制备三个组别的不同浓度的含药血清。2.3分离骨髓去T细胞单个核细胞应用羊红细胞玫瑰花结程序从骨髓中分离出去T细胞的骨髓单个核细胞(TD-MNC)。2.4培养来源于AML-CR患者TD-MNC的DC将TD-MNC细胞与不同中药含药血清与细胞因子联合培养,分为：清毒饮组、GM-CSF+IL-4+IFN-α+TNF-α组、清毒饮+GM-CSF+IL-4+IFN-α+TNF-α组、养正片组、养正片+GM-CSF+IL-4+IFN-α+TNF-α组、清毒饮合养正片+GM-CSF+IL-4+IFN-α+TNF-α组。各含药血清组均分低、中、高剂量组。2.5 DC鉴定：包括形态观察、免疫学检测、及其分泌的细胞因子IL-2、IL-6的测定。2.6外周血T细胞的分离纯化(磁珠分选法)正常人、AML-CR患者各取一份外周血50ml,经Ficoll密度梯度离心获得外周血单个核细胞(PBMNC)后,采用磁珠阴性选择法制得纯化的外周血T细胞。流式细胞仪检测纯度。2.7同种异体T细胞及自体T细胞的激发分别收集纯化的同种异体T细胞、AML-CR患者自体T细胞,与AML-CR患者TD-MNC来源的DC以10：1比例加入24孔培养板培养5d,培养基中加入10OU/ml的IL-2。2.8激发T细胞对K562细胞的杀伤作用(MTT法)将各组T细胞与K562细胞分别以10：1、20：1、40:1效：靶比例培养,计算细胞杀伤率。3.研究结果本实验结果发现清毒饮+养正片组的低剂量组联合细胞因子可促进DC高表达CD1a、HLA-DR、CD80、CD86,并能促使DC高分泌细胞因子IL-2、IL-6,与对照组(细胞因子组)相比表达均明显升高,有统计学意义,说明清毒扶正中药可促进树突细胞的增殖和表达,提高树突细胞的抗原提呈能力。并且,各中药组内效靶比越高,杀伤率越高,这也说明T细胞浓度越大,对肿瘤细胞的杀伤率也越高。各中药组与对照组相比的结果说明,在某种浓度中药联合细胞因子可以比单纯用细胞因子更好地促进DC细胞的诱导转化,从而更强地激发T细胞,产生更大的杀伤力。第三部分临床观察附：清毒扶正方药对AL-CR患者骨髓细胞CD抗原表达及增殖的影响1.研究目的以清毒扶正为立法依据的清毒饮+养正片对照观察完全缓解后急性白血病患者治疗前后骨髓细胞CD34、CD34/CD2、CD34/CD19、CD13/CD33表达率,了解清毒扶正治法对微小残留白血病的治疗效果；通过对照观察患者治疗前后骨髓细胞增殖周期的变化,进一步探求该法治疗微小残留白血病的可能机制。2.研究方法本研究采用随机对照观察清毒扶正方药清毒饮+养正片对完全缓解的急性白血病患者骨髓细胞CD抗原表达及增殖周期的影响。2.1病例来源来源于广州中医药大学第一附属医院血液科住院及门诊患者。2.2治疗措施2.2.1对照组：按常规化疗方案巩固维持治疗(ANLL用DA或MA或HA方案,ALL用VDP或VDLP方案)进行化疗,如出现感染、出血等情况,则按常规抗感染及止血治疗。2.2.2观察组：西医治疗原则同对照组。巩固维持化疗的同时口服清毒饮、养正片方煎剂,日一剂,分二次服,持续4周。2.2.3分别采集两组患者治疗前、治疗四周后的骨髓组织,进行实验观察。2.3骨髓细胞CD抗原表达检测流式细胞仪测定患者治疗前后骨髓细胞CD34、CD34/CD2、CD34/CD19、CD13/CD33表达率。2.4骨髓细胞增殖周期检测流式细胞仪检测患者治疗前后骨髓细胞增殖周期各时相表达率。3.实验结果本实验结合流式细胞仪对患者骨髓细胞增殖周期的测定,表明清毒扶正方药有抑制CD34表达的作用,说明清毒饮+养正片可能抑制了白血病细胞的增殖,从而使能代表髓系白血病细胞的CD13/CD14/CD33、代表淋巴系白血病细胞的CD3/CD19表达率下降。因而,扶正清毒方法可能对稳定病情、改善生活质量,甚至对提高急性髓性白血病患者生存期有宜。第四部分研究结论目前尚未见关于中药单体或复方在白血病肿瘤抗原提呈方面的作用研究。本论文用血清药理学方法率先研究方药复方制剂清毒饮、养正片协同细胞因子对完全缓解后急性白血病患者骨髓单个核细胞来源树突细胞诱导作用及其生物学特性的相关研究,并观察清毒扶正复方制剂在临床上对完全缓解后急性白血病患者骨髓细胞免疫表型及增殖周期的影响,探求清毒扶正方法对急性髓细胞白血病缓解后的可能治疗机制,为进一步开拓急性白血病缓解后的中医治疗方法做出努力。
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