孙素霞[1]2003年在《福氏志贺菌侵袭性基因ipaC的克隆、表达、纯化及抗原活性研究》文中认为志贺菌属细菌(Shigella.spp)通称痢疾杆菌，是一类具有高度传染性和危害严重的革兰氏阴性肠道致病菌，可引起细菌性痢疾(菌痢Shigellosis)，出现发热、肠痉挛、脓血便等典型症状。志贺菌属根据其血清学反应不同可分为四群：福氏志贺菌、宋内氏志贺菌、痢疾志贺菌和鲍氏志贺菌。在发达国家，菌痢主要由宋内氏志贺菌引起，发展中国家则主要流行福氏志贺菌。在我国主要流行福氏志贺菌，菌痢是仅次于肝炎的第二位传染病，是目前国内分布最广的腹泻病。在有军事行动的部队，菌痢的发病率要比平时高2～4倍，因菌痢流行影响军事任务的事例在国内外均有所见。菌痢虽有治疗药物，但抗药问题日益严重，志贺菌不仅对某种抗生素产生耐药，而且对多种抗生素的多重耐药已较为普遍。加上治疗不及时，每年约有10％的急性发病者转为慢性携带者，成为重要的传染源。因此，菌痢的快速诊断和疫苗研究成为菌痢防治工作的重点。筛选和获得敏感性好、特异性高、免疫原性好的抗原是诊断和疫苗研究的基础。目前的研究认为，IpaC是志贺菌属和侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive Escherichia coli. EIEC)中侵袭性大质粒分泌的一种侵袭性蛋白，是细菌侵入肠上皮细胞所必需的。体外研究中，IpaC可以直接侵入巨噬细胞，这对于我们研究菌痢的发病机制提供了理论基础，同时也为菌痢和EIEC的快速诊断和疫苗的研制提供了分子基础。 一、福氏志贺菌侵袭性基因ipaC重组表达质粒的构建及鉴定 利用PCR技术成功地获取了福氏志贺菌(2457T)的侵袭性基因ipaC，经T载体连接克隆后亚克隆入表达载体pET32a，成功地构建了pET32a-ipaC重组表达质粒。pET32a-ipaC重组表达质粒中侵袭性基因第一军医大学硕士学位论文iPaC序列与中国分离株仅存在1个碱基的差异，与国外分离株存在2个碱基的差异，表明不同来源的币ac基因具有很高的同源性。二、重组蛋白的表达、纯化及免疫原性分析 重组表达质粒在大肠杆菌(BLZ IDE3)中进行表达，表达出分子量约为63KDa、C端包含六个连续组氨酸(His)的融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的13%。表达的融合蛋白主要以天然状态存在，可溶。采用QIAexPressioinstTM蛋白纯化系统，获得纯度达到90%的融合表达蛋白。抗His的抗体Westem一Blot分析，发现特异性区带出现在63KDa处，证明该蛋白是所要表达的融合蛋白，且具有免疫原性。用纯化的融合蛋白制备免疫血清，ELISA和Westm一Blot分析表明该免疫血清具有较高的效价，说明该融合蛋白具有良好的抗原活性。为下一步单抗的制备，用于免疫胶体金诊断试剂(GICA)盒的研制奠定了基础。
孙素霞, 卢晓翠, 陈思强, 罗海吉, 俞守义[2]2007年在《福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达、纯化及免疫活性鉴定》文中认为目的表达、纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC并对其免疫活性进行鉴定。方法将含有ipaC基因的pET32a-ipaC表达质粒载体转入大肠杆菌BL21(λDE3)中表达,表达产物进行SDS-PAGE鉴定,并采用QIAexpressionistTM蛋白纯化系统纯化IpaC蛋白;用纯化的蛋白免疫动物获得抗血清,Western-blot检测抗原的免疫活性。结果诱导后的表达产物经SDS-PAGE发现有一相对分子量约为63000的条带,其含量约占总蛋白量的11%,对融合蛋白进行纯化纯度可达90%以上,抗His的抗体Western-blot分析,发现特异性区带出现在63000u处,证明该蛋白是所要表达的融合蛋白,制备的免疫血清可与IpaC发生特异免疫反应。结论pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后,可稳定、高效地表达毒力蛋白IpaC,且纯化后的蛋白具有免疫活性。
参考文献：
[1]. 福氏志贺菌侵袭性基因ipaC的克隆、表达、纯化及抗原活性研究[D]. 孙素霞. 中国人民解放军第一军医大学. 2003
[2]. 福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达、纯化及免疫活性鉴定[J]. 孙素霞, 卢晓翠, 陈思强, 罗海吉, 俞守义. 热带医学杂志. 2007