（1新乡医学院，河南新乡，453000；2郑州人民医院，河南郑州，450003）
[摘要] 目的 利用小干扰RNA(siRNA)技术探讨肺腺癌HCC827细胞EGFR基因突变对MICA/B表达的影响。方法 将规范培养的对数生长期肺腺癌HCC827细胞随机分为三组，EGFR-siRNA转染组、siRNA对照组借助于脂质体LipofectamineTM 2000分别用EGFR-siRNA特异性转染试剂、siRNA对照试剂进行转染，空白对照组无转染，48小时后分别用TR-PCR、Western blot、流式细胞仪检测三组EGFR mRNA、EGFR蛋白、MICA/B，用SPSS20.0对比组间的差异。结果 EGFR mRNA和蛋白、MICA/B，三组表达的差异均存在统计学意义(P<0.05)，其中，EGFR-siRNA转染组低于siRNA对照组及空白对照组(P<0.05)，siRNA对照组与空白对照组接近(P>0.05)。结论 肺腺癌HCC827细胞EGFR基因突变与MICA/B蛋白的表达有关。
[关键词] 腺癌，非小细胞肺；表皮生长因子受体；MICA/B；小干扰RNA
[Abstract] Cbjective Effect of EGFR gene mutation on MICA/B expression in lung adenocarcinoma HCC827 cells by small interfering RNA (siRNA).Method The standardized training of the logarithmic phase of lung adenocarcinoma HCC827 cells were randomly divided into three groups, EGFR-siRNA group, siRNA control group by liposome LipofectamineTM 2000 respectively with EGFR-siRNA specific transfection reagent, siRNA reagent was used to control, the control group 48 hours after transfection, respectively TR-PCR, Western blot, flow cytometry three groups of EGFR, mRNA detected EGFR protein, MICA/B, with the difference of SPSS20.0 between the two groups.Result EGFR mRNA and protein, MICA/B, differences between the three groups was statistically significant (P<0.05), wherein EGFR-siRNA transfection group was lower than that of siRNA control group and blank control group (P<0.05), siRNA control group and blank control group ( P>0.05).Conclusion EGFR gene mutation in lung adenocarcinoma cell line HCC827 was associated with the expression of MICA/B protein.
[key words] Adenocarcinoma, non-small cell lung; Epidermal growth factor receptor; MICA/B; Small interfering RNA
肺癌驱动基因表皮生长因子受体(EGFR)被认为与33%-50%的人表皮肿瘤相关，其反应形成的同源及异源二聚体可通过调控基因表达进而影响肿瘤的血管生成及细胞的凋亡、增殖，主要组织相容性复合体-I类分子链相关蛋白A/B(MICA/B)与NKG2D的结合反应可产生重要的抗肿瘤效应[1-2]。本研究针对肺腺癌HCC827细胞，借助siRNA技术探讨EGFR基因突变对MICA/B表达的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞株及主要试剂、仪器
肺腺癌HCC827细胞（本实验室提供），流式细胞仪（美国BD公司），EGFR-siRNA（上海吉玛制药技术有限公司设计合成），LipofectamineTM 2000试剂盒（Invitrogen公司），鼠抗人EGFR单克隆抗体（Santa Cruz公司），兔抗人β-actin单克隆抗体和羊抗兔IgG（Sino Biological公司），羊抗鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司），辣根过氧化物酶DAB显色试剂盒（Vector公司），FITC荧光标记MICA/B单抗（RD公司）。
1.2 细胞培养
采用含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、链霉素(100μg/mL)的RPMI 1640培养基，在37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中培养HCC827细胞。
1.3 EGFR-siRNA寡核苷酸碱基序列的设计和合成
依据Gene bank内EGFR的基因序列，遵循siRNA设计原则，以EGFR中cDNA序列起点280个核苷酸后的21个连续核苷酸为RNA特异干扰序列，用Primer5.0版本软件设计出具有表达功能的siRNA序列，之后用Blast同源性进行分析比较，其序列为：上游，5'-CUCCAGAGGAUGUUCAAUATT -3'，下游，5'-UAUUGAACAUCCUCUGGAGTT -3'。设计与合成过程由上海吉玛制药技术有限公司完成。
1.5 转染与分组
转染前24小时将对数生长期HCC827细胞接种至加有适量培养液（约1ml）的6孔培养板中（约6×105/孔），随机分为EGFR-siRNA转染组、siRNA对照组、空白对照组后用红、蓝、黑三色分别标记，倒置显微镜见80%-90%培养板表面有细胞覆盖时即进行转染，首先加入5μL的LipofectamineTM 2000，之后EGFR-siRNA转染组、siRNA对照组分别加入5μL EGFR-siRNA特异性转染试剂和5μL siRNA对照试剂进行转染，空白对照组无转染，严格按照转染剂Hifectin-Ⅱ操作说明书进行。
1.6 观察指标
转染时间达48小时后用RT-PCR法检测EGFR mRNA表达，免疫印迹法(Western blot)法检测EGFR蛋白表达，流式细胞仪检测MICA/B蛋白表达。
1.7 统计学方法
收集的数据用SPSS20.0分析，计量资料用（均数±标准差）表示，组间对比用单因素方差分析及q检验，P<0.05或P<0.01为差异有统计学意义。
2 结果
经统计，EGFR mRNA、EGFR蛋白、MICA/B蛋白，三组的差异存在统计学意义(P<0.05)，其中，EGFR-siRNA转染组低于siRNA对照组(q=9.524,P=0.003; q=11.247,P=0.000;q=28.992,P=0.000)及空白对照组(q=16.247,P=0.003; q=22.598,P=0.000; q=24.601,P=0.000)，siRNA对照组与空白对照组EGFR mRNA和蛋白的差异无统计学意义(q=0.204,P=0.189;q=0.354,P=0.122; q=3.024,P=0.113)，见表1。
3 讨论
肿瘤的临床治疗在近几十年来取得了较为可观的进步，其中，手术、放疗、化疗作为其位列前三的经典治疗模式在国内外取得较为广泛的使用，但越来越多的医学同仁意识到此类治疗在消灭肿瘤灶的同时，对正常组织产生的医源性损伤同样不可避免。在基因工程和分子生物学迅速发展的不断推动下，基于免疫反应的肿瘤生物治疗，在受到日益重视的同时，还显示出了较好应用前景，被誉为肿瘤治疗的第四经典模式。EGFR是一种由1186个氨基酸残基构成、相对分子量约为十七万的酪氨酸蛋白激酶型受体，它与固有或其它酪氨酸激酶受体反应可形成同源及异源二聚体，活化酪氨酸激酶区，启动级联反应并将信号转至胞核内，从而调控基因表达，通过影响肿瘤细胞的凋亡、增殖、放化疗敏感性等进而影响肿瘤的发展和演变，而以EGFR为靶点的肿瘤生物治疗至今已成为目前研究的焦点[3]。李建成等[4]对食管鳞、腺癌细胞（ECa-109、OE-19）的研究发现，沉默EGFR基因可增加食管癌的敏感性，且鳞癌更为敏感；钱红等[5]指出，脑出血后血肿附近脑组织内EGFR表达上调，沉默EGFR基因对大鼠星形胶质细胞活化的抑制作用增强；孙俊青等[6]发现，EGFR基因可影响卵巢上皮性肿瘤的演变，靶向沉默EGFR在促进SKOV3细胞凋亡的同时，还可抑制其增殖。本研究EGFR mRNA、EGFR 蛋白、MICA/B蛋白，EGFR-siRNA转染组低于siRNA对照组及空白对照组(P<0.05)，siRNA对照组与空白对照组相当(P>0.05)，这与以上研究并不矛盾，既说明特异性siRNA能沉默EGFR基因，又提示EGFR基因与MICA/B的表达有关。总之，EGFR是包括肺癌在内的多种肿瘤的重要基因，可考虑进一步深入研究。
参考文献
[1]Hynes N E. ErbB2: From an EGFR Relative to a Central Target for Cancer Therapy.[J]. Cancer Research, 2016, 76(13):3659.
[2]王睿,王郡甫,苏庆红,等.MICA在喉癌组织和细胞中的表达及意义[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2016,30(2):94-97.
[3]宗星月, 李进伟. 针对EGFR和VEGF/VEGFR靶点的肿瘤分子靶向药物研究进展[J]. 中国实用内科杂志, 2014,8(S2):62-64.
[4]李建成,邱子丹,潘丁龙,等.siRNA干扰EGFR表达对食管鳞癌和腺癌细胞放射敏感性影响[J].中华放射肿瘤学杂志,2016,25(1):76-80.
[5]钱红,刘理静,李艳春,等.EGFR siRNA通过阻碍STAT3磷酸化抑制大鼠星形胶质细胞活化[J].中国药理学通报,2016,2(2):216-222.
[6]孙俊青.EGFR在卵巢上皮性肿瘤中的表达及RNAi靶向作用的研究[D].南昌大学,2015.
论文作者:王佳佳,,梅家转2
论文发表刊物:《医师在线》2017年2月上第3期
论文发表时间:2017/4/11
标签：转染论文; 细胞论文; 对照组论文; 肿瘤论文; 腺癌论文; 蛋白论文; 基因论文; 《医师在线》2017年2月上第3期论文;