李勋光1 万珙善1（通讯作者） 梁艳霞1 苏长青2 董洪芳1
（1江苏省赣榆县人民医院呼吸科 江苏 赣榆 222100）
（2上海第二军医大学东方肝胆医院检验科 上海 201802）
【摘要】目的：研究miR-126对肺癌A549裸鼠移植瘤生长的作用，探索miR-126作为肺癌基因治疗靶点的可能性。方法：培养肺癌细胞系A549，接种至裸鼠皮下。成瘤后采用表达miR-126的腺病毒进行干预治疗，观察瘤体生长情况；观察期结束，取瘤体做miR-126靶基因Sox2表达的免疫组化检测。结果：以总量1×109 pfu的重组腺病毒Ad5- miR126直接瘤内多点注射，A549移植瘤的生长速度明显被抑制；与对照组相比差异有显著性（P<0.001）；治疗后，瘤体组织内miR-126表达明显升高，同时伴随Sox2表达的降低。结论：miR-126在肺癌的发生发展中其重要作用，其作为肺癌治疗的靶点，能够明显抑制肺癌A549裸鼠移植瘤的生长，其作用机制之一使降低其靶基因Sox2的表达。
【关键词】 肺癌；microRNA-126；移植瘤；Sox2
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）31-0153-03
越来越多的研究证明，MicroRNAs（miRNAs）能够调控基因的表达，从而参与细胞生长、细胞凋亡、组织生长、组织形态形成和肿瘤发生发展等生理病理过程[1,2]。近来，miR-126在肺癌中的作用受到我们的关注[3-5]。我们的前期研究表明，肺癌细胞A549表达miR-126的水平明显低于肺成纤维细胞IMR-90细胞，转染miR-126表达载体后提高miR-126表达后，A549细胞存活率明显降低，细胞周期G0/G1期细胞比例上升而S期下降，提示miR-126能够抑制肺癌细胞增殖活性，诱导细胞周期阻滞；临床肺癌标本的检测，也证实肺癌组织miR-126表达水平明显低于癌旁肺组织，而且miR-126高表达的肺癌患者无瘤生存期（DFS）和总生存期（OS）均明显高于低表达患者[6]。我们判断，miR-126在肺癌的发生发展中起重要作用，有可能成为肺癌治疗的可选靶点之一。因此，我们设计miR-126表达载体治疗A549裸鼠移植瘤的实验，观察其对肿瘤生长的抑制作用。
1.材料与方法
1.1细胞与材料
人肺癌细胞A549购自中国科学院上海细胞研究所细胞库，在含10％胎牛血清的DMEM培养液、37℃、5% CO2 条件下培养。携带绿色荧光报告基因（EGFP）的miR-126表达载体pGenesil-miR126(阴性对比pGenesil-miNC)由第二军医大学东方肝胆外科医院及国家肝癌科学中心分子肿瘤实验室构建并保存。胎牛血清、DMEM培养基、TriZol试剂为Gibco公司产品，鼠抗人Sox2抗体及免疫组化试剂盒购自美国Santa Cruz公司，实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）试剂及miR-126引物由大连宝生物（TAKARA）公司提供。
1.2腺病毒构建及重组
将pGenesil-miR126表达载体的miR-126表达框完整地酶切下来，插入到5型腺病毒（Ad5）的E1缺失区，构建miR-126腺病毒Ad5-miR126。以对照载体pGenesil-miNC的相应酶切片段代替miR-126表达序列，构建对照腺病毒载体Ad5-miNC。Ad5-miR126和Ad5-miNC在293细胞中扩增，纯化后备用。
1.3裸鼠移植瘤实验
健康纯种BALB/C裸鼠30只，4周龄，雄性，中科院上海斯莱克实验动物中心提供。取对数生长期A549细胞悬液注射于裸鼠右腋皮下，5×106细胞数/100µl/只。接种后10天，成瘤率100%，移植瘤直径大约0.5cm左右。随机分为3组（Ad5-miR126、Ad5-miNC、空白对照组）。Ad5-miR126和Ad5-miNC组分别给予相应腺病毒瘤内多点注射，每次每只剂量2×108 pfu/100µl，隔天一次，共5次。空白对照组小鼠同步注射生理盐水，每次每只100µl。治疗后，每周测量瘤体大小，以“最大径×最小径2×0.5”公式计算瘤体体积。观察周期结束，麻醉处死小鼠，取瘤体标本，一部分新鲜组织提取总RNA，用于miR-126表达水平的qRT-PCR检测。其余组织以10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋切片，备用于miR-126靶基因Sox2表达的检测。
1.4miR-126表达水平的qRT-PCR检测
瘤体标本按TriZol试剂提取细胞总RNA，以miR-126 逆转录引物（5’-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACC GCA TT-3’）进行反转录，反转录条件为：37℃ 15min，85℃ 10s。然后采用qRT-PCR方法，以miR-126特异引物（正向：5’-CGC GCC GTA CCG TGA GTA A-3’；反向: 5’-GTG CAG GGT CCG AGG T-3’）进行扩增，反应条件为：95℃ 2min；95℃ 5s、60℃ 20s、72℃ 15s，35个循环；65℃延伸5min。
1.5Sox2表达的检测
瘤体标本以10%中性缓冲福尔马林固定6h，石蜡包埋切片。Sox2免疫组化按常规方法进行。用正常兔血清代替一抗作阴性对照。结果的判断标准，在高倍视野下，每张切片观察5个视野，计数阳性细胞百分比。
1.6统计学分析
采用SPSS 13.0软件进行T检验和卡方检验分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
2.结果
2.1miR-126表达对肺癌移植瘤生长的抑制作用
以总量1×109 pfu的重组腺病毒Ad5-miR126直接瘤内多点注射，定时测量瘤体生长情况。结果发现，Ad5-miR126组移植瘤的生长速度明显被抑制，与对照组相比，治疗后21天差异即具有显著性意义（P=0.0216），至21天即具有非常显著性差异（P=0.0003），而对照病毒Ad-miNC对移植瘤生长无明显抑制作用与对照组相比差异无显著性意义（P=0.7356）。证实重组腺病毒Ad5-miR126介导的miR-126表达产生了明显的抗肿瘤效果（图1）。
图1. 腺病毒Ad5-miR126抗肺癌A549移植瘤的疗效。治疗开始后21天即产生一定疗效，随时间的延长其抗肿瘤生长的疗效明显增加。而同期对照病毒Ad5-miNC无抗肿瘤效果。
2.2miR-126表达的鉴定
瘤体标本提取总RNA，采用qRT-PCR方法扩增miR-126的表达。与空白对照组相比，Ad5-miR126治疗组肿瘤细胞miR-126水平显著升高，miR-126相对表达水平为21.67±3.61，与空白对照组表达水平3.26±0.28相比，差异具有非常显著性意义明显（P=0.0005；图1C），而对照腺病毒Ad5-miNC组miR-126的表达（4.05±0.72）与空白对照组无差异（P=0.8645）。
图2. 肺癌A549移植瘤组织miR-126表达的鉴定。与对照组相比，Ad5-miR126组miR-126表达明显升高； ***P<0.001，与对照组比较。
2.3 miR-126靶基因表达水平的鉴定
取瘤体组织标本切片，进行Sox2免疫组化染色观察。结果发现，Ad5-miR126治疗组的肿瘤组织内Sox2表达水平明显下降（图3），但Ad5-miNC组和空白对照组相比无明显变化。
图3. 肺癌A549移植瘤组织miR-126靶基因Sox2表达的鉴定。与对照组相比，Ad5-miR126组Sox2表达明显降低。
3.讨论
研究表明，很多miRNAs参与肺癌的发展发展过程，如miR-21在非小细胞肺癌（NSCLC）中高表达，能够激活细胞周期相关基因（PDCD4、Cdc25A、PTEN等），增强癌细胞侵袭转移和抗凋亡能力[7]。最近发现，NSCLC普遍存在miR-126表达下调的现象，并且是患者预后不良的独立危险因素。对于miR-126作用的机制，目前研究不多。有人发现miR-126能够抑制癌细胞增殖、粘附、迁移、侵袭，其作用的靶基因有PI3K、KRAS、EGFL7、CRK、ADAM9、HOXA9、IRS-1、SOX-2、SLC7A5、VEGF等，可见miR-126是通过多种途径和多种机制发挥作用的。在miR-126的众多靶基因中，Sox-2是一种干细胞核转录因子，其联合Oct4、Nanog因子能将成熟的皮肤成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPS）[8]。肺癌组织中包括鳞癌、腺癌甚至小细胞肺癌普遍存在SOX2高表达的现象，并且与患者预后不良有关，提示Sox2是一个癌基因[9]。作为一个重要的癌基因，Sox2受miR-126调控，是miR-126的靶基因。因此，在研究miR-126与肺癌的关系时，我们将Sox2作为关注的重点一起进行研究。
近来，关于miR-126在肿瘤中的作用及其机制受到人们关注。已发现在乳腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌中miR-126表达下调，并与癌细胞的高增殖活性、高转移能力、肿瘤间质血管增殖旺盛等现象密切相关。恢复miR-126表达即可抑制癌细胞的生长和转移[10]。因此，miR-126和许多肿瘤密切相关，可被看作是一个肿瘤抑制基因，并且有可能成为肿瘤治疗的靶点之一。本研究中，我们采用腺病毒载体表达miR-126，对肺癌细胞A549的裸鼠移植瘤模型进行治疗研究。通过瘤内注射腺病毒载体，癌细胞感染病毒后，miR-126表达明显升高，同时伴随其靶基因Sox2表达的降低，其结果是肿瘤的生长速度明显放缓，提示miR-126作为肺癌基因治疗的靶点有明显的抗肿瘤生长的作用。
【参考文献】
[1] Brighenti M. MicroRNA and MET in lung cancer. Ann Transl Med. 2015 Apr;3(5):68.
[2] Su Y, Li X, Ji W, Sun B, Xu C, Li Z, Qian G, Su C. Small molecule with big role: MicroRNAs in cancer metastatic microenvironments. Cancer Lett. 2014 Mar 28;344(2):147-56.
[3] Guz M, Rivero-Müller A, Okoń E, Stenzel-Bembenek A, Polberg K, S omka M, Stepulak A. MicroRNAs-Role in Lung Cancer. Dis Markers. 2014;2014:218169.
[4] Tan W, Gu J, Huang M, Wu X, Hildebrandt MA. Epigenetic analysis of microRNA genes in tumors from surgically resected lung cancerpatients and association with survival. Mol Carcinog. 2014 Mar 24. doi: 10.1002/mc.22149.
[5] Feng B, Zhang K, Wang R, Chen L. Non-small-cell lung cancer and miRNAs: novel biomarkers and promising tools for treatment. Clin Sci (Lond). 2015 May 1;128(10):619-34.
[6] 李勋光,万珙善,梁艳霞,苏长青,董洪芳.miR-126对细胞周期的调控及其与肺癌患者预后的关系.实用肿瘤杂志, 2014;29(5):440-445.
[7] Li B, Ren S, Li X, Wang Y, Garfield D, Zhou S, Chen X, Su C, Chen M, Kuang P, Gao G, He Y, Fan L, Fei K, Zhou C,Schmit-Bindert G. MiR-21 overexpression is associated with acquired resistance of EGFR-TKI in non-small cell lung cancer.Lung Cancer. 2014 Feb;83(2):146-53.
[8] Ma Y,Zhang X,Ma H,Ren Y,Sun Y,Wang Q,Shi J. Bioinformatic analysis of the four transcription factors used to induce pluripotent stem cells.Cytotechnology.2014 Dec;66(6):967-78.
[9] Karachaliou N, Rosell R,Viteri S. The role of SOX2 in small cell lung cancer,lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma of the lung.Transl Lung Cancer Res.2013 Jun;2(3):172-9.
[10] Ebrahimi F,Gopalan V,Smith RA, Lam AK.miR-126 in human cancers: clinical roles and current perspectives. Exp Mol Pathol. 2014 Feb;96(1):98-107.
*科研项目：2012年连云港市卫生局指令性课题1241号
作者简介：李勋光（1963-） 男，本科，主任医师 主要研究方向：呼吸系统疾病的诊治
通讯作者：万珙善（1977-）男，本科，副主任医师，主要研究方向：呼吸系统疾病的诊治
论文作者:李勋光,万珙善,梁艳霞,苏长青,董洪芳
论文发表刊物:《医药前沿》2015年11月第31期
论文发表时间:2016/4/28
标签：肺癌论文; 细胞论文; 基因论文; 生长论文; 肿瘤论文; 对照组论文; 组织论文; 《医药前沿》2015年11月第31期论文;