郝建峰[1]2009年在《PHA-CD3AK细胞的生物学特性及其临床应用初步研究》文中进行了进一步梳理由于传统的手术、化疗和放疗的局限性,肿瘤治疗迫切需要新的手段、开辟新的途径。近年来,随着分子生物学、细胞生物学及生物技术的迅猛发展,推动了整个医学领域中生物治疗学的发展,肿瘤生物治疗越来越受到人们的广泛关注,其中的细胞过继免疫治疗成为近年来研究的热点。过继免疫治疗最关键的是选择理想的效应细胞,从上世纪八十年代发现LAK细胞以来,先后有TIL、A-LAK、CTL、TAK、CIK细胞被发现并应用于临床试验,但都存在着各自不同的缺陷和不足。我们探索并研究了新的肿瘤过继免疫效应细胞—PHA-CD3AK细胞,这一新的效应细胞在增殖倍数、杀伤活性、体外存活时间等各方面均优于其他效应细胞。本研究对其生物学特性及临床应用进行了初步研究。主要内容有:1、PHA-CD3AK细胞的制备及其生物学特性初步研究目的:研究PHA-CD3AK细胞的体外诱导方法及其生物学特性,并与LAK细胞进行比较。方法:分离人外周血单个核细胞(PBMC),采用植物血凝素(PHA)、单克隆抗体(anti-CD3McAb)和基因重组人白细胞介素2(rhIL-2)、共同诱导制备PHA-CD3AK细胞;应用流式法分析PHA-CD3AK细胞的免疫表型、乳酸脱氢酶法(LDH)检测PHA-CD3AK细胞的杀伤活性,并观察其形态;吉姆萨染色法观察其核型。结果:微量的anti-CD3McAb(0.05ug/m1)辅以少量的rhIL-2(300u/m1)和PHA(100ug/mL)共同培养,即能诱导和大量扩增PHA-CD3AK细胞,其扩增倍数显著高于LAK细胞,维持高扩增的时间也远较LAK细胞持久;当效靶细胞比为80:1时, PHA-CD3AK细胞对体外肿瘤细胞(K562)杀伤的百分率为56.5%;免疫表型检测PHA-CD3AK细胞中CD3~+、CD4~+、CD8~+细胞的比率分别为(86.5±5.89)%、(38.20±5.27)%、(42.63±3.50)%;核型为正常二倍体,染色体数目为46条。结论: PHA-CD3AK细胞是以CD3~+、CD4~+、CD8~+细胞为主的异质细胞群,并具有淋巴母细胞样特征,PHA-CD3AK细胞为正常二倍体细胞。PHA-CD3AK细胞是易于体外诱导、扩增能力强,体外存活时间长、杀瘤活性高的一种具有广阔应用前景的肿瘤过继免疫效应细胞。2、PHA-CD3AK细胞过继免疫治疗中晚期恶性肿瘤的初步临床研究目的:观察抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cell, PHA-CD3AK)过继免疫治疗中晚期恶性肿瘤的疗效。方法:从51例恶性肿瘤患者自体外周血分离单个核细胞,加入PHA、anti-CD3mAb、重组人IL-2 (rhIL-2)体外诱导后扩增培养,制备自体PHA-CD3AK细胞。待细胞培养至第12 ~ 14天时取样用于质控检测,收集质控检测合格的PHA-CD3AK细胞,调整至终浓度为(4.0 ~ 6.0)×10~9/L,静脉回输至患者体内,每例患者治疗3个疗程,每疗程回输5次(每2 d回输1次),每次回输细胞数不低于1×10~9,每疗程回输细胞总数大于5×10~9。应用人T细胞亚群检测试剂盒和流式细胞仪测定治疗前后患者外周血CD3~+、CD4~+、CD8~+T细胞以及CD16~+56~+细胞(NK细胞)比例;观察治疗前后患者的相关化检指标、生活质量以及不良反应;评定疗效,计算有效率和临床受益率。结果:分离制备的PHA-CD3AK细胞符合活性细胞质控要求,可用于进一步实验治疗。PHA-CD3AK细胞过继免疫治疗后,患者外周血CD3~+、CD4~+、CD8~+ T细胞以及CD16~+56~+细胞(NK细胞)比例分别为(48.88±9.42)%、(35.09±4.11)%、(28.17±4.97)%、(20.31±6.98)%,较治疗前均显著升高(均P < 0.05)。51例患者中,45例患者治疗后全身症状改善明显;所有患者治疗后相关化验指标均未出现异常变化,也未出现其他全身毒副反应;其中完全缓解6例、部分缓解14例、微效10例、稳定12例、进展9例,总有效率达58.8%,临床受益率达82.4%。结论:PHA-CD3AK细胞过继免疫治疗恶性肿瘤疗效确切,并能有效改善和提高患者的机体免疫功能,而且安全,无副作用。本研究对PHA-CD3AK细胞的体外诱导制备以及生物学特性和体内临床应用进行了系统的初步研究,为进一步临床推广应用提供了重要的实验依据和有益的探索。初步表明PHA-CD3AK细胞是一种安全、有效,具有广阔应用前景的抗肿瘤过继免疫效应细胞。
匡志鹏[2]2000年在《CD3AK细胞治疗恶性肿瘤的实验和临床初步应用研究》文中进行了进一步梳理一、基础实验部分目的：了解CD3AK（anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cells， CD3AK）细胞的诱导方法及免疫生物学特性，进一步探明其 抗肿瘤作用机理。方法：采用抗CD3单克隆抗体（anti-CD3 monoclonal antibody，CD3McAb）和重组白细胞介素2（recombinant interleukine-2，rIL-2）等共刺激人外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMC）诱导CD3AK 细胞，用碱性磷酸酶桥联免疫酶标法（APAAP法）分析CD3AK 细胞的表型，四唑盐比色试验（MTT法）检测其对K_(562)细胞的最 适宜效靶比，并观察杀瘤活性动态变化及对K_(562)、A_(2780)、H_(7402) 瘤细胞株的细胞毒活性比较。酶联免疫法检测CD3AK与A_(2780)、 H_(7402)共育前后肿瘤坏死因子（TNF）-α、干扰素（IFN）-γ的动 态变化，在透射电镜下观察A_(2780)、H_(7402)凋亡的形态学变化。结果：1、CD3AK细胞增殖动力学观察结果： CD3McAb和rIL-2共刺激诱导的CD3AK和单纯rIL-2诱导的LAK 细胞在培养的前4天扩增倍数相接近（P＞0.05），但以后随着 时间和CD3McAb剂量的递增，CD3AK细胞的扩增倍数远大于LAK 细胞（P＜0.01）。CD3AK细胞至少维持16天的增长趋势。2、CD3AK、LAK细胞表型分析结果： CD3AK细胞是以CD3~+、CD4~+、CD8~+细胞为主的异质性细胞群，其 中CD3~+、CD4~+、CD8~+均显著高于LAK细胞（P＜0.01）。 3、CD3AK细胞对K；；；细胞株杀伤作用的最适宜浓度 ③3北细胞与靶细胞以10：1的效靶比共育时，其杀瘤活性显著 低于20：1和40卜而20＊和40J两组无明显差异，提示CD3AK 细胞对K；。；细胞最适宜的效靶比为20：l。 4、CD3AK细胞的杀瘤活性动态变化观察结果： CD3AK细胞与K；；；细胞共育结果发现，在培养至第4天的CD3AK 细胞即有较高的杀瘤活性，至第10天时达高峰。 5、CD3AK、LAK、NK细胞的杀瘤活性＊较结果： CD3AK细胞对 K；；；、H；。。；细胞的杀伤活性显著高于 LAK、NK细胞吓 ＜O．叮），但对人；；。细胞株的杀伤活性与＊K、瞅细胞较接近吓 ＞0．05）。 6、CD3AK、LAK与AnM、H川叮共育上清细胞因子TNF－a、IFN－Y 分泌水平检测结果： CD3AK、LAK细胞分另与 A；；；。、H；4；；以 2 0：1、4 0：1的效靶比共育 2 4 h，结果表明作用前后 TNF－a、IFN－Y分泌水平具有显著 性差异p＜0．01厂 共育后H者的分泌水平显著高于共育前。 LAK、CD3AK两组的TNF－a分泌水平达到高峰的时间分别为共 育后sh、12h，而两组IFN－Y分泌水平于作用后sh达到分泌 高峰。 7、CD3AK细胞诱导A；；；。、H，；。；细胞凋亡的形态学观察结果： CD3AK细胞分别与A；；；。、H；；。；共育24小时后，在透射电镜下可见 肿瘤细胞呈典型的凋亡形态学特征：胞核固缩，染色质沿核膜下 呈星月状聚积，胞膜肿胀起泡，可见凋亡小体。 结论CD3AK细胞易于诱导扩增、细胞毒性强，存活时间长，是一种 优于LAK细胞的新型抗肿瘤免疫效应细胞。
徐梅[3]2014年在《化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察》文中指出卵巢癌发病隐匿，大部分患者就诊时已经是晚期，位居妇科肿瘤患者致死首位。结肠癌的发病率和死亡率也位居消化系统肿瘤首位。因此，它们都迫切需要寻找更有效的治疗手段。随着肿瘤免疫学和分子生物学的不断发展，肿瘤免疫治疗已成为肿瘤的第四大治疗模式。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells，CIK）兼具有强大的抗瘤活性和增殖活性，又具有非MHC限制性杀瘤的优点，近些年已经得到广泛关注并应用于多种实体瘤的临床治疗，但对卵巢癌治疗报道少见。本文首先通过体外实验研究顺铂（cis-Dichloro diamine in platinum，CDDP或DDP）、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应，接着通过体内实验研究氟尿嘧啶（5-FU）、CIK细胞及其联合对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用，初步探讨其作用机制。最后，回顾分析本中心6例CIK细胞治疗的卵巢癌患者临床资料，初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性及有效性，为卵巢癌探寻生物治疗策略。第一部分DDP联合CIK细胞对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应目的：探讨DDP、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应并初步探讨其机制。方法：利用人外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）在体外用多种细胞因子诱导生成CIK细胞，于培养第0、7、14、21、28及35天进行细胞计数及流式细胞术分析CD3+CD56+双阳性细胞百分比；于培养14天收获CIK细胞作为效应细胞，用含有CIK细胞培养液上清的培养液培养对数生长期的SKOV-3细胞，于培养24及48小时用流式细胞仪检测SKOV-3细胞的凋亡情况，同时设正常培养的SKOV-3细胞作对照组；杀伤实验分为Ａ1~4CIK细胞作用组（效靶比分别为5:1、10:1、20:1、40:1）、B1~7DDP作用组（DDP浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml）及C1~2CIK联合DDP作用组（DDP浓度均为2.5μg/ml，效靶比分别为5:1和10:1）。同时设效应细胞和靶细胞作对照孔。于24h和48h采用MTT法检测各组对SKOV-3的生长抑制效应。结果：CIK细胞体外培养第0、7、14、21、28及35天细胞计数依次为（1.8±0.2）×107、（14.67±1.53）×107、（230.0±20.0）×107、（225.0±22.91）×107及（220.0±17.32）×107，细胞数于培养第2l天时约增加127.78倍，达到增殖高峰；CD3+CD56+双阳性细胞的百分含量依次为（0.47±0.17）%、（11.30±1.96）%、（35.50±2.30）%、（38.23±1.92）%、（31.40±3.91）%和（28.61±3.45）%，到21天也达到增殖高峰；SKOV-3与CIK细胞培养液上清共培养24h及48h后凋亡率分别为（12.30±1.47）%和（27.13±2.03）%，差异有统计学意义（P <0.05）。对照组24h及48h凋亡率分别为（0.62±0.35）%和（0.65±0.38）%，差异无统计学意义（P>0.05）；Ａ1~4CIK作用组24h抑制率分别为（16.52±2.52）%、（24.18±4.05）%、（35.98±5.19）%及（53.98±5.02）%，48h抑制率分别为（24.20±5.59）%、（41.23±3.64）%、（57.27±6.68）%及（74.74±6.87）%。在相同时间各组间细胞抑制率差异有统计学意义（P <0.05），相同效靶比24h和48h抑制率差异有统计学意义（P <0.05）；CIK细胞对SKOV-3细胞的抑制率随着效靶比的提高及作用时间的延长而提高；B1~7DDP作用组24h抑制率分别为（15.09±4.03）%、（25.95±3.36）%、（37.11±3.05）%、（50.07±5.21）%、（62.93±5.85）%、（77.93±3.28）%及（92.55±1.39）%，48h抑制率分别增为（23.42±5.63）%、（32.39±1.47）%、（46.04±2.76）%、（60.46±3.26）%、（72.77±2.38）%、（86.42±1.46）%及（96.24±0.59）%。除外DDP0.625μg/ml组24h和48h抑制率差异无统计学意义（P=0.102），其余各组差异均有统计学意义。DDP对SKOV-3细胞的抑制率也随着药物浓度的提高及作用时间的延长而提高；C1~2CIK联合DDP作用组24h抑制率分别为（50.50±3.69）%和（68.19±2.07）%，48h抑制率分别为（69.87±2.67）%和（80.11±6.87）%。CIK细胞联合DDP与单一处理因素相比，对SKOV-3的生长抑制率差异有统计学意义。但析因分析结果显示，低剂量组（效靶比为5:1）24h和48h抑制率未见到协同效应（P值分别为0.171和0.895），而高剂量组（效靶比为10:1）24h和48h抑制率见到协同效应（P <0.05）。结论：PBMC在体外经多种细胞因子刺激诱导下可大量扩增获得CIK细胞，其主要效应细胞（CD3+CD56+CIK）在第14~21天为高表达平台期，在此期间可获得较为理想的效应细胞；CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用；联合CIK细胞治疗可明显增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用。第二部分氟尿嘧啶联合CIK细胞在小鼠结肠癌模型体内抗肿瘤效应的实验研究目的：探讨氟尿嘧啶（fluorouracil，5-FU）、CIK细胞以及5-FU联合CIK细胞对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用。方法：建立BALB/C小鼠结肠癌模型，在体外诱导培养小鼠CIK细胞，于第0和7天进行流式细胞术CIK主要效应细胞表型分析。10只荷瘤鼠随机分两组，一组给5-FU（12.5mg/kg）当天腹腔注射，另一组给予NS（0.2ml/只）腹腔注射作对照，第十天采用流式细胞仪分析荷瘤鼠肿瘤组织中淋巴细胞细胞毒性T细胞活化抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-activation antigen4，CTLA-4）和非淋巴细胞CD80、CD86表达。另取40只荷瘤鼠随机分成四组，A组（正常对照组）：NS（0.2ml腹腔灌注，d0）+NS（0.2ml尾静脉注射，d3）；B组（5-FU组）：5-FU（12.5mg/kg腹腔灌注，d0）+NS（0.2ml尾静脉注射，d3）；C组（CIK组）：NS（0.2ml腹腔灌注，d0）+CIK（1×107尾静脉注射，d3）；D组（5-FU+CIK组）：5-FU（12.5mg/kg腹腔灌注，d0）+CIK（1×107尾静脉注射，d3）。观察肿瘤生长并绘制肿瘤生长曲线，生存分析采用Kaplan-Meier法及log-rank检验。用药第10天各组处死5只小鼠，采用RT-PCR法检测四组肿瘤组织中IFN-γ和TNF-表达量。结果：小鼠CIK主要效应细胞在体外扩增第7天达到（18.4±6.8）%。与对照组相比，5-FU处理后小鼠移植瘤组织中CD45+细胞表面CTLA-4表达量提高，且CD45-细胞CD80和CD86表达量增加；5-FU联合CIK细胞治疗组小鼠肿瘤生长速度明显慢于单因素治疗组，差异有统计学意义（P <0.05）；5-FU联合CIK细胞治疗可提高肿瘤组织IFN-γ与TNF-表达量，且联合治疗组与单治疗组中IFN-γ的表达量之间的差异有统计学意义（P <0.05）。结论：5-FU联合CIK细胞治疗对结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用，且可提高BALB/C小鼠结肠癌模型的免疫功能。第三部分化疗联合CIK细胞治疗卵巢癌的临床观察目的：初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性和有效性，为卵巢癌探寻生物治疗策略。方法：利用接受常规手术和化疗结束后卵巢癌患者外周血分离出单个核细胞，在体外经多种细胞因子诱导培养出CIK细胞，流式细胞术分析其表型特征。将体外培养第14~21天的CIK细胞通过静脉回输给患者，流式细胞仪检测患者外周血淋巴细胞表型变化，回顾性观察6例接受CIK细胞治疗的卵巢癌患者资料，观察患者治疗前后卡式评分（Karnofsky performance score，KPS）差异、肿瘤指标差异、外周血T细胞亚群分布及治疗后相关毒副反应。结果：有5例治疗后KPS较治疗前明显提升，另外1例治疗后KPS保持不变。所有接受CIK细胞治疗的患者均未出现明显毒副作用。1例III期EOC患者手术联合化疗治疗后CA199升高，在接受CIK细胞治疗3个疗程后，CA199逐渐下降至正常。目前状况良好，肿瘤标记物和影像学随访没有肿瘤复发迹象，无瘤生存期（progression free survival，PFS）已达到3年。1例II期透明细胞癌合并浆液性癌患者，接受CIK细胞治疗2个疗程，PFS已接近4年，随访瘤标和影像学检查无肿瘤复发迹象。另外1例II期EOC患者接受8个疗程CIK细胞治疗后，PFS已达5年，目前状况良好，也没有肿瘤复发迹象。结论：CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生存质量，是一种有希望的治疗方法。综上所述，本文通过对化疗联合CIK细胞治疗肿瘤的基础研究和治疗卵巢癌病例的回顾分析，我们认为，CIK细胞可在体外经多种细胞因子刺激下诱导扩增，第14~21天可获得较为理想的效应细胞；CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用；联合CIK细胞治疗可增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用；5-FU联合CIK细胞治疗对BALB/C小鼠结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用5-FU或CIK细胞，且可提高小鼠结肠癌模型的细胞免疫功能。CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生活质量，是一种有希望的治疗方法。
李壮[4]2014年在《自体及健康人CIK细胞对比治疗恶性肿瘤的初步评估研究》文中指出研究背景和目的：肿瘤的有效治疗是医学领域最难攻克的难题之一。近年来，随着对免疫系统及其功能的深入研究，过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular transfer immunotherapy，ACT)成为继手术、化疗以及放疗等临床常规治疗方法外第4种肿瘤治疗的有效方式。ACT是指向肿瘤患者体内输注具备抗肿瘤活性的免疫细胞以激活机体抗瘤免疫应答或直接杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells，CIK)在1991年由Schmidt-Wolf等发现，是脐血或外周血来源的单个核细胞在体外经一系列细胞因子刺激及诱导扩增得到的一群异质细胞，主要发挥杀瘤作用的是CD3+CD56+细胞。与早期用于ACT治疗的免疫细胞，如淋巴因子活化的杀伤细胞(lympokine activated killercells，LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)以及抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(anti-CD3monoclonal antibody activated killer cells，CD3AK)等相比，CIK细胞具备体外扩增效率高、抗瘤活性强、毒副反应小并且对多药耐药肿瘤细胞同样敏感等优点，已经在临床多种血液系统恶性肿瘤及恶性实体肿瘤的治疗中取得了可喜的效果，成为目前ACT治疗的研究热点。现在临床主要通过采集肿瘤患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcells，PBMC)行体外诱导收获CIK用于细胞过继治疗，但研究表明患者自体CIK细胞过继治疗对恶性实体肿瘤的总体有效性仅为30%左右；除患者自体CIK外，健康人来源的同种异体CIK细胞由于其易于获得、毒副作用小的特点被用于部分年老体弱患者的治疗，然而目前尚无关于肿瘤患者自体以及健康人CIK细胞在体外增殖能力、抑瘤活性以及临床治疗效果差异的系统比较。此外，CIK回输患者体内后在体内的存活周期也是影响ACT治疗效果的重要因素，但目前尚无关于此方面的确切文献报道。本实验的研究目的即是通过比较恶性肿瘤患者和健康人来源的CIK细胞在体外增殖能力、抑瘤活性以及临床治疗效果的差异，并初步分析健康异体CIK细胞回输患者体内后的存活时间，以期为临床实施CIK细胞过继治疗提供一定的依据和经验。方法：第一部分：肿瘤患者自体及健康人CIK细胞的体外分离培养1． Ficoll密度梯度离心法分离肿瘤患者及健康人PBMC，在体外经干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、抗CD3单克隆抗体(OKT3monoclonal antibody，OKT3)、重组人白细胞介素-1(recombinant human interleukin-1，rhIL-1)以及重组人白细胞介素-2(recombinant human interleukin-2，rhIL-2)诱导培育CIK细胞；2．应用0.04%台盼兰拒染法计数培育3d、7d及14d时肿瘤患者CIK及健康人CIK细胞，分析体外增殖能力；3．应用流式细胞术检测培育3d、7d及14d时肿瘤患者CIK及健康人CIK细胞中CD3+CD56+表型变化。第二部分：肿瘤患者自体及健康人CIK细胞体外抑制HCT116和HepG2并影响其Bcl-2/Bax表达的初步比较1．以人结肠癌细胞株HCT116和肝癌细胞株HepG2为靶细胞，设置效靶比(ratioof effector cells to target cells，E/T)为5:1、10:1、20:1和40:1，分别取培育14d时肿瘤患者CIK及健康人CIK细胞处理24h后通过细胞增殖、毒性检测试剂盒(cell countingkit-8，CCK-8)检测其对靶细胞的抑制活性，以正常PBMC处理的靶细胞为对照组；2．以人结肠癌细胞株HCT116和肝癌细胞株HepG2为靶细胞，设置效靶比为40:1，分别取培育14d时肿瘤患者CIK及健康人CIK细胞处理48h后通过Western Blot检测靶细胞中B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)以及Bcl-2相关X基因(Bcl-2associated X，Bax)表达情况并计算Bcl-2/Bax，以正常PBMC处理的靶细胞为对照组。第三部分：肿瘤患者接受自体或健康人CIK治疗后近期疗效比较以及健康男性CIK在女性患者体内存活周期的初步研究1．取患者接受自体或健康异体CIK细胞治疗后不同时间点外周血样本，通过流式细胞术检测淋巴细胞亚群水平，以健康人淋巴细胞亚群水平为对照；2．以Karnofsky功能状态评分(karnofsky performance status，KPS)、数字疼痛评分法(numerical rating scale，NRS)和体重变化作为主要评估指标，评估患者接受自体或健康异体CIK细胞治疗后临床收益反应(clinical benefit rate，CBR)；3．观察记录CIK治疗期间毒副反应，如发热、皮疹等不适；4．取8例接受男性亲属CIK细胞治疗女性不同时间点的外周血样本，提取DNA行常规PCR，对Y染色体性别决定基因(sex determining region of Y chromosome，Sry)行初步定性分析。结果：第一部分：肿瘤患者自体及健康人CIK细胞的体外分离培养1．台盼兰拒染法结果显示培育3d、7d及14d时健康人CIK细胞增殖快于肿瘤患者CIK细胞；2．流式细胞术检测培育3d、7d及14d时CIK细胞CD3+CD56+表型变化，结果显示同时期健康人CIK细胞中CD3+CD56+比例高于肿瘤患者CIK细胞。第二部分：肿瘤患者自体及健康人CIK细胞体外抑制HCT116和HepG2并影响其Bcl-2/Bax表达的初步比较1．CCK-8检测肿瘤患者自体CIK细胞、健康人CIK细胞以及健康人PBMC对HCT116和HepG2的抑制能力，结果显示这3组细胞均可不同程度抑制肿瘤细胞，在同一种效应细胞作用时，效应细胞的抑瘤作用随效靶比的升高而增加；在同一效靶比下，健康人CIK细胞的体外抑瘤活性要强于肿瘤患者自体CIK细胞，而正常PBMC的抑瘤作用相对较弱；2．Western Blot检测肿瘤患者自体CIK细胞、健康人CIK细胞以及健康人PBMC处理后HCT116和HepG2中Bcl-2及Bax表达情况，结果显示这3组细胞处理后的肿瘤细胞Bcl-2、Bax表达情况均有改变，Bax表达不同程度上调，Bcl-2表达不同程度下调，Bcl-2/Bax比值呈现降低趋势，其中健康人CIK细胞引起的这一效应最强，正常PBMC处理组相对较弱，而肿瘤患者自体CIK处理组介于2者之间。第三部分：肿瘤患者接受自体或健康人CIK治疗后近期疗效比较以及健康男性CIK在女性患者体内存活周期的初步研究1．流式细胞术检测患者接受CIK细胞治疗后淋巴细胞亚群水平，以健康人淋巴细胞亚群水平为对照，结果显示CIK细胞过继治疗后24例患者免疫功能均有不同程度改善，其中健康异体CIK细胞治疗组12例患者总CD3+T、CD4+/CD8+比值改善较自体CIK细胞治疗组更快且持续时间较长；2．接受自体CIK细胞或健康异体CIK细胞治疗后60d的2组患者在KPS评分、NRS评分和体重变化这3个主要评估指标以及总体的CBR上无明显差异；3．观察期间24例患者均未出现严重的毒副反应；4．接受男性亲属CIK治疗的8例女性患者在治疗后均可检测到Sry基因条带，其强弱随时间逐渐减弱直至消逝，平均持续时间为(7.0±0.93) w。结论：本课题初步探讨了12例恶性肿瘤患者自体及12例健康人来源的CIK细胞在体外增殖能力、抑瘤活性及临床近期疗效的差异，并通过对8例接受男性亲属CIK治疗的女性患者外周血Sry基因水平行初步定性分析以评估CIK细胞在患者外周血的存活时间：一、在体外培育过程中，健康人CIK细胞较肿瘤患者CIK细胞增殖速度快且CD3+CD56+比例较高；二、肿瘤患者自体CIK细胞、健康人CIK细胞以及健康人PBMC在体外均可不同程度抑制HCT116和HepG2，其中健康人CIK细胞抑瘤活性较肿瘤患者自体CIK细胞强，而健康人PBMC抑瘤活性相对较弱；进一步实验表明，这3组细胞均可通过上调肿瘤细胞Bax、抑制其Bcl-2表达水平介导靶细胞的凋亡，其中健康人CIK细胞作用最强，肿瘤患者自体CIK细胞次之，健康人PBMC作用相对较弱；三、接受CIK细胞过继治疗后，24例患者免疫功能均有不同程度改善，其中健康异体CIK细胞治疗组免疫状况改善较自体CIK细胞治疗组更快且持续时间较长；2组患者在治疗后60d的KPS评分、NRS评分和体重变化以及总体的CBR上无明显差异，均未出现严重的毒副反应；其中接受男性亲属CIK治疗的8例女性患者在治疗后均可检测到Sry基因条带，其强弱随时间逐渐减弱直至消逝，平均可检出时间为治疗后(7.0±0.93) w。
莫钦国, 梁安民, 谢裕安, 袁卫平, 罗小玲[5]1998年在《CD_3AK细胞治疗对原发性肝癌患者免疫功能影响的研究》文中研究表明为了观察ＣＤ３ＡＫ细胞对原发性肝癌（简称肝癌）患者免疫功能的影响。采用ＣＤ３ＡＫ细胞治疗６５例不能切除的肝癌患者，分别于治疗前后测定患者Ｔ细胞亚群（ＡＰＡＡＰ法）和血清可溶性白细胞介素２受体（ｓＩＬ－２Ｒ）水平（ＥＬＩＳＡ法）。结果：ＣＤ３ＡＫ细胞治疗后肝癌患者Ｔ细胞亚群ＣＤ＋３、ＣＤ＋４、ＣＤ＋８升高，ｓＩＬ－２Ｒ水平下降，统计学有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。提示ＣＤ３ＡＫ细胞治疗肝癌对提高患者免疫功能有积极作用
叶子, 师建国, 张希国[6]2006年在《CD3AK细胞的研究进展》文中研究说明过继免疫疗法是目前治疗恶性肿瘤的一个重要辅助治疗方法。它是指体内回输免疫活性细胞,从而达到杀伤恶性肿瘤细胞的目的。与其他抗肿瘤药物相比,它可以在没有损伤机体免疫系统结构和功能的前提下,直接杀伤肿瘤细胞,并且调节和增强机体的免疫功能。用于过继免疫疗法的免疫活性细胞必须具有较强的细胞毒活性和增殖力,目前常用的有抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(anti-CDlmon-odonal antibody activated killer cells,CD3AK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer cells,LAg)及细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,aKl)[1~3]。其中研究最多最重要的就是CD3AK细胞。本文拟就其研究进展作一综述。
张志凯[7]2009年在《不同来源CIK细胞的生物学特性与临床应用研究》文中研究表明背景:目前,肿瘤的治疗方法还是以手术、放疗、化疗三大传统手段为主,但这三大传统手段均存在各自的缺点,生物治疗做为第四种手段日益受到重视,并已经应用到临床。过继性免疫治疗是生物治疗的一个重要分支,它是将对疾病有免疫力的供者的免疫应答产物(如抗体、小分子免疫肽和免疫效应细胞)转移给其他个体,或自体细胞经过体外处理后回输自身,产生治疗作用的免疫疗法。CIK细胞是过继性免疫治疗的生力军。与其他抗肿瘤药物相比,它可以在没有损伤机体免疫系统结构和功能的前提下,直接杀伤肿瘤细胞,并且调节和增强机体的免疫功能。目前,肿瘤患者自体外周血CIK细胞治疗技术已广泛用于临床,并且取得了一定疗效。但总的看来,自体CIK治疗效果不尽令人满意,有效率在30%左右。究其原因可能是“肿瘤免疫编辑”所致,该理论认为,机体免疫系统在杀伤肿瘤的同时,也促进了肿瘤的恶性发展,导致了恶性肿瘤的免疫逃逸,或免疫细胞对肿瘤的免疫耐受。其结果导致肿瘤的发生,发展和复发。也就是说自身的免疫系统对自身的肿瘤细胞失去了杀伤作用,是肿瘤难治的主要原因。我们在“肿瘤免疫编辑”理论的启示下,用同种异体(健康人)的CIK细胞治疗其他治疗方法(包括自体CIK细胞疗法)均失败的晚期肿瘤患者,有些取得了出乎预料的好效果。为了给这项新颖技术的临床应用提供相应的理论基础和临床依据,我们对健康人和肿瘤患者来源的CIK细胞的生物学特性及健康人CIK细胞的临床应用进行了相应研究。目的:比较健康人和肿瘤患者外周血来源的CIK细胞的体外扩增速度、细胞表型和杀伤活性;观察健康人CIK细胞对裸鼠体内移植瘤的预防和治疗作用;观察健康人CIK细胞对晚期肿瘤患者的临床治疗作用。研究方法:第一部分:健康人和肿瘤患者外周血来源的CIK细胞的体外扩增速度、细胞表型和杀伤活性1. CIK细胞的诱导:常规无菌采集健康人和肿瘤患者外周血各10份,采用密度-梯度离心法分离出外周血中的单个核细胞,向悬浮细胞中加入细胞因子rhIFN-γ、rhIL-2和CD3mAb,定向诱导成CIK细胞。2.直接活细胞计数法比较两者的扩增速度。3.流式细胞仪检测比较两者细胞表型。4. MTT法比较两者对K562和LOVO细胞株的杀伤活性。第二部分健康人CIK细胞对裸鼠体内移植瘤的预防作用和治疗作用1.对照组:6只裸鼠,第一天背部皮下接种A549细胞1×106/0.2ml,第二天开始在尾静脉注射生理盐水0.2ml,连续5天,观察移植瘤的生长情况。2.预防作用:6只裸鼠,第一天开始尾静脉注射CIK细胞,2×10~7个细胞/0.2ml,连续5天,第6天背部皮下接种A549细胞1×10~6个细胞/0.2ml,观察移植瘤生长情况。3.治疗作用:18只裸鼠,每只裸鼠于第一天接种A549细胞1×10~6/0.2ml,次日,分为3组,每组6只,均连续治疗5天,观察移植瘤的生长情况。第一组:局部(接种A549部位)注射CIK细胞2×10~7/0.2ml;第二组:尾静脉注射CIK细胞2×10~7/0.2ml;第三组:局部(接种A549部位)及尾静脉各注射CIK细胞2×10~7/0.2ml。3.四周后处死裸鼠,测量肿瘤大小,称重,计算肿瘤体积,抑瘤率,并做病理检查。第三部分:健康人CIK细胞对晚期肿瘤患者的临床治疗作用。选取12例接受CIK细胞过继性免疫治疗的晚期肿瘤患者,采用自身对照法比较治疗前后患者症状、KPS评分、疗效以及PBMC对K562杀伤活性的变化。结果:第一部分:健康人外周血来源的CIK细胞的扩增速度显著高于肿瘤患者外周血来源的CIK细胞(P < 0.05);流式细胞仪检测显示健康人外周血来源的CIK细胞CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞百分比显著高于患者外周血来源的CIK细胞(P < 0.05);健康人外周血来源的CIK细胞对K562,LOVO的杀伤活性强于患者外周血来源的CIK细胞(P < 0.05)。第二部分:生理盐水对照组各裸鼠背部皮下移植瘤出现较早,并且以相近速率快速生长,体积较大;CIK细胞预防组及治疗组中局部注射组和尾静脉注射组的移植瘤出现较晚,生长较慢,体积较小,联合治疗组治疗效果更佳(P < 0.05)。第三部分:临床上CIK细胞治疗12例其他疗法失败的晚期肿瘤患者,11例临床症状改善,8例KPS评分提高,疗效CR2例,PR3例,MR2例,SD1例,PD4例,有效率(CR+PR+MR)为58.3%,PBMC对K562细胞株的杀伤活性提高16.47%。结论:1.体外实验中,健康人外周血来源的CIK细胞体外扩增快, CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例高,对肿瘤细胞的杀伤活性强于肿瘤患者外周血来源CIK细胞。2.动物实验中,健康人CIK细胞对裸鼠移植瘤有预防和治疗作用。3.临床研究资料表明:健康人来源的CIK细胞对其他疗法无效,包括自体CIK细胞治疗失败的肿瘤患者仍有一定疗效,主要表现在肿瘤缩小或消失,自我症状改善,KPS评分提高,自体PBMC杀伤活性增强。
卢倩倩[8]2014年在《异体CD3AK细胞治疗人肾癌SCID小鼠移植瘤模型的有效性研究》文中进行了进一步梳理目的肾细胞癌(Renal cell carcinoma, RCC)占男性新发癌症的4%,在女性新发癌症病例中占3%,与其他实体肿瘤不同的是,肾癌对肿瘤的传统疗法均不敏感,如放射治疗、化学治疗等.但是肾癌被发现是免疫相关的肿瘤,多种免疫治疗在肾癌的治疗中取得了不同程度的成功。本实验通过研究过继细胞免疫治疗(Adoptive cellular immunotherapy, ACI):异体抗CD3分子的单克隆抗体激活的杀伤细胞(anti-CD3monoclonal antibody activated killer cells, CD3AK)对人肾癌细胞株OS-RC-2的体外杀伤作用,以及其对严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠人肾癌移植瘤模型的体内抑制作用,从而进一步探讨异体CD3AK细胞对SCID小鼠人肾癌移植瘤治疗的有效性,为异体CD3AK细胞治疗肾癌的临床应用提供理论及实验支持。方法1.人肾癌OS-RC-2细胞株的培养与传代：无菌细胞培养,及时进行换液与传代,定时观察细胞形态与数量,待细胞进入对数生长期时,台盼蓝染色鉴定活力后用于实验。2.于体外条件下建立大量扩增异体CD3AK细胞的培养体系：采集健康志愿者的外周血,体外分离获得外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC),培养获得异体CD3AK细胞；采用流式细胞仪检测CD3AK细胞的表型；3.CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测异体CD3AK细胞对人肾癌0S-RC-2细胞株的杀伤作用；4.建立荷瘤模型：采用左侧腹股沟皮下注射的方法,建立人肾癌SCID鼠皮下移植瘤模型,并通过尾静脉注射异体CD3AK细胞,对照组尾静脉注射磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS),剂量为0.2m1／只,观察小鼠的生物学特征。SCID小鼠被随机分为四组(n=8)：A组(于荷瘤前尾静脉注射异体CD3AK细胞),B组(A组对照组：荷瘤前尾静脉注射PBS)；C组(荷瘤后尾静脉注射异体CD3AK细胞),D组(C组对照组：荷瘤后尾静脉注射PBS)。隔日测量小鼠的体重、肿瘤体积以观察小鼠体重及肿瘤生长变化；末次治疗结束后24小时处死小鼠,无菌取脾脏、肿瘤组织用于后续实验。5.免疫组化法检测CD3+细胞在小鼠肿瘤组织中的表达情况；计算脾脏指数(脾重／体重),观察异体CD3AK细胞对肾肿瘤生长的抑制作用及其对小鼠免疫系统的作用。结果1.将异体CD3AK细胞与人肾癌OS-RC-2细胞共同孵育12h,用CCK-8法检测可以观察到,随着效应细胞与靶细胞比值的增大,异体CD3AK细胞对OS-RC-2细胞的杀伤活性随之增高。2.A、C组小鼠与其对照组B、D组小鼠比较,A、C组小鼠的脾脏指数显著增大(P<0.05)；A组与C组比较,小鼠脾脏指数无明显差异(P>0.05)；3.A、C组小鼠与其对照组B、D组小鼠比较,A、C组小鼠肿瘤重量显著减小,肿瘤生长缓慢(P<0.05)；A、C组与B、D组小鼠体重均增加,实验(A、C)组小鼠体重较其对照(B、D)组小鼠体重增加的少(P<0.05),4.A组小鼠与C组小鼠比较,A组小鼠肿瘤重量减小,肿瘤生长迟缓(P<0.05)。5.免疫组化方法示,CD3+细胞在C组小鼠肿瘤组织中有阳性表达,其余各组小鼠肿瘤组织未发现有阳性表达。结论1.异体CD3AK细胞对人肾癌OS-RC-2细胞株具有体外杀伤作用；2.异体CD3AK细胞对人肾癌SCID小鼠移植瘤的生长具有显著抑制作用；3.异体CD3AK细胞对人肾癌SCID小鼠移植瘤的发生具有一定的预防作用；4.异体CD3AK细胞能增强人肾癌荷瘤SCID小鼠机体免疫功能并发挥其抗肿瘤作用。
莫钦国, 梁安民, 蒙子卿, 陆益, 谢裕安[9]1999年在《CD_3AK细胞结合中药治疗原发性肝癌的疗效初步观察》文中指出目的 :观察 CD3 AK细胞结合中药制剂 -消癌胶囊治疗原发性肝癌的效果。方法 :选择确诊为不能切除的中晚期肝癌患者 119例 ,随机分为三组 ,A组 30例采用 CD3 AK细胞结合消癌胶囊治疗 ,B组 44例单用 CDAK细胞治疗 ,C组 45例单用化疗。结果 :A、B、C组部分缓解率分别为 30 %、2 0 .5%、17.7% ,同时 A、B两组患者治疗后 T细胞亚群 CD3 +、CD4 +、CD8+有不同程度提高。结论 :CD3 AK细胞结合中药制剂 -消癌胶囊是治疗肝癌的一种有效手段。
罗小玲, 梁安民[10]1998年在《CD_3AK细胞的实验研究和临床应用进展》文中研究说明生物疗法已成为当今恶性肿瘤治疗的第四大模式，继ＬＡＫ／ＩＬ－２在肿瘤免疫治疗中取得一定疗效后，人们又发现了新一代的高效抗瘤效应细胞－抗ＣＤ３单克隆抗体激活的杀伤细胞（Ａｎｔｉ－ＣＤ３ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｃｔｉｖａｔｅｄｋｉｌｅｒｃｅ...
参考文献：
[1]. PHA-CD3AK细胞的生物学特性及其临床应用初步研究[D]. 郝建峰. 第四军医大学. 2009
[2]. CD3AK细胞治疗恶性肿瘤的实验和临床初步应用研究[D]. 匡志鹏. 广西医科大学. 2000
[3]. 化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察[D]. 徐梅. 苏州大学. 2014
[4]. 自体及健康人CIK细胞对比治疗恶性肿瘤的初步评估研究[D]. 李壮. 第三军医大学. 2014
[5]. CD_3AK细胞治疗对原发性肝癌患者免疫功能影响的研究[J]. 莫钦国, 梁安民, 谢裕安, 袁卫平, 罗小玲. 广西医学. 1998
[6]. CD3AK细胞的研究进展[J]. 叶子, 师建国, 张希国. 现代肿瘤医学. 2006
[7]. 不同来源CIK细胞的生物学特性与临床应用研究[D]. 张志凯. 广州医学院. 2009
[8]. 异体CD3AK细胞治疗人肾癌SCID小鼠移植瘤模型的有效性研究[D]. 卢倩倩. 山东大学. 2014
[9]. CD_3AK细胞结合中药治疗原发性肝癌的疗效初步观察[J]. 莫钦国, 梁安民, 蒙子卿, 陆益, 谢裕安. 广西医学. 1999
[10]. CD_3AK细胞的实验研究和临床应用进展[J]. 罗小玲, 梁安民. 广西医学. 1998