岳阳市岳化医院检验科 湖南岳阳 414000
【摘 要】目的：分析淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体多重荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用。方法：以淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体的保守基因porA、trp、ure为目标检测基因，设计引物与TaqMan探针，制作重组质粒标准品，画出标准曲线，建立多重荧光定量PCR检测方法，并对120份泌尿生殖道分泌物标本进行病原体检测，将检测结果与常规PCR法的检测结果进行对比，分析多重荧光定量PCR检测方法的应用价值。结果：常规PCR法检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体的阳性率分别为29.2%、24.2%、15.0%，多重荧光定量PCR法检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体的阳性率分别为36.7%、31.7%、22.5%，多重荧光定量PCR法检测结果的阳性率明显高于常规PCR法，对比差异显著（P<0.05）。结论：多重荧光定量PCR检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体的阳性率较高，可为临床提供非常有价值的参考依据。
【关键词】淋病奈瑟菌；沙眼衣原体；细小脲原体；多重荧光定量PCR检测方法
Establishment and clinical application of multiplex fluorescent quantitative PCR for detection of
Neisseria gonorrhoeae，Chlamydia trachomatis and fine Ureaplasma urealyticum
[Abstract] Objective：to establish a multiplex fluorescence quantitative PCR for the detection of Neisseria gonorrhoeae，Chlamydia trachomatis and fine Ureaplasma urealyticum and its clinical application. Methods：Neisseria gonorrhoeae，Chlamydia trachomatis，Ureaplasma parvum conservative genes porA，Trp，ure as the target gene，design primers and TaqMan probe，making recombinant plasmid standard，draw the standard curve，set up a method for the detection of multiple fluorescence quantitative PCR，and pathogens were detected in 120 urogenital specimens，were compared the detection results with conventional PCR method，the application of value analysis method for the detection of multiple fluorescence quantitative PCR. Results：the positive rate of the conventional PCR method for detection of Neisseria gonorrhoeae，Chlamydia trachomatis and Ureaplasma parvum were 29.2%，24.2%，15%，the positive rate of multiple fluorescence quantitative PCR method for detection of Neisseria gonorrhoeae，Chlamydia trachomatis and Ureaplasma parvum were 36.7%，31.7%，22.5%，the positive rate of the detection results of multiple fluorescence quantitative PCR method better than the conventional PCR method，significant differences（P<0.05）. Conclusion：the positive rate of multiplex fluorescent quantitative PCR for detection of Neisseria gonorrhoeae，Chlamydia trachomatis and fine Ureaplasma urealyticum is high，which can provide a valuable reference for clinical practice.
[Keywords] Neisseria gonorrhoeae；Chlamydia trachomatis；fine Ureaplasma；multiplex fluorescent quantitative PCR detection method
性传播疾病是眼下全球流行最广的传染病，在其病原体中，淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体诱发的泌尿生殖系统感染已是各国的性传播病症【1】。淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体常呈同步感染状态，其中细小脲原体被一致认为是引发非淋性尿道炎的关键病原体【2】。对于病原体的检测，目前临床上尚缺乏一种标准的检验方法。基于此，本研究先建立了多重荧光定量PCR检测方法，再对我院2017年1月到2017年6月采集的120份泌尿生殖道分泌物标本进行病原体检测，总结报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
选出120例泌尿生殖道感染患者，取患者的宫颈分泌物、尿道棉签样本，置于含有1ml 0.9%氯化钠溶液的EP管内，混匀，离心，去上清，添加50μL DNA提取液，混匀，煮沸10min，离心，取上清液为模板，置于-20℃环境下，待测。
1.2方法
1.2.1多重荧光定量PCR检测方法的建立
淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体的标准株都源于美国标准生物品收藏中心。所需试剂与仪器主要包括UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒、UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒、核酸检测试剂盒等。以淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体的保守基因porA、trp、ure为目标检测基因，分别对其进行线上序列比对。应用Primer Express 3. 0 software系统设计淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体的引物与TaqMan探针。制作重组质粒标准品，根据质粒的相对分子质量计算其拷贝数。调整重组质粒浓度，以10倍梯度稀释，将不同浓度的质粒DNA作为模板进行多重荧光定量PCR扩增，DNA拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，画出标准曲线，见图1【3-4】。
图1 DNA拷贝数
1.2.2 多重荧光定量PCR检测方法的论证 经敏感性、特异性、重复性验证，发现该检测方法的敏感性、特异性、重复性均良好；荧光扩增曲线及标准曲线的相关系数为0.998~1.000，提示初始DNA拷贝数与Ct值之间的线性关系良好。
1.2.3多重荧光定量PCR检测方法的临床应用 运用已建立的多重荧光定量PCR检测方法，对120份泌尿生殖道分泌物标本进行淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体检测，将检测结果与常规PCR法的检测结果进行对比，分析多重荧光定量PCR检测方法的应用价值。
1.3数据处理 用SPPS19.0软件处理数据，计数资料以%表示，采用x?检验，P<0.05表示差异显著。
2结果
2.1淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体样本多重荧光定量PCR扩增曲线图，见图2~4。
图3 沙眼衣原体扩增曲线图
图4 细小脲原体扩增曲线图
2.2常规PCR法与多重荧光定量PCR法检测结果的阳性率对比
常规PCR法检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体的阳性率分别为29.2%、24.2%、15.0%，多重荧光定量PCR法检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体的阳性率分别为36.7%、31.7%、22.5%，多重荧光定量PCR法检测结果的阳性率明显高于常规PCR法，对比差异显著（P<0.05）。见表1。
表1 常规PCR法与多重荧光定量PCR法检测结果的阳性率对比[n（%）]
注：与常规PCR法比较，*P＜0.05。
3 讨论
淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体均是诱发泌尿生殖道感染的主要病原体，感染后会导致泌尿生殖道出现局部炎症，进而产生一系列病理变化【5】。对于这三类病原体的检测，传统方法一般采用培养法、免疫法等进行检测，这两种方法虽可达到检测效果，但其敏感度较低，且检测时间较久，因此其临床应用存在一定的局限性。常规PCR法的灵敏度虽有所提升，但必须对PCR产物进行后处理，导致其检测时间较久，对PCR产物进行后处理时还会引发交叉感染，进而导致检测结果出现假阳性。
多重荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性与敏感性，可通过仪器对PCR产物进行荧光信号检测，因此大大提升了敏感度，能够检出常规PCR检测不到的病原体模板浓度。多重荧光定量PCR检测方法还可以实现多病原体的同步检测，更省时省力【6】。本研究对比常规PCR法与多重荧光定量PCR法的检测结果，发现多重荧光定量PCR法检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体的阳性率均明显提升，说明多重荧光定量PCR法的临床应用价值高于常规PCR法。
综上所述，多重荧光定量PCR检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体的阳性率较高，可为临床提供非常有价值的参考依据。
参考文献：
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论文作者:胡策勋
论文发表刊物:《中国蒙医药》2017年第12期
论文发表时间:2017/11/6
标签：原体论文; 沙眼论文; 衣原体论文; 荧光论文; 定量论文; 淋病论文; 细小论文; 《中国蒙医药》2017年第12期论文;