杨平[1]2003年在《维生素C、顺铂影响CAOV3细胞端粒酶活性作用的研究》文中指出前言 端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，它由串联排列TTAGGG碱基的重复序列组成，具有维持染色体稳定性和完整性、固定染色体在细胞内位置的作用。端粒的重复序列在每次细胞分裂后缩短，当长度短到一定程度时，细胞停止分裂进入衰老和死亡。端粒的合成依赖于端粒酶，它能利用自身RNA为模板逆转录合成染色体末端的端粒DNA，从而维持端粒一定的长度。多数正常体细胞不表达端粒酶活性，多数永生化细胞、恶性肿瘤细胞表达端粒酶活性，端粒酶的重新表达在细胞永生化及癌变过程中起着重要的作用。 卵巢癌是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的肿瘤，卵巢癌的发展及转移也与端粒酶活性相关。顺铂(DDP)是卵巢癌化疗中最有效的基础药物之一，它是一种类烷化剂的抗肿瘤药物，为细胞周期非特异性药物，可作用细胞周期的任一时相，利于临床的联合用药，但由于DDP的诸多毒副作用及卵巢癌细胞易产生对其耐药性，常使化疗效果不满意。研究发现，人体内必须的营养物质维生素C(VC)可降低抗肿瘤药的毒副作用，并具有抗肿瘤的能力，给各类晚期癌症患者大剂量注射VC，具有显着缓解肿瘤患者症状并延长寿命的作用，但目前对VC抗肿瘤作用机制还不清楚。 本文采用DDP、VC作用于卵巢癌细胞，以细胞端粒酶为靶向研究DDP、VC二者抗肿瘤的作用机制，以及VC对DDP抗肿瘤作用的影响，为肿瘤的临床治疗提供科学依据。 材料与方法 1．材料 1．1材料：CAOV3细胞(卵巢癌细胞株) 互．2试剂和仪器：Rnase、MTI’、SDS、TEMED、Acrylamide、Bi－sacrylamide、CHAPS、AEBSFB、Tas DNA聚合酶、dNTP＊s和 Cx弓物＊厕铂oBR322 DNA／Hae Ill Markers，其它试剂为国产分析纯。 752C型紫外可见光光度仪、相差显微镜3CR－4型高压电泳仪JHZ－95台式恒温震荡箱JLX－800酶标仪、HRSPO520型PCR扩增仪SORVALL高速离心机人O。孵箱、超净台等。 2．方法 2·ICAOV3细胞的培养 2．2 DDP、VC诱导 CAOV3细胞 2．3 Mrt法测定细胞活力 2．斗 蛋白定量：采用酚试剂法测定蛋白。 2．5 端粒酶纯化 2．6 TMP法测定端粒酶活性 结 果 1．细胞毒性试验（M’IT法）DDP、AA—DDP对肿瘤细胞株CAOV3有不同程度的毒性作用，MTh测得IC。。分别是：DDP为8 pmoVL、VC（10 pmol／L）－DDP为 7 pmoUL、VC（50卜moUL）－DDP为4pmol／L；致死剂量分别是：DDP为200pmo＊L、VC（10pmoVL）－DDP为160pmoVL、VC（50pmol／L）－DDP为120pmoVL。DDP浓度为30p moVL时，死亡率是72．9助JC（10pmoVL）－DDP为73．8％、VC（50卜moVL）－DDP为90．3％。 2．DDP对端粒酶活性的影向：当200mol／L DDP作用 CAOV3细胞4小时，即刻收集细胞，药物未对细胞端粒酶活性产生抑制；在细胞经过4小时DDP处理，去除药物再培养20小时，端粒酶活性完全抑制；8 rmol／L DDP作用细胞 24 ／J’时，端粒酶活性部分抑制；当sumol／L DDP作用细胞120／J’时，对端粒酶活性显着抑制 ·2·作用。 3．VC和 VC－DDP对端粒酶活性的改变：10 pmOUL和50pmoUL VC作用 CAOV3细胞60／J’时，都不改变细胞端粒酶活性，但二者可加强对端粒酶活性的抑制作用，且50pmol／L VC加强＊＊P对端粒酶活性的抑制作用比10卜mo＊L＊C更显着。 讨 论 由于抑制端粒酶活性或人为地缩短端粒的长度，都可使细胞活力及不死性受到损伤，耐药的肿瘤细胞端粒酶不发生改变等原因，以端粒酶做为肿瘤治疗的目标已成为研究的热门。化疗是卵巢癌最主要治疗方法，而DDP是卵巢癌诸多化疗药物中最有效的药物之一，其细胞毒性的分子机制为：DDP分子中的一个氯原子与鸟膘吟的第7位氮原子（G－·N＊结合，另一个氯原子可以和蛋白质或一些小分子的亲核基团如－NH卜－SH结合，造成DNA链内或链间交联，或DNA一蛋白交联，形成了铂－DNA络合物，导致＊＊A致命损伤而发挥作用。本实验通过用12O卜mo＊L和speVL DDP处理人CAOV3细胞，结果说明两种浓度的 DDP对端粒酶活性都有抑制作用。细胞经过120卜mol／L DDP处理4／J’时，直接检测无端粒酶活性的变化；但去除DDP经过20小时再培养后端粒酶活性受到显着抑制，这说明＊＊P对端粒酶活性抑制可能是一个时间依赖性过程，即细胞需要经过一定的时间才表现出端粒酶活性受到抑制。实验还发现，用 120pmol／L和spmoVL DDP分别作用于CAOV3细胞，24小时端粒酶活性分别下降88％和48％；而用spmoUL DDP作用细胞 120／J’时后，端粒酶活性也可下降达84％。可见，DDP能有效抑制端粒酶活性，随浓度递增和诱导时间的延长，对端粒酶活性抑制越显着。在晕丸癌的研究中发现：DDP的抑制作用是由于此药物进人细胞后和DNA连接，形成G－Pt－G的连接方式。而端粒和端粒酶RNA复合物（hTR）也富含 ·3·G，因此DDP对端粒酶活性的抑制亦可能是通?
杨平, 刘永林, 孙莉莉[2]2007年在《维生素C对顺铂诱导卵巢癌CAOV3细胞凋亡的影响》文中指出目的探讨维生素C是否能影响顺铂诱导卵巢癌CAOV3细胞凋亡,以及它对细胞内端粒酶活性的影响。方法MTT法和流式细胞术检测细胞生长和凋亡的情况,TRAP-ELISA法测定端粒酶活性变化。结果DDP联合AA作用组比单独用DDP组细胞凋亡率明显增高,端粒酶活性明显降低。单独10!mol/LDDP处理组细胞生长未受到明显抑制,但联合AA后其生长受到抑制。结论AA能增强DDP诱导卵巢癌CAOV3细胞凋亡,并增强DDP对细胞内端粒酶活性的抑制作用。
赵静[3]2010年在《叁氧化二砷联合全反式维甲酸抗人卵巢癌细胞机制的研究》文中提出卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤之一,在治疗难题中的主要原因是化疗药物的耐药及化疗药物所带来的全身毒副作用,限制了患者的依从性,降低了患者的生活质量,甚至导致化疗的失败。因此,寻找新的、具有协同作用的化疗药物越来越引起人们的关注。叁氧化二砷(arsenictrioxide, AS2O3)是中药复方青黛、砒霜等的主要有效成分。AS203通过降解早幼粒细胞白血病基因PML和维甲酸受体α基因RARα融合所表达的PML-RARα融合蛋白,调节谷胱甘肽还原系统、发挥细胞周期抑制和促凋亡等多种途径发挥抗肿瘤作用。目前,AS203已经应用于白血病的临床治疗,主要用于治疗复发及难治性急性早幼粒细胞白血病APL。维甲酸类化合物(retinoids,即维生素A衍生物之称)通过激活相应的受体,识别靶基因的应答部位,以蛋白质-核酸的结合形式调控特定基因的转录活性,发挥细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学效应。天然的全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)是生物学活性最强的维生素A的衍生物,已广泛应用于临床皮肤癌的治疗。ATRA的抗肿瘤作用的证实被誉为九十年代国际抗癌药物的叁大发现之一,具有很强的诱导分化肿瘤细胞作用,已成为治疗APL的一线药物。近年来,细胞周期及其相关的周期调节蛋白已成为肿瘤发病机制及化疗药物研发的热点,在细胞周期的进程中存在多个调控点,其中G1/S和G2/M调控点最为重要,细胞增殖除受到细胞周期的几个调控点作用外,还受到细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cycle dependent kinases inhibitors, CKIs)的调控,常见的如P27和P16。P27蛋白通过抑制细胞周期蛋白的活性和细胞周期蛋白激酶(cycle dependent kinases, CDKs)的激活,发挥抑制细胞周期进程的作用。因此,细胞周期蛋白的异常表达和CKIs的缺失将使细胞周期发生紊乱,导致细胞增殖失控。关于细胞周期调节因子异常与肿瘤发病机制之间的研究多集中于G1/S期,对G2/M期调节的研究较少,因此,对细胞周期G2/M期调控机制的研究,有助于我们更好地了解肿瘤的发病机制及合理的应用化疗药物。关于卵巢癌的临床治疗,目前仍多采用以顺铂为基础的两种或多种化疗药物的联合应用,药物之间的关系多为单纯性的相加作用,即化疗作用相加的同时全身的毒副作用也是相加的,能否通过寻找具有协同作用的两种药物,发挥治疗作用的同时,毒副作用不会增加,甚至降低,从而提高卵巢癌患者的生活质量,一直是我们关心的热点。目的本实验采用ATRA不敏感型、人浆液性上皮性卵巢癌细胞株SKOV3细胞为实验对象,拟通过AS203及ATRA单独或联合用药,观察不同药物组对SKOV3细胞的抑制、杀伤与促凋亡效应的影响,探讨两种药物间的相互作用及与细胞周期负性调控蛋白P27之间可能的关系,为卵巢癌的化疗提供新的思路及理论依据。方法以ATRA不敏感型、人浆液性上皮性卵巢癌细胞株SKOV3细胞为实验对象,实验分为：正常对照组(含10%小牛血清的1640培养液)、ATRA组(1.0μmol/L ATRA)、AS2O3组(5.0μmol/L AS2O3)和联合组(1.0μmol/L ATRA和5.0 u mol/L AS2O3),分别按分组培养的所需时间取样。四甲基偶氮唑蓝光吸收法MTT,检测不同组处理24-96h对人卵巢癌SKOV3细胞的增殖的影响；采用流式细胞术,观察不同药物组作用48h对人卵巢癌SKOV3细胞周期阻滞、凋亡及坏死情况的影响；通过免疫荧光法检测不同药物组、不同时间点,人卵巢癌SKOV3细胞中细胞周期负性调控蛋白P27的表达情况。本实验采用SPSS13.0统计软件进行数据处理,检验水准为α=0.05。结果1 AS2O3、ATRA单独或联合用药对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响四甲基偶氮唑蓝光吸收法结果显示：ATRA组中SKOV3细胞的生长抑制状况,与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。AS2O3组和联合组中,细胞生长受抑制,与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。联合组与AS2O3组相比,细胞生长受抑制,差异有统计学意义(P<0.05)。2 AS2O3、ATRA单独或联合用药48h对人卵巢癌SKOV3细胞周期、凋亡率及坏死率的影响流式细胞术证实：SKOV3经不同药物组处理后,细胞周期阻滞不同,以48h最显着。AS203组和联合组均出现G0/G1期和G2/M双重阻滞,,与对照组比较,差异均有统计学意义（P<0.01)。联合组与AS203组相比,G2/M期阻滞更明显,差异有统计学意义(P<0.01)。Annexin V/PI染色检测凋亡,AS203组和联合组中,细胞凋亡率和坏死率均增强,与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。联合组与AS203组相比,凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.01),坏死率无增加,反而降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3 AS2O3、ATRA单独或联合用药对人卵巢癌SKOV3细胞中P27蛋白表达的影响细胞免疫荧光化学法显示：不同药物组SKOV3细胞中P27蛋白的表达不同,AS203组和联合组中P27蛋白的表达有时间依赖性,48h表达最强,96h仍然维持在较高水平,与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)；联合组中P27蛋白表达量更为明显,与AS203组相比,差异有统计学意义差异(P<0.01)。结论(1)AS203上调人卵巢癌SKOV3细胞中P27蛋白的表达,提高SKOV3细胞对ATRA药物的敏感性。(2)AS203和ATRA联合应用发挥协同抑制作用,出现细胞周期G0/G1期和G2/M期双重阻滞现象,凋亡率增加,坏死率降低,为卵巢癌新药的研发及化疗方案的合理应用提供理论依据。
参考文献：
[1]. 维生素C、顺铂影响CAOV3细胞端粒酶活性作用的研究[D]. 杨平. 中国医科大学. 2003
[2]. 维生素C对顺铂诱导卵巢癌CAOV3细胞凋亡的影响[J]. 杨平, 刘永林, 孙莉莉. 中国现代医生. 2007
[3]. 叁氧化二砷联合全反式维甲酸抗人卵巢癌细胞机制的研究[D]. 赵静. 郑州大学. 2010