唐喜玲
河南省焦作市人民医院检验科 河南焦作 454000
摘要：目的：探讨不同样本采集方法检测EBV DNA（Epstein-Barr virus DNA，EBV DNA）在EBV感染中的阳性率。方法：使用荧光定量PCR同时检测85例疑似EBV感染患者咽拭子、外周全血、血浆及单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中的EBVDNA，比较其检出率和病毒载量。结果：疑似EBV感染患者咽拭子、PBMC、全血及血浆四种样本中的阳性率依次降低，差异具有统计学意义。结论：在EBV感染初期，荧光定量PCR检测咽拭子和PBMC中的EBVDNA对EBV感染快速诊断有着重要价值。
关键词：EB病毒检测；阳性率；咽拭子；单个核细胞；全血；血浆
EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是小儿感染性疾病的较为常见的病原体，感染时多无明显症状或引起轻度咽峡炎和上呼吸道感染，EBV感染后具有长期携带和条件致病的特点，当免疫功能低下时EB病毒会造成再次感染[1]。除了能引起传染性单核细胞增多症以外，EBV还能引起组织细胞增生症、吞噬细胞综合征等较严重疾病[2]。荧光定量PCR能早期、快速诊断EBV感染，但很少见不同样本采集方法检测EB DNA的比较[3]。本文对疑似感染EBV患者的咽拭子、外周血单个核细胞、全血及血浆同时进行检测，比较了不同样本采集方法阳性率及EB DNA载量进行统计分析，现报道如下。
1 资料与方法
1.1标本来源
选取2017年11月至2018年2月收治的疑似EBV感染患儿85例为实验组。收集同期60名健康体检个体作为对照组。咽拭子标本采集方式：用咽拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，立即放入采样管送检。血液样本采集方式：抽取患者空腹静脉血3ml，注入含EDTA的抗凝管中，立即充分颠倒混匀5～10次，密封送检，标本保存于﹣20℃待测。标本处理方式：以1600g离心标本，取血浆50ul备用；取全血1ml至干燥离心管，加入生理盐水1ml轻轻摇匀，取干燥离心管加入500ul淋巴细胞分离液，将稀释全血沿离心管壁缓慢加入离心管，2000rmp离心20min，吸取白细胞层制单个核细胞悬液备用。患者组和对照组每人均取血浆50ul、单个核细胞悬液及抗凝全血，采用全血基因组DNA抽提液抽提DNA，操作步骤严格按照说明书来进行。
1.2 仪器和试剂
实时定量PCR仪为美国应用生物系统公司生产的ABI 7500，高速冷冻离心机来自美国Backman仪器有限公司。EB DNA荧光定量试剂盒由广州中山医科大学达安基因股份有限公司提供，严格按说明书操作。
1.3 结果判读与统计分析
不同类型的标本均使用试剂盒自带的标准品进行定量分析，以＞400拷贝数/ml判读为阳性，反之为阴性。应用SPSS16.0进行统计学分析。实验组和对照组咽拭子、全血、血浆及PBMC中EB DNA的阳性率比较采用χ2检验，实验组检测结果之间的一致性采用Kappa一致性检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 不同标本类型阳性率的比较
咽拭子、PBMC及外周全血EBV DNA阳性依次减低。见表1。
3讨论
EB病毒具有普遍易感性和潜伏性，感染EBV的患儿可出现发热、传染性单核细胞增多症，甚至会引起较严重的恶性疾病。早期、正确的诊断对疾病的治疗有重要意义[4-5]。
本研究对60例健康体检者EBV DNA进行检测发现，4例PBMC中EBV DNA阳性，而其本人却无感染症状，分析原因可能是较远期感染后转为潜伏阶段，EB病毒可在淋巴细胞中长期存在，这与相关报道相一致，健康体检者阳性率达6.67%，在临床诊断时可导致难以区分潜伏感染和现症患者。研究显示，在疑似感染者中，实验组人群在相同时间点分别取咽拭子、单个核细胞、血浆及全血标本进行EB DNA检测，不同标本EBV的检出率明显不同，咽拭子最高，单个核细胞高于血浆和外周全血。
本次研究中，将检测EBV DNA常见的标本类型进行了同时收集、检测，并比较了检测结果，证实疑似病例咽拭子EBV DNA阳性率明显高于PBMC、外周全血及血浆标本含量。研究还发现，健康组亦可检出EBV DNA，以咽拭子EBV DNA阳性率最高达13.33%，PBMC中也存在一定比例的升高，国内学者报道正常人外周血细EBV DNA阳性率为7.4%，这与本研究较一致，结果提示EBV可长期潜伏于正常人体的鼻咽部和淋巴细胞，大部分人群因咽拭子EBV DNA拷贝数太低，未能到达检测下限。此外，PBMC EBV DAN阳性率达22.35%，其对应的血浆和全血EBV DAN阳性率分别为17.65%和16.47%，且发现血浆和全血EBV DNA阳性的标本对应的PBMC EBV DAN接近全部阳性；比较病毒含量，可发现PBMC EBV DAN含量较后两者更高，提示现症感染者进行PBMC EBV DAN检测更具有敏感性和诊断价值。血浆和外周血EBV DNA检测主要的对象为血浆中的游离的病毒，其阳性代表病毒血症，不能够检测出血细胞中携带的EB病毒，所以，血浆中的阳性率较单个核细胞和咽拭子低。单个核细胞以T淋巴细胞为主，也包括B淋巴细胞、NK细胞及单核细胞等。研究证实，EB病毒对B淋巴细胞较为敏感。
目前，国内采集标本时，针对鼻咽癌患者多采用咽拭子，而其它疑似病例如传染性单核细胞增多症、弥漫性大B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤等多采用外周血检测。我们发现以外周全血或血浆检测EBV DNA时存在阳性率偏低，这种假阴性可导致漏诊、误诊，延误病情；相对外周全血和血浆，PMBC相对阳性率较高，但是，在抽提PMBC时，存在操作繁琐、干扰因素多，还和操作熟练程度有密切关系，这些相对于咽拭子检测都是弊端。此外，从临床操作可行性上讲，疑似EBV感染者中婴幼儿占较高比例，咽拭子更易操作且痛苦较少。我们推测，这和EBV在人体分布有密切关系，特别是疾病的早期，EBV最早感染咽部，且在此部位有大量淋巴细胞浸润，伴随病情的发展咽部EBV侵人血液，才被检测出。
综上，疑似患者组不同类型标本之间EBV DNA阳性率和含量存在较大差异，提示在临床检测时可考虑采用咽拭子提高检出率。早期、准确诊断可减低患者的经济负担和身体痛苦，有重要的经济效益和社会效益。
参考文献：
[1]刘春梅，张庆，田文君，等.EBVDNA检测在小儿EBV感染相关疾病诊断中的意义[J].中华检验医学杂志，2016，39（4）：256-261.
[2]喻晶，王琳，卢丽华，等.淋巴细胞及血浆EB病毒DNA在EBV感染相关疾病中表达的研究[J].现代检验医学杂志，2017，32（6）：15-18.
[3] 黄宇，孙鸣，胡斌，等.血浆和外周血单个核细胞中EBV-DNA载量在儿童原发传染性单核细胞增多症早期诊断中的作用[J].中华检验医学杂志，2017，40（6）：443-446.
[4]夏妍，金茜，李兴库，等.黑龙江省儿童EB病毒的感染情况及疾病谱分析[J].现代生物医学进展，2016，16（18）：3569-3573.
[5] 王惠霞.外周血单个核细胞EB病毒负荷的荧光定量PCR检测在评估儿童传染性单核细胞增多症病情中的临床意义[J].中国优生与遗传杂志，2016（12）：34-36.
论文作者:唐喜玲
论文发表刊物:《健康世界》2018年19期
论文发表时间:2018/11/20
标签：血浆论文; 细胞论文; 标本论文; 淋巴细胞论文; 阳性论文; 病毒论文; 阳性率论文; 《健康世界》2018年19期论文;