周小燕[1]1993年在《溶酶体保护蛋白的基因突变及其结构与功能关系的研究》文中认为半乳糖苷唾液酸贮积症(galactosialidosis)，简称GS病，是一种溶酶体贮积症，是由于保护蛋白基因突变所致的常染色体隐性遗传病。此病的临床表现具有高度的异质性。以往没有弄清楚该病的基因突变。鉴定和分析不同临床表型的GS病人的保护蛋白基因突变，有助于弄清该病的分子机理以及保护蛋白结构与功能的关系。 人保护蛋白以54 kDa前体形式合成，在溶酶体中加工成两个亚单位的成熟型，亚单位以二硫键相连。至今已知此蛋白有两个功能：一是保护功能，即通过与β-半乳糖苷酶及神经氨酸酶结合并保护它们在溶酶体中的活性和稳定性；另一是组织蛋白酶A样羧基肽酶活性。而且这两个功能是分开的。后者与最近报道的具有降解生物活性肽的功能的脱酰胺酶／羧基肽酶的N-端氨基酸序列相同。在目前分析过的GS病人中，都缺乏保护蛋白的蛋白酶功能，因此GS病可看作是第一个与蛋白酶缺乏有关的溶酶体贮积症。 为研究基因突变与相应突变蛋白的结构与功能及其病理变化的关系，本论文进行了以下实验研究并加以讨论。 ①本研究在国际上首次鉴定了GS病的基因突变。策略是从分析GS病人的保护蛋白基因转录水平开始，如病人含相应的mRNA，则应用RT-PCR法扩增相应的cDNA，经克隆后或PCR扩增产物直接分析cDNA序列而找出突变。然后用PCR扩增含突变的相应基因组DNA区域，以证实在cDNA中发现的结果。如病人缺失相应的mRNA，则用PCR扩增基因组DNA，分析每个外显子及外显子／内含子交界处的保守序列。应用以上策略发现了3个点突变，2个为碱基替换，1个为碱基缺失；前者
佚名[2]2009年在《国家自然科学基金委员会生命科学部2009年度资助面上基金项目一览表》文中研究表明
柏干荣[3]2003年在《失血性休克大鼠肠上皮细胞线粒体DNA COX基因、表达和功能改变及Rg1干预的研究》文中研究表明失血性休克可导致机体各组织器官损伤，其中肠道是最容易受损伤的主要靶器官。失血性休克后肠黏膜上皮细胞缺血缺氧，能量代谢障碍是不可逆性休克和多器官功能衰竭(MSOF)的重要原因。线粒体是能量转换的细胞器，在维持细胞正常的能量代谢、结构和功能方面具有重要作用。同时，线粒体又是真核细胞内含有核外遗传物质——线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的特殊细胞器，有一套不同于核基因表达的复制、转录和翻译体系。mtDNA为一16596bp的闭环双链DNA分子，编码参与氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation，OXPHOS)过程的13种多肽，细胞通过OXPHOS产生的ATP占细胞生命活动所需能量的90％以上，因此mtDNA对维持细胞的正常功能起重要作用。线粒体编码基因中最大的3个亚基(COX Ⅰ、COX Ⅱ、COX Ⅲ)由mtDNA编码。细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase，COX)是位于线粒体内膜上呼吸链末端的限速酶，是唯一能将电子传给氧分子的细胞色素复合物，是线粒体呼吸链OXPHOS过程中的关键酶，其损伤可直接影响线粒体功能。然而这些损伤是发生在何环节?是基因水平、表达水平、还是蛋白质水平?是否是新的药物治疗靶点?至今尚不清楚。损伤后对其蛋白质结构、功能有无影响和三七皂甙单体Rg1的调节保护作用如何也未见报道。 目的： 一、研究失血性休克大鼠缺血缺氧后肠上皮细胞线粒体DNA COX Ⅰ、COX Ⅱ、COX Ⅲ基因损伤(突变)及其表达改变和突变后对其编码的COX酶蛋白质空间结构的改变及其对酶功能的影响，从基因、转录、翻译水平探讨缺血缺氧后COX在线粒体有氧呼吸功能改变中的作用，阐明其结构和功能的关系，揭示细胞缺血缺氧性损害中能量代谢障碍的分子机制。 二、研究三七皂甙单体Rg1对失血性休克大鼠缺血缺氧后肠上皮细胞线粒体损伤的保护作用及其对COX活性和相关基因表达的影响，从线粒体的形态、功能、基因表达及失血性休克大鼠存活率等多方面探讨Rg1对缺血缺氧性线粒体损伤的保护作用第三军医大学博士研究生论文及其机理。 方法: Wistar大鼠120只，按改良Wigger’s法制作失血性休克模型，动物随机分为失血性休克组、治疗组、对照组，于失血性休克后不同时相提取肠上皮细胞线粒体、mtDNA、线粒体蛋白、总RNA及制备电镜标本，采用PCR产物直招狈峙法街贝明易上皮细胞mONA COXI、COXn、COXlll基因损伤(突勿，并不佣生物信息学技术、计算机同源模建的方法进行肠上皮细胞mtDNA COX基因突变位点与其编码蛋白质结构的改变及其对功能的影响;采用RFPCR场劫卸明元勺彭田胞川ONA COXI、COXn、COXllllllRNA白年友达变化;采用Westem一lot法检测肠上皮细胞线粒体COXI蛋白的表达变化;采用电镜体视学图象定量法分析检测线粒体形态特征变化;采用Clark氧电极法检测线粒体呼吸功能;采用紫外分光光度法检测COX活性;从线粒体的形态、功能、基因表达及失血性休克大鼠存活率等多方面探讨三七皂贰单体Rgl对缺血缺氧性线粒体损伤的保护作用。 结果: 一、mtDNA基因测序结果显示，失血性休克缺血缺氧5h，大鼠肠上皮细胞mtDNA COxl序列，从5545到6245出现了13个散在性点突变，5692与5693之间出现一插入突变(5 692 t 5693)，从6260到6838出现了较多的散在性点突变，且突变类型多为G、A转换;eoX 11亚基基因在7 191(T~C)、7212(T一e)、7235(o一A)、 7356(A~G)、7483(A一G))、7542(C一G)出现点突变;COXm亚基基因未出现突变。 二、计算机模拟构建COX基因突变后的空间结构显示，mtDNA COXI亚基基因的突变，使突变区的30一32肤段发生了明显改变;COXn亚基基因的突变，使其二级结构片段之间的连接区域(肤段52一59)发生了较大的改变，从而导致整个cox的空间结构改变。 三、Rl，一PCR结果显示，失血性休克缺血缺氧lh肠上皮细胞COX 1 mRNA表达量开始逐渐增加，3h达高峰，之后逐渐降低，到休克晚期sh时，非常显著低于正常对照组(P<0.01)。cOX n mRNA的表达量Zh达高峰，维持到3h，4h时其表达逐渐减少，sh时非常显著低于正常对照组(P<0.01)。COX nl mRNA表达变化不大，在休克晚期表达呈减少趋势。Rgl能非常显著提高CoXI、CoX 11 mRNA的表达量(p<0.01)。 四、大鼠失血性休克th时肠上皮细胞线粒体COXI蛋白表达量已增高，休克2h时表达开始下降，休克5h时，其蛋白表达量非常显著低于正常对照组(P<0.01)。Rgl能非常显著提高其表达(P<0.01)。 五、COX活性测定结果显示，失血性休克后1h大鼠肠上皮细胞线粒体COX活性有所增加，休克2h后COX活性开始下降，之后逐渐降低，到休克晚期sh时，非第三军医大学博士研究生论文常显著低于正常对照组(P<0.01)，Rgl治疗能非常显著提高其活性(P<0.01)。 六、失血性休克2h大鼠肠上皮细胞线粒体三态呼吸(S T3)降低，四态呼吸(S T4)升高，呼吸控制率(RCR)，氧化磷酸化效率(OPR)均下降，到休克晚期sh时，呼吸控制率非常显著降低(P<住01)。Rgl治疗组ST:升高，ST4降低，RCR和OPR非常显著提高(p<0 .01)。 七、失血性休克缺血缺氧sh，大鼠肠上皮细胞线粒体
苏倩[4]2017年在《Akt信号通路通过激活TFEB而抑制氧化应激诱导的神经细胞凋亡》文中研究表明机体内氧化系统和抗氧化系统失衡所引起的氧化应激(oxidative stress,OS),可造成细胞内蛋白质、RNA、DNA的损伤。氧化应激过程中产生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)介导脂质过氧化、降低NO生物活性、以及激活炎症基因等一系列病理生理学反应。越来越多的研究表明,氧化应激可以诱发多种疾病,例如神经退行性疾病(neurodegenerative disease)、动脉硬化、以及糖尿病等。在中枢神经系统中,过量的ROS可以导致小胶质细胞活化、神经元以及星形胶质细胞的损伤。帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种中枢系统慢性退行性疾病,其病理特征为多巴胺神经元选择性和渐进性退化以及由氧化应激诱发的神经元凋亡。Akt,又称蛋白激酶B(PKB),是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。该激酶可以调控细胞增殖、细胞迁徙以及细胞凋亡。最近有研究表明,Akt信号通路介导神经元的存活,对PD患者的神经元有保护作用。例如,Akt/Rheb的激活可以使中枢神经系统的轴突再生,并且在PD病人的脑组织中,Akt的表达和磷酸化水平明显降低。对Akt作用机理的研究证实,Akt可以通过磷酸化多种凋亡相关蛋白来抑制细胞凋亡。但Akt信号通路对氧化应激诱导的神经细胞凋亡有何影响目前尚不清楚。TFEB(transcription factor EB),是亮氨酸拉链b HLH-Zip转录因子家族中Mi T/TFE家族中的成员。有文章报道,TFEB参与溶酶体合成和功能的调节,调控细胞自噬,并与神经退行性疾病、癌症、以及溶酶体贮积症等多种疾病相关。最近有报道称,过表达TFEB可以防止MPTP诱导的多巴胺神经元凋亡;TFEB的激活能减轻α-synuclein在脑组织中的异常聚集以及氧化应激和炎症造成的神经细胞的损伤。尽管既往研究已经证实,Akt信号通路和TFEB均参与了细胞存活和细胞凋亡的调节,但是在氧化应激条件下,Akt信号通路和TFEB之间在功能上的联系尚待阐明。本研究旨在探讨Akt信号通路和TFEB之间如何协同拮抗氧化应激诱导的神经元细胞凋亡。第一部分TFEB介导Akt信号通路对过氧化氢诱导的神经细胞凋亡的抑制作用目的:探讨Akt信号通路对过氧化氢诱导的神经细胞凋亡的影响,明确Akt信号通路和TFEB在拮抗过氧化氢诱导的神经细胞凋亡中的相互关系。方法:1 MTT实验检测不同浓度的过氧化氢对SH-SHY5Y细胞活力的影响及其与Akt信号通路的关系。2 Western blot检测不同浓度的过氧化氢对Akt磷酸化及其与PARP活化之间的关系。3流式细胞术检测阻断Akt信号通路后过氧化氢对细胞凋亡的影响,以及过表达TFEB阻断或激活Akt信号通路对过氧化氢诱导的细胞凋亡的影响。4免疫共沉淀实验检测TFEB与Akt的结合。结果:1 Akt信号通路在过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡中受到抑制因Akt信号通路介导生长因子诱导的神经细胞的生存,且过多的ROS损伤神经细胞,所以我们首先检测Akt信号通路是否在过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡中受到的影响。用不同浓度的过氧化氢处理SH-SHY5Y细胞,MTT实验结果显示,过氧化氢浓度在100μM和200μM时,SH-SHY5Y细胞活力轻微增加;而过氧化氢浓度在400μM和800μM时,SH-SHY5Y细胞活力显著降低。Western blot结果显示,当SH-SHY5Y细胞给予400μM和800μM的过氧化氢时,Akt磷酸化水平显著降低,说明在过氧化氢诱导SH-SHY5Y细胞凋亡过程中Akt信号通路受到抑制。流式细胞术分析结果显示,当用Akt和PI3K抑制剂wortmannin预处理后,再给予400μM的过氧化氢刺激时,氧化应激诱导的细胞凋亡明显加重。Western blot结果也显示,Akt和PI3K抑制剂可以完全阻断Akt的磷酸化,并且细胞凋亡标志物的剪切即cleaved-PARP显著增加。另外,用持续激活的HA-Akt-CA或它的失活突变体HA-Akt-KD转染SH-SHY5Y细胞后,给予过氧化氢刺激。MTT结果显示,HA-Akt-CA转染的SH-SHY5Y细胞受到过氧化氢刺激后,其凋亡率显著降低。综上所述,这些结果表明,Akt信号通路在氧化应激诱导的神经细胞凋亡中受到抑制。2 TFEB抑制过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡与Akt信号通路相关因为TFEB抑制细胞凋亡,所以我们进一步检测过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡是否受TFEB的影响。用重组腺病毒Flag-TFEB感染SH-SHY5Y细胞后,用Western blot和流式细胞术检测细胞凋亡。在TFEB过表达的细胞中,过氧化氢引起的PARP的活化受到抑制,并且Akt抑制剂能减少TFEB过表达抑制的PARP的活化。同样,在TFEB过表达的细胞中,再给予Akt信号通路的激活剂EGF时,过氧化氢引起的PARP的活化被取消。我们发现,不管是否给予过氧化氢刺激,在SH-SHY5Y细胞中过表达TFEB均会显著抑制细胞凋亡。为了进一步检测TFEB抑制细胞凋亡是否与Akt信号通路相关,用Akt inhibitor或Akt激活剂EGF预处理细胞后,再给予过氧化氢刺激。流式细胞分析结果显示,过表达TFEB可以显著减少由Akt inhibitor和过氧化氢共同引起的细胞凋亡。相反,Akt信号通路的激活剂EGF减少氧化应激引起的细胞凋亡,过表达TFEB的细胞再给予EGF处理可进一步减少过氧化氢诱导的细胞凋亡。这些结果表明,TFEB抑制氧化应激诱导的细胞凋亡受Akt信号的调节。3 TFEB与Akt存在相互作用上述研究证实,TFEB抑制SH-SHY5Y细胞凋亡受Akt信号通路的调节,我们进一步研究Akt是否可以直接与TFEB相互作用。用野生型的HA-Akt-WT和GST-TFEB转染细胞,GST pull down实验结果显示,HA-Akt可以直接与GST-TFEB结合,但不与GST相互作用。用免疫共沉淀实验检测内源性的Akt是否与TFEB结合,结果显示,在TFEB抗体的免疫沉淀物中检测到Akt蛋白的存在。为了进一步验证TFEB的哪个结构域与Akt结合,用可表达全长TFEB及其不同结构域的表达载体GST-TFEB-FL/GST-TFEB-1-294/GST-TFEB-295-476和HA-Akt-WT共转染HEK293T细胞,通过GST pull down实验检测全长TFEB(TFEB-FL)和各种截短突变体与Akt的结合情况。结果显示,全长TFEB(TFEB-FL)和包含HLH结构域的N端结构域(TFEB-1-294)可以与Akt的结合。当TFEB的N端结构域(TFEB-1-294)被消除时,突变体丧失与Akt的结合。为了进一步检测TFEB与Akt的结合是否受Akt活性的影响,将持续激活型Akt(HA-Akt-CA)/失活型Akt(HA-Akt-KD)/部分失活型Akt(HA-Akt-*KD)和GST-TFEB共转染HEK293T细胞,GST pull down结果显示,TFEB与不同活性形式的Akt均可结合。持续激活型Akt与TFEB结合能力最强,失活型Akt与TFEB的结合最少。为了进一步检测Akt不同结构域与TFEB结合的实验结果显示,TFEB不能与Akt-PH或者Akt-Cat结合,但与Akt-tail具有较强的结合能力。小结:1 Akt信号通路在过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡中受到抑制。2 TFEB通过与Akt相互作用介导过氧化氢对SH-SHY5Y细胞凋亡的影响。第二部分Akt磷酸化TFEB的Ser467位点目的:探讨Akt是否可以磷酸化TFEB以及Akt对TFEB进行磷酸化修饰的位点。方法:1用Akt、PI3K和ERK抑制剂处理细胞,Western blot检测TFEB的磷酸化;在SH-SHY5Y细胞中表达TFEB和TFEB-S467A并给予insulin或Akt inhibitor处理,Western blot检测TFEB-S467位点的磷酸化。2用TFEB截短突变体和不同磷酸化位点突变体转染细胞,Western blot检测Akt抑制剂和激活剂insulin对TFEB-S467磷酸化的影响。3体外Akt活性实验检测TFEB与Akt共孵育后TFEB-S467的磷酸化。结果:1 Akt磷酸化TFEB分别用PI3K抑制剂Wortmannin、Akt inhibitor和ERK抑制剂PD98059预处理过表达TFEB的细胞,然后给予insulin刺激,用p-Akt-substrate抗体检测TFEB的磷酸化。Western blot结果显示,给予insulin刺激后,Akt-Ser473的磷酸化水平和Akt底物的磷酸化水平显著升高,PI3K和Akt抑制剂能取消insulin对TFEB和Akt底物磷酸化的诱导,ERK的抑制剂不影响它们的磷酸化。GST pull down实验结果显示,持续活化型的Akt与Akt底物的结合多于野生型Akt和失活型的Akt。用GST-TFEB转染HEK293T细胞后,再分别给予insulin或者Akt inhibitor刺激。结果显示,insulin处理后Akt-Ser473和Akt底物的磷酸化水平升高;而Akt inhibitor抑制Akt-Ser473和Akt底物的磷酸化水平。另外,来源于HEK293T细胞中内源性TFEB经Akt激活剂或者抑制剂处理后得到相同的结果。这些结果表明TFEB可以被Akt磷酸化。2 Akt磷酸化TFEB的Ser467位点构建可表达TFEB不同截短突变体的表达载体转染细胞后,用p-Akt-substrate抗体检测不同截短突变体的磷酸化。结果显示全长TFEB(TFEB-FL)和它的C-端部分(TFEB-320~476,氨基酸320~476)可以被Akt磷酸化,而N-端部分(TFEB-1~319,氨基酸1~319)却不能被Akt磷酸化。说明TFEB-320~476包含Akt磷酸化位点。当TFEB-320~476被进一步截短时,我们发现,TFEB-352~476(氨基酸352~476)可以被Akt磷酸化,提示TFEB被Akt磷酸化的丝氨酸存在于461到476氨基酸之间。进一步把461到476氨基酸之中的丝氨酸都进行点突变。Western blot结果显示,TFEB-S462A和TFEB-S466A以及野生型的TFEB均可以被Akt磷酸化;相反,TFEB-S463/467A和TFEB-S467/469A突变体不能被Akt磷酸化。这些结果表明Ser467是Akt磷酸化TFEB的位点。3 Ser467是Akt磷酸化TFEB的特异性位点为了进一步证实Ser467是Akt磷酸化TFEB的位点,我们制备了特异性的抗TFEB-S467磷酸化抗体,用其检测Akt激活剂或者抑制剂对TFEB-S467磷酸化的影响。免疫沉淀结果显示,给予insulin刺激时,S467A突变体不能被Akt磷酸化,并且不受Akt-Ser473被insulin磷酸化的影响。同样,用Akt inhibitor处理稳定表达Flag-TFEB或TFEB-S467A的细胞株时,TFEB-Ser467和Akt-Ser473的磷酸化都会受到抑制。另外,分别用过Wortmannin、Akt inhibitor和ERK抑制剂PD98059预处理细胞后给予insulin刺激,结果显示,Insulin可以显著增强TFEB-Ser467磷酸化,但在PI3K/Akt抑制剂处理的细胞中不能上调TFEB-Ser467磷酸化水平。体外激酶活性分析也证明突变体TFEB-S467A不能被Akt磷酸化。综上所述,TFEB被Akt磷酸化的位点是Ser467。小结:1 Akt磷酸化TFEB。2 Akt磷酸化TFEB的Ser467位点。第三部分Akt通过磷酸化TFEB而抑制过氧化氢诱导的神经细胞凋亡目的:探讨Akt信号通路抑制过氧化氢诱导的神经细胞凋亡的作用机制。方法:1 Western blot检测SH-SHY5Y或神经元细胞被重组慢病毒TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D感染后,过氧化氢、Akt抑制剂、EGF对PARP活化的影响。2流式细胞术检测SH-SHY5Y或神经元细胞被重组慢病毒TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D感染后,过氧化氢、Akt抑制剂、EGF对细胞凋亡的影响。3小鼠中脑注射重组腺病毒GFP、TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D后,免疫组化染色观察MPTP对小鼠中脑神经元凋亡的影响。结果:1 Akt诱导的TFEB磷酸化抑制过氧化氢引起的SH-SHY5Y细胞凋亡首先,我们用野生型的TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D(相当于持续活化的TFEB)感染SH-SHY5Y细胞,检查过氧化氢对PARP活化的影响。Western blot结果显示,过表达TFEB和TFEB-S467D可以显著减少过氧化氢诱导的PARP活化,而TFEB-S467A对PARP活化没有影响。为了进一步证实TFEB抑制细胞凋亡依赖于Akt信号通路,用Akt抑制剂或激活剂预处理过表达TFEB、TFEB-S467A、TFEB-S467D的SH-SHY5Y细胞后,再给予过氧化氢刺激。Western blot结果显示,过表达TFEB-S467D的细胞与TFEB-S467A细胞相比,过氧化氢或Akt抑制剂引起的PARP活化显著减少;用EGF激活Akt信号通路后,过表达TFEB-S467A的细胞与过表达野生型TFEB和TFEB-S467D的细胞相比,过氧化氢诱导的PARP活化并没有明显减少。另外,流式细胞术结果显示,过表达TFEB和TFEB-S467D可以显著抑制由过氧化氢诱导的细胞凋亡,而S467A突变体失去了这种抑制作用。无论单独给予过氧化氢还是用过氧化氢和Akt inhibitor共同处理细胞,过表达TFEB-S467D均可以减少SH-SHY5Y细胞凋亡。然而用EGF激活Akt后,过表达TFEB-S467A不能抑制过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡。这些结果表明,Akt诱导的TFEB-S467磷酸化是阻抑过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡所必须的。2 Akt诱导的TFEB抑制过氧化氢引起的原代神经元凋亡同时,我们也检测了TFEB-S467磷酸化对过氧化氢诱导的原代神经元凋亡的影响。用TFEB、TFEB-S467A、TFEB-S467D感染小鼠原代神经元细胞后,再用Akt inhibitor和过氧化氢处理细胞。Western blot结果显示,过表达TFEB-S467D的细胞与过表达TFEB-S467A的细胞相比,无论单独给予过氧化氢还是用过氧化氢和Akt inhibitor共同处理细胞,PARP的活化均受到显著抑制。与Western blot结果一致,流式细胞术分析结果也显示,过表达TFEB-S467D可以显著抑制由过氧化氢诱导的原代神经元凋亡。这些结果显示,Akt催化的TFEB-Ser467位点磷酸化对阻抑过氧化氢诱导的原代神经元凋亡是必要的。3磷酸化型TFEB可以保护多巴胺神经元免受MPTP的损伤已经证明,MPTP通过诱导脑组织氧化应激而损伤多巴胺神经元并导致帕金森症。为了进一步探讨TFEB-Ser467磷酸化是否可以保护多巴胺神经元,我们给小鼠中脑注射TFEB、TFEB-S467A、TFEB-S467D腺病毒,使其在脑组织过表达后,观察TFEB-Ser467磷酸化对MPTP诱导的神经元凋亡中的影响。酪氨酸羟化酶的免疫荧光染色结果显示,与未注射的区域相比,过表达TFEB和TFEB-S467D可以显著增加酪氨酸羟化酶阳性神经元细胞的数量,说明细胞存活率增加。这些结果表明,在MPTP诱导的小鼠中脑多巴胺神经元损伤模型中,TFEB-Ser467位点磷酸化可以保护由MPTP诱导的多巴胺神经元损伤。小结:1 Akt诱导的TFEB磷酸化抑制过氧化氢引起的SH-SHY5Y细胞和原代神经元凋亡。2磷酸化型TFEB可以保护多巴胺神经元免受MPTP的损伤。结论:1 Akt信号通路在过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡中受到抑制。2 TFEB通过与Akt相互作用介导过氧化氢对SH-SHY5Y细胞凋亡的影响。3 Akt磷酸化TFEB的Ser467位点。4 Akt诱导的TFEB磷酸化抑制过氧化氢引起的SH-SHY5Y细胞和原代神经元凋亡。5磷酸化型TFEB可以保护多巴胺神经元免受MPTP的损伤。
佚名[5]2007年在《国家自然科学基金委员会生命科学部2007年度资助面上基金项目一览表》文中研究表明
阳洋[6]2017年在《应用病人来源iPSC诱导的神经元细胞对神经变性疾病中线粒体变化机制的研究》文中研究指明背景遗传性痉挛性截瘫(hereditary spastic paraplegia,HSP)是在 1883 年由Strumpell作为一种带有遗传特征的痉挛性截瘫疾病进行首次报道,随后Lorrain对HSP展开了更加详细的分析讨论,因此HSP也称之为家族性痉挛性截瘫或Strumpell-Lorrain综合征。统计研究表明HSP的发病率约为2-10/100000。临床上症状表现多样化,不同病人不同表现,通常还伴有脑瘫,视神经损伤,智力障碍等一些神经系统症状。大多具有的共同特征包括出现下肢萎缩和痉挛性等临床表现,多数学者将其归于遗传性共济失调范畴,约占后者发病总数的1/4。遗传性痉挛性截瘫也是一种遗传上高度异质性的神经系统遗传病,目前已经有76个HSP致病基因位点被定位,确定的HSP致病基因也已达54个。其中最为常见的是Spastin基因突变所致的遗传性痉挛性截瘫4型(spastic paraplegia-4,SPG4),约占常染色体显性遗传的40%。近年来,不断地有一些遗传研究报道新的致病基因突变,其中Tamar Harel.et al报道了一个多发性的线粒体内膜蛋白ATAD3A(ATPase family AAA-domain containing protein 3A)上的突变 c.1582C>T(p.Arg 528 Trp)。结果显示该位点可以导致神经性疾病综合征,症状包括发育迟缓,肌肉张力低下,痉挛,视神经萎缩,轴突神经病以及肥厚型心肌病等。通过全外显子测序,我们对一个HSP患病家系所有的候选致病突变进行检测,发现该家系的两个患者均携带有ATAD3A显性遗传杂合突变c.1064 G>A(p.G355D),其中35岁的母系患者表现为伴随轴突神经病的HSP症状,3.5岁的子系患者表现为运动障碍的脑瘫,并且其发病均始于儿童时期。显性遗传突变ATAD3Ac.1064G>A(p.G355D)位于负责ATP结合的Walker A结构域。目前,关于线粒体内膜AAA(ATPase associated with diverse cellular activities)蛋白 ATAD3A 的功能尚不明确,已知AAA蛋白是通过形成六聚体环状结构发生作用,ATP酶的催化作用需要底物的配合。而后,体外重组蛋白实验也证明了这个突变蛋白的ATP酶活性较野生型表现出显著的降低。为进一步研究ATAD3A c.1064G>A(p.G355D)突变的功能特性,我们分别构建了野生型ATAD3A和突变型质粒,在过表达细胞模型中观察到过度分裂的线粒体形态以及溶酶体的聚集。同样,我们对病人来源的成纤维细胞模型以及多功能干细胞诱导的神经元进行研究分析,也观察到紊乱的线粒体动态平衡以及异常的更多溶酶体。在成纤维细胞模型中发现病人细胞处于一种通过抑制mTOR激活造成的类似饥饿状态,并证明上述这些变化与自噬的上调相关。综上所述,我们得出ATAD3A基因突变可以导致高度异质性的包括HSP在内的一系列显性遗传神经系统疾病,并且拓展了线粒体内膜蛋白ATAD3A与痉挛疾病之间的潜在关系。目的1.收集目标HSP病人临床症状,通过全外显子测序找到潜在的致病基因突变。2.在构建的ATAD3A过表达细胞模型中观察突变体的异常表型。3.在病人特异来源的成纤维细胞模型中观察病人细胞与正常细胞的差异。4.由成纤维细胞诱导的病人特异来源多功能干细胞分化的神经元细胞模型中观察病人细胞相对于正常细胞的异常表型。方法1.应用临床观察和核磁共振技术对目标HSP病人进行临床症状的诊断和判定。2.取病人静脉血液,提取病人全DNA序列,Illumina HiSeq 2500 sequencing进行全外显子测序,利用ANNOVAR程序对测序结果进行分析和筛选,找到潜在致病基因突变。3.生物信息学方法用软件Discovery studio 4.5 software(BIOVIA)对野生型和突变体ATAD3A蛋白结构进行了预测,为进一步的功能研究分析提供线索依据。4.通过体外重组和纯化得到野生型和突变体的ATAD3A蛋白,对其进行ATP酶活性检测(通过测量磷酸盐的释放量来计算ATP酶活性)。5.在体外构建过表达野生型和突变体的ATAD3A质粒,并在正常人的成纤维细胞系统中进行过表达试验,通过蛋白免疫印迹反应进行蛋白检测,通过活体的线粒体和溶酶体追踪以及免疫荧光进行线粒体标记染色形态功能分析。6.利用病人皮肤组织原代培养特异性的成纤维细胞,通过蛋白免疫印迹反应进行蛋白检测,通过活体的线粒体和溶酶体追踪以及免疫荧光进行线粒体标记染色形态功能分析。7.体外利用病人成纤维细胞构建特异多功能干细胞系,通过逆转录病毒将三种附加体质粒包括六种重要因子(OCT3/4,SOX2,KLF4,L-MYC,LIN28和T53 shRNA)整合到细胞进行重编程。8.通过在不同阶段提供营养因子的方法将多功能干细胞特异诱导分化为神经元。9.在病人特异性的神经元中通过蛋白免疫印迹反应进行蛋白检测,通过活体的线粒体和溶酶体追踪以及免疫荧光进行线粒体标记染色形态功能分析。结果1.临床观察目标病人出现明显的下肢萎缩畸形症状,且核磁共振显示脊髓有萎缩变性的形态特征。ATAD3A序列进化上高度保守,且我们研究的目的片段在不同的生物种属和同一蛋白家族之间也都高度保守。2.全外显子测序对潜在的致病基因突变进行筛查,虽然在已知的HSP致病基因中未发现突变,但是发现家系图谱显示第二代母亲患者与第三代孩子患者均携带有 ATAD3A c.1064G>A(p.G355D)突变。3.野生型和突变体ATAD3A蛋白结构预测结果显示了目标突变在距离底物结合部位的γ-磷酸盐小于4A的位置能够引入一个正在进入的ATP磷酸负电荷,这一结果将很可能导致其对ATP的亲和力下降。4.体外重组和纯化ATAD3A野生型和突变体目的蛋白,其ATP酶活性实验结果显示Walker A突变蛋白较野生型有显著的下降趋势。并且野生型与突变体的混合蛋白表现出同样程度的ATP酶活性下降,这一结果表现其负显性调控特性。5.正常人成纤维细胞中过表达野生型ATAD3A,以及K358R和G355D的突变体,同时共转染线粒体标记的绿色荧光蛋白(mitoGFP),蛋白免疫印迹反应结果证实了过表达系统的有效性,进而对线粒体过度分裂的细胞在转染细胞的百分比进行计数,结果显示过表达突变体组相比于过表达野生型ATAD3A组存在更多的线粒体过度分裂细胞。6.在病人皮肤组织原代培养出的成纤维细胞模型中发现尽管ATAD3A蛋白的表达量与正常人无差异,但是在呼吸链复合物亚基II和IV的表达水平较正常组明显升高,而Drpl的表达明显降低,且观察到病人细胞中伴有超极化线粒体。7.对活细胞进行线粒体(Mito-tracker Red)和溶酶体(Lyso-tracker Green)的追踪以及电镜结果显示其形态学变化,发现在病人成纤维细胞中有异常的延长线粒体形态以及更多的溶酶体空洞。8.验证诱导多功能干细胞系,RT-PCR以及免疫荧光染色结果显示iPSC细胞系中均能够内源表达OCT4,SSEA4和TRA-1-60等干细胞表面标记物,且RT-PCR证实了 OriP和EBNA1在干细胞系中不见表达,表明转基因载体已被清除。9.在活细胞中进行线粒体(Mito-tracker Red)和溶酶体(Lyso-tracker Green)追踪以及电镜结果显示形态学变化,发现在病人特异性的神经元细胞中有类似成纤维细胞模型出现的异常线粒体过度分裂形态以及更多的溶酶体空洞。结论1.ATAD3A重组的突变体蛋白有表现出显著的ATP酶活性下降趋势。2.过表达细胞模型中,突变体ATAD3A过表达表现出明显的线粒体形态异常过度分裂,且伴随有溶酶体堆积及自噬水平的上调。3.同样类似的在病人来源的成纤维细胞和多功能干细胞特异诱导神经元的细胞模型中,观察到紊乱的线粒体动态平衡和更多的溶酶体空洞。4.病人细胞处于一种类似饥饿的状态,存在自噬活动增强。ATAD3A显性负突变进而能导致高度异质性的包括HSP在内的一系列多变化的显性遗传神经系统疾病,并且家系不同成员中可存在显著差异。
李志强[7]2015年在《布鲁氏菌二元调控系统TceSR和TcfSR的生物学功能研究》文中进行了进一步梳理布鲁氏菌病是由感染人和动物的布鲁氏菌造成的对社会安全有严重危害的疾病,在世界上广泛流行,尤其是在发展中国家,造成更为严重的经济损失。布鲁氏菌是一类兼性胞内寄生菌,其毒力主要依赖于在宿主细胞内的生存和繁殖的能力。二元调控系统(two-component regulatory system,TCS)能够对环境信号感受应答、传递以及处理的信号进行转导、调节和控制。布鲁氏菌有15对TCS,已有研究表明,位于染色体I的TCS与布鲁氏菌的毒力密切相关,但位于染色体II的TCS的毒力表型及其调控机制还尚不清楚。本研究以布鲁氏菌TCS TceSR和TcfSR为研究对象,通过探讨TCS TceSR和TcfSR对布鲁氏菌毒力表型、相关基因表达和胞内生存繁殖的影响,及其在小鼠体内的毒力和免疫保护力,为揭示布鲁氏菌感染宿主细胞的分子机制提供线索,也为新疫苗的研发、相关疫病的预防、控制和抗病育种工作提供依据。目的:本研究以羊种布鲁氏菌参考株16M为研究对象,探讨TCS TceSR和TcfSR的功能及其在布鲁氏菌致病过程中的作用机制。(1)构建TCS TceSR和TcfSR启动子失活的突变株,并对其进行鉴定。(2)分析TCS TceSR和TcfSR突变株相关毒力基因的胞内外转录水平,比较突变株和亲本株毒力基因表达的差异,根据差异基因的功能及其在突变株中的转录变化,解释突变株相关毒力表型的变化。(3)分析比较突变株和亲本株胞内生存相关表型的差异,确定TCS TceSR和TcfSR对布鲁氏菌胞内存活的作用。(4)分析突变株在小鼠体内的毒力,探讨TCS TceSR和TcfSR对布鲁氏菌在小鼠体内建立慢性感染的作用。方法:(1)利用同源重组和抗性替换的方法,构建了TCS TceSR和TcfSR启动子失活的突变株;对获得的基因突变株进行PCR鉴定和遗传稳定性检测。(2)布鲁氏菌侵染巨噬细胞RAW264.7,qRT-PCR检测布鲁氏菌相关毒力基因(主要包括脂多糖合成相关蛋白、外膜蛋白、Ⅳ型分泌系统、转运系统、鞭毛系统、调控系统、压力蛋白/泛素相关蛋白、氮源代谢分子)的胞内转录水平;亲本株和突变株在体外刺激环境中培养30min。利用qRT-PCR分析毒力基因omp25、virB1、vjbR、gntR、dnaK、Hfq、htrA的转录变化。(3)比较突变株和亲本株的胞内存活相关表型。布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,在侵染后不同时间,检测细菌的黏附侵袭能力和胞内存活能力;亲本株和突变株侵染巨噬细胞RAW264.7,利用荧光定量PCR、流式细胞仪和共聚焦显微镜测定宿主细胞在细菌的侵袭下所引起的凋亡和自噬水平;构建能够表达绿色荧光的布鲁氏菌,侵染巨噬细胞RAW264.7,观察布鲁氏菌与溶酶体的融合情况。(4)用布鲁氏菌疫苗株和突变株分别腹腔接种免疫(106CFU)SPF级4-6周龄雌性BALB/c小鼠;接种后的不同时间点采集免疫小鼠血清,采用间接ELISA测定小鼠体内细胞因子IFN-γ的水平和总的IgG水平;无菌分离脾脏,测定脾脏载菌量,制备病理切片,检测突变株的毒力;用105CFU的16M进行攻毒实验,检测各菌株的保护力;克隆、表达、纯化TCES和TCFS两个蛋白,以纯化的蛋白作为抗原,分别对突变株免疫小鼠的血清进行Western Blot分析。结果:(1)成功构建了TCS TceSR和TcfSR启动子突变株16MΔTceSR和16MΔTcfSR,在15代内遗传性稳定;突变株和亲本株的体外生长趋势一致;体外刺激结果显示,突变株对酸、碱、高盐、热应激、营养缺陷和干燥的抵抗力降低。(2)亲本株和突变株侵染细胞24h后,66个布鲁氏菌相关毒力基因在胞内的转录水平发生了变化,其中在16MΔTceSR突变株中,41个(62.12%)基因高表达,25个(37.88%)基因低表达;在16MΔTcfSR突变株中,47个(71.21%)基因高表达,19(28.79%)个基因低表达;在体外刺激环境下,布鲁氏菌胞内存活相关的基因在突变株中的转录水平均低于在亲本株中的转录水平。(3)突变株对细胞的粘附能力和胞内存活能力是减弱的;细胞凋亡研究发现,突变株与亲本株引起宿主细胞凋亡程度相似;而细胞自噬结果却发现,突变株引起细胞自噬水平低于亲本株;溶酶体融合实验显示,侵染细胞24h时突变株组胞内的布氏小体与溶酶体融合率高于亲本株组。(4)突变株免疫小鼠后,可诱导机体分泌IFN-γ和IgG,小鼠脾脏载菌量低于亲本株,但仍存在一定的毒力;攻毒后,突变株免疫的小鼠对亲本株可产生一定的免疫保护力;布鲁氏菌重组蛋白TCES和TCFS可以作为诊断抗原,鉴别突变株免疫和亲本株免疫的小鼠。结论:(1)TCS TceSR和TcfSR在布鲁氏菌抵抗逆环境中有重要的作用。(2)TCS TceSR和TcfSR突变株侵染宿主细胞后,66个毒力基因的表达受到了影响,使布鲁氏菌适应胞内的各种不利环境,以利于布鲁氏菌的胞内存活。(3)TCS TceSR和TcfSR突变株在小鼠体内可诱导细胞免疫和体液免疫,其毒力比亲本株下降明显,但需进一步改造。
李晓宁[8]2016年在《E3泛素连接酶Smurf1通过调控DAB2IP蛋白控制肿瘤细胞增殖与迁移的作用机制》文中研究表明DAB2IP蛋白(DOC-2/DAB2相互作用蛋白)是一个与卵巢癌,前列腺癌,乳腺癌和绒癌密切相关的肿瘤抑制蛋白,是通过酵母双杂交系统鉴定的有几个有效功能结构域,能与DOC-2/DAB2相互作用的蛋白。DAB2IP蛋白的主要特征是通过它的Ras GAP同源结构域影响Ras-介导的信号转导和生长抑制。另外,有研究报道DAB2IP蛋白的C2结构域能与凋亡信号调节激酶1(ASK1)结合,抑制ASK1与它的抑制剂14-3-3的结合,从而诱导细胞凋亡,因此这个蛋白也可以被称为ASK1相互作用蛋白(AIP1)。除此之外,还有越来越多的研究表明,DAB2IP蛋白在肿瘤细胞生长,转移和癌症进展等其他方面都发挥肿瘤抑制蛋白的作用。也有研究发现,由于表观遗传基因沉默导致异常的DAB2IP基因表达经常在癌症中被检测。例如在前列腺癌中,DAB2IP蛋白的表达能被它的启动子甲基化和组蛋白修饰抑制。而且我们前期也有数据表明,DAB2IP蛋白也能被E3泛素连接酶SCFFbw7以泛素蛋白酶体依赖的方式降解,从而抑制它对肿瘤细胞生长和转移的抑制作用。从目前对DAB2IP蛋白的大量研究分析,现在对DAB2IP蛋白调控的下游信号通路研究的比较多,也相对比较清楚,但是DAB2IP蛋白的上游调控机制依然不是很清楚。泛素介导的蛋白酶体降解是一个蛋白质选择性更新,能被大多数细胞过程利用的不可逆过程。而且已经有很多研究发现泛素蛋白酶体系统能通过介导多种肿瘤相关蛋白的降解调控肿瘤细胞的增殖和转移等生物学功能。泛素蛋白酶体系统是由三种酶的连续活化完成:分别是泛素活化酶(E1),泛素结合酶(E2s)和泛素连接酶(E3s),而且研究证实在泛素蛋白酶体系统中,E3泛素连接酶能控制底物特异性。例如E3泛素连接酶SPOP能通过泛素蛋白酶体系统降解ERG蛋白,从而抑制前列腺癌细胞的进展,还有E3泛素连接酶SCFβ-TRCP能通过泛素蛋白酶体系统降解肿瘤转移抑制基因-1(MTSS1)。因此,泛素蛋白酶体系统可能对许多肿瘤相关蛋白都有调控作用,这个提醒我们可以将泛素蛋白酶体系统作为肿瘤相关蛋白上游调控机制的一种进行分析研究。E3泛素连接酶Smurf1是HECT型E3泛素连接酶,是一个有致癌功能的Nedd4-样E3连接酶家族的一员,通常情况是通过它的WW结构域识别底物的PY序列与底物结合,并通过泛素蛋白酶体系统降解底物蛋白,但是目前也有研究发现Smurf1也能通过它的N-端C2结构域与Rho A结合并使其降解。由此表明Smurf1结合并降解底物蛋白除了通过经典的Smurf1 WW结构域识别底物的PY序列以外,Smurf1的其他结构域也可能参与其中。我们前期对Smurf1和DAB2IP蛋白的结构和功能都进行了仔细分析,发现虽然DAB2IP蛋白并不存在Smurf1识别的经典序列,PY序列,但是它们有共同的C2膜定位结构域,而且也有研究表明Smurf1识别底物蛋白并非必需依赖底物蛋白的PY序列,更重要的是,目前研究发现这两个蛋白在肿瘤细胞中发挥相反的作用,由此提示DAB2IP蛋白可能会被Smurf1通过非经典的方式结合并降解。基于我们对Smurf1和DAB2IP蛋白结构和功能的分析,我们设计了本实验。首先通过检测DAB2IP蛋白与Nedd4-样E3泛素连接酶家族成员之间的结合,确定结合DAB2IP蛋白的特异性E3泛素连接酶,通过抑制或过表达特异性E3泛素连接酶观察特异性E3泛素连接酶对DAB2IP蛋白表达水平的调控,验证了Smurf1是否介导DAB2IP蛋白的泛素化降解。其次,检测已知的Akt介导的DAB2IP蛋白磷酸化是否影响Smurf1对DAB2IP蛋白的调控,分析Smurf1是否有Akt磷酸化位点并检测Akt介导的Smurf1磷酸化是否通过调节Smurf1蛋白自身稳定性进一步调控DAB2IP蛋白的表达水平,确定了Akt介导的这两个蛋白磷酸化是否影响Smurf1调控DAB2IP蛋白表达水平的过程。最后,构建了Smurf1和DAB2IP蛋白单独敲除及二者共同敲除的稳定细胞系(DU145和MCF-7细胞),通过细胞增殖(克隆形成和软琼脂集落形成实验)和迁移实验(划痕实验),探讨了Smurf1通过调控DAB2IP蛋白对肿瘤细胞增殖和迁移的影响。方法:(1)利用免疫印迹和免疫共沉淀的方法探讨DAB2IP蛋白与Nedd4-样E3泛素连接酶家族成员之间的结合。(2)利用瞬时转染的方法将目的sh RNA片段与慢病毒载体连接,包被病毒,感染目的细胞建立稳定的基因敲除细胞系,观察抑制Smurf1对DAB2IP蛋白表达水平的影响。(3)利用瞬时转染过表达Smurf1的细胞系或者稳定敲除Smurf1的细胞系,利用蛋白半衰期实验检测Smurf1对细胞内DAB2IP蛋白半衰期的影响。(4)利用体内泛素化分析实验检测Smurf1是否通过泛素化降解途径调控DAB2IP蛋白的降解。(5)瞬时转染Akt的活化形式,利用免疫印迹和免疫共沉淀的方法检测Akt对DAB2IP蛋白和Smurf1蛋白磷酸化水平的影响,并检测Akt介导的这两个蛋白磷酸化对Smurf1介导的DAB2IP蛋白表达水平的影响。(6)利用瞬时转染的方法将目的sh RNA片段与慢病毒载体连接,包被病毒,感染目的细胞建立稳定的基因敲除细胞系,利用划痕实验观察不同组细胞之间迁移速度的差异。(7)利用克隆形成实验,检测不同组肿瘤细胞克隆形成的变化。(8)利用软琼脂集落形成实验,观察不同组肿瘤细胞集落形成的改变。结果:(1)免疫印迹和免疫共沉淀结果显示,DAB2IP蛋白可以与Nedd4-样E3泛素连接酶家族成员中的Smurf1相结合。(2)利用sh RNA抑制内源性的Smurf1可以增加不同细胞系(DU145,MCF-7和T98G细胞)内DAB2IP蛋白的表达水平。同时蛋白降解实验也显示,过表达Smurf1能降低DAB2IP蛋白的表达水平。(3)蛋白半衰期实验结果显示,过表达Smurf1能明显缩短DAB2IP蛋白的半衰期,抑制Smurf1表达则能明显延长DAB2IP蛋白的半衰期。(4)体内泛素化实验证实,Smurf1能以泛素蛋白酶体系统依赖的方式降解DAB2IP蛋白。(5)一系列蛋白降解实验和免疫共沉淀实验显示,Akt介导的DAB2IP蛋白磷酸化并不影响Smurf1调控DAB2IP蛋白的表达水平,而Akt介导的Smurf1蛋白磷酸化能通过增加Smurf1自身的稳定性,从而促进Smurf1介导DAB2IP蛋白的泛素化降解。(6)利用sh RNA分别抑制Smurf1和DAB2IP或两者共同抑制构建的不同细胞系(DU45和MCF-7细胞),通过划痕实验结果显示,与对照组比较,单独敲除Smurf1可以明显抑制细胞的迁移速度,两者共同敲除则能减弱Smurf1单独敲除时对细胞迁移速度的抑制。(7)克隆形成实验和软琼脂集落形成实验结果显示,与对照组比较,单独敲除Smurf1可以明显抑制细胞的克隆形成和集落形成,两者共同敲除则能减弱Smurf1单独敲除时对细胞克隆形成和集落形成的抑制。结论:E3泛素连接酶Smurf1特异性结合DAB2IP蛋白并介导DAB2IP蛋白的泛素化降解。Akt通过介导Smurf1 E3泛素连接酶的磷酸化增加Smurf1蛋白的稳定性,从而调控Smurf1介导DAB2IP蛋白的泛素化降解过程。Akt介导的Smurf1磷酸化及稳定性增加能通过调控DAB2IP蛋白的表达水平控制肿瘤细胞的增殖与迁移。
张宪亮[9]2016年在《有氧运动及白藜芦醇对Tg APP/PS1小鼠海马Aβ沉积的影响》文中进行了进一步梳理阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种以认知功能逐渐下降、日常生活能力进行性衰退为主要临床表现的进行性神经退行性疾病。其发病隐匿,治疗昂贵,且无法治愈,给家庭及社会带来了严重的精神负担和经济压力。积极的身体锻炼及饮食中富含白藜芦醇可以有效预防及延缓AD发病,但相关分子生物学机制并不清楚。研究发现,由Ap生成增多或清除减少导致的Ap异常沉积是AD致病的最重要因素。进一步研究发现在AD转基因小鼠脑内也出现了能量代谢紊乱、自噬体堆积、小胶质细胞激活等现象,且这些现象与Aβ沉积密切相关。本研究以此为基础,分析了有氧运动及白藜芦醇干预对AD转基因小鼠海马内Aβ沉积的影响,并探讨了其分子机制。目的：以Tg APP/PS1小鼠作为研究对象,探究3个月的有氧运动及白藜芦醇干预对AD小鼠记忆力、海马区Ap沉积的影响,并以AMPK/Sirtl为出发点,从Ap生成、清除及小胶质细胞介导的炎症反应三个角度探讨有氧运动及白藜芦醇减少Ap沉积的分子机制。方法：1.将6月龄Tg APP/PS1小鼠和同窝野生型小鼠作为转基因组(Transgenic group,Tg,n=24)和野生对照组(Wild type group, WT, n=24),分别进行Morris水迷宫实验和新事物识别实验。行为学测试结束24h后,每组随机选取6只小鼠依次进行心脏灌注0.9%Nacl和4%多聚甲醛预固定脑,制作石蜡切片；每组随机选取另外6只小鼠,分离双侧海马,左侧海马用于qRT-PCR实验,右侧用于Western blot实验；每组再随机选取6只小鼠,分离双侧海马,左侧用于胆固醇含量检测,右侧用于HMG-CoA还原酶(HMGCR)活力检测；每组剩余6只小鼠心脏灌注0.9%Nacl后,分离两侧海马,制作单细胞悬液,用于流式细胞实验。2.将3月龄Tg APP/PS1小鼠随机分为对照组(control group, TC, n=24)、有氧运动组(aerobic exercise group, TE, n=24)、白藜芦醇组(resveratrol group, TR, n=24)和有氧运动+白藜芦醇组(aerobic exercise+ resveratrol group, TRE, n=24)。TE和TRE组进行跑台运动干预,TC和TR组置于静止跑台,自由活动；训练结束1h后TR和TRE组进行白藜芦醇灌胃(白藜芦醇溶于0.5%的羧甲基纤维素钠,浓度为1mg/ml,剂量为20mg/kg体重),TC和TE组进行0.5%的羧甲基纤维素钠灌胃。12周干预结束后分别进行Morris水迷宫实验和新事物识别实验。行为学测试结束24h后,每组随机选取6只小鼠,依次心脏灌注0.9%Nacl和4%多聚甲醛预固定脑,制作石蜡切片；每组随机选取另外6只小鼠,分离双侧海马,左侧海马用于qRT-PCR实验,右侧用于Western blot实验；每组再随机选取6只小鼠,分离双侧海马,左侧用于胆固醇水平检测,右侧用于HMG-CoA还原酶(HMGCR)活力检测；每组剩余6只小鼠心脏灌注0.9%Nacl,分离两侧海马,制作单细胞悬液,用于流式细胞实验。研究1、2检测指标具体如下：1)行为学以及老年斑相关指标：Morris水迷宫检测其空间学习记忆能力,新事物识别实验检测其识别记忆能力,免疫组织化学染色检测Aβ沉积水平。2)APP水解途径及AMPK/Sirt1通路相关指标：qRT-PCR检测ADAM10、BACE1、 AMPK、Sirtl、CaMMKβ、HMGCR的 mRNA表达；Western blot检测APP、ADAM10、 BACE1、PS1、Aβ、AMPK、P-AMPK-Thr172、Sirt1、CaMMKβ、Flotillin1的蛋白表达；Elisa检测胆固醇水平和HMGCR活力。3)自噬相关指标：qRT-PCR检测ULK1、Beclin1、Atg5、Atg12、Atg16L、LC3、 p62、LAMP1的mRNA表达；Western blot检测ULK1、 p-ULK1-Ser555、p-ULK1-Ser757、 Beclin1、Atg5、Atgl2、Atg16L、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62、LAMP1的蛋白表达。4)小胶质细胞相关指标：RT-PCR检测IL-1β、IL-6、TNFα、IL-10、TGF-β、 NF-κBp65的mRNA表达；Western blot检测NF-κB p65的蛋白表达；流式细胞仪分选CD11b+/CD45+细胞、CD11b+/CD86+细胞、CD11b+/CD206+细胞。结果：1)与WT组比较,Tg组小鼠定位航行实验中潜伏期、总路程显著性增加,平台象限路程百分比和时间百分比显著性减少,空间探索实验中穿越平台次数显著性减少；新事物识别实验中新奇事物识别指数显著减少；Ap沉积面积显著增大,Aβ沉积数量显著增多。2)与WT组比较,Tg组小鼠海马区APP、BACE1、PS1、Aβ、Flotillinl的蛋白表达显著增多(p<0.05),AMPK的mRNA表达和CaMKKβ的蛋白表达显著减少(p<0.05),HMGCR活力显著性上调(p<0.05)。3)与WT组比较,Tg组小鼠Atg12、Atg16L的蛋白表达显著性减少(p<0.05),p62的mRNA表达和蛋白表达、LAMP1的蛋白表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著性增多(p<0.05)。4)与WT组比较,Tg组小鼠CD11b+/CD45+细胞数量显著增多(p<0.05), M2/M1比值显著降低(p<0.05), TNFα、IL-1β、IL-6、IL-10mRNA表达显著性增多(p<0.05)。5)与TC组比较,TE、TR、TRE组小鼠定位航行实验中潜伏期、总路程显著性减少,平台象限路程百分比、时间百分比显著性增加,空间探索实验中穿越平台次数、平台象限路程比百分显著性增加；TRE组新事物识别指数显著性增加；TE、TR、TRE组Aβ沉积面积和沉积数量显著性减少。6)与TC组比较,TE组Aβ、Flotillin1蛋白表达水平、HMGCR活力、胆固醇水平显著性降低(p<0.05), ADAM10、AMPK、Sirtl、CaMKKβ蛋白表达以及AMPK的磷酸化水平显著性增加(p<0.05)、TR组Aβ、Flotillinl蛋白表达水平显著减少(p<0.05),AMPK、Sirtl、CaMKKβ蛋白表达及AMPK的磷酸化水平显著增加(p<0.05); TRE组APP、BACE1、PS1、Aβ、Flotillinl蛋白表达、HMGCR活力及胆固醇水平显著减少(p<0.05)、ADAM 10、Sirtl、CaMKKβ蛋白表达、AMPK磷酸化水平显著性增加(p<0.05)。7)与TC组比较,TE组ULK1、Atg5的蛋白表达、ULK1 Ser555的磷酸化水平、LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值显著增加(p<0.05), ULK1 Ser757的磷酸化水平、p62和LAMP1的蛋白表达显著性减少(p<0.05)；TR组ULK1 Ser555的磷酸化水平、Atg12蛋白表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著增加(p<0.05), ULK1 Ser757的磷酸化水平、p62蛋白表达水平显著性减少(p<0.05)；TRE组ULK1 Ser555的磷酸化水平、Beclin1、Atg5、Atg12的蛋白表达水平、LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ匕值显著增加(p<0.05), ULK1 Ser757的磷酸化水平、p62蛋白表达水平显著性减少(p<0.05)。8)与TC组比较,TE、TR、TRE组CD11b+/CD45+细胞数量、NF-κB p65的蛋白表达、TNFα、IL-1β、IL-6的mRNA表达显著降低(p<0.05), M2/M1比值、IL-10、TGF-β的mRNA表达显著增多(p<0.05)。结论：1)6月龄Tg APP/PS1小鼠空间学习记忆、识别记忆能力下降,同时海马区Aβ沉积增加。而有氧运动与白藜芦醇干预可以减少Tg APP/PS1小鼠海马区Aβ沉积,提高其空间学习记忆能力及识别记忆能力。2)6月龄Tg APP/PS1小鼠海马区APP水解途径向Aβ水解途径转移,Aβ生成增加。而有氧运动与白藜芦醇干预一方面通过AMPK/Sirtl通路增加ADAM 10表达来减少Ap生成,另一方面通过激活AMPK减少BACE1表达来减少Aβ生成,此外有氧运动与白藜芦醇干预也可通过激活AMPK,抑制HMG-CoA活力,下调胆固醇含量,减少脂筏数量,通过调节APP在膜上的分布来减少Ap生成。3)6月龄Tg APP/PS1小鼠海马区自噬降解途径出现异常,导致自噬小体堆积,阻碍了Ap的清除。而有氧运动与白藜芦醇干预提高了自噬通量,改善Tg APP/PS1小鼠海马区自噬途径的异常。4)6月龄Tg APP/PS1小鼠海马区活化态小胶质细胞数量增加,M2型小胶质细胞/M1型小胶质细胞比值减少,诱导了炎症反应。而有氧运动与白藜芦醇干预通过AMPK/NF-κB通路抑制了Tg APP/PS1小鼠活化态小胶质细胞数量的增加,抑制了炎症反应。同时有氧运动与白藜芦醇干预减少了M1型小胶质细胞数量,抑制了促炎因子分泌,增加了M2型小胶质细胞数量,促进了抗炎因子分泌。
丁彬彬[10]2016年在《人副流感病毒3型诱导自噬和调节病毒复制的分子机制研究》文中研究指明人副流感病毒3型引起婴幼儿严重的呼吸道疾病包括支气管炎,肺炎等上呼吸道感染的主要的病原菌之一,但是目前还没有有效的疫苗和治疗手段。所以对于研究细胞与病毒的关系,鉴定能够影响病毒的复制的细胞因子或细胞反应对于副流感病毒的疫苗研发和抗病毒治疗有着重要的意义。自噬是一个多步骤的过程,即细胞质组分(入侵的病原微生物、衰老的细胞器等)被自噬体包裹后与溶酶体融合形成自噬溶酶体,从而被降解。一些负链RNA病毒,包括有些副粘病毒可以诱导细胞自噬的发生,但具体的分子机制尚不清楚。我们的研究发现HPIV3通过阻止自噬体与溶酶体的融合,诱导非完全自噬的发生来增加病毒的复制。HPIV3的P蛋白对于病毒抑制自噬体的降解是必须的。P蛋白与SNAP29相互作用,阻止SNAP29与STX17相互作用,从而阻止自噬体与溶酶体的融合。非完全自噬帮助病毒胞外粒子的产生但是却不影响胞内病毒的复制。线粒体自噬是选择性自噬的一种,自噬体可以特异性的包裹线粒体后与溶酶体融合降解线粒体上的抗病毒蛋白,HPIV3感染是否诱导线粒体自噬和其具体分子机制不是很清楚。我们发现HPIV3感染可以诱导线粒体自噬的产生；病毒的M蛋白对于病毒诱导线粒体自噬是必须的。M蛋白与线粒体上的TUFM相互作用从而到达线粒体上；M蛋白被泛素化,泛素化的M蛋白可以与自噬体上的LC3相互作用,使得M可以做为一个介导蛋白去诱导线粒体自噬的产生。我们的结果表明泛素化的M蛋白与LC3和TUFM相互作用,它扮演自噬受体蛋白去介导选择性自噬。我们的研究第一次证明病毒的M蛋白通过连接自噬体与线粒体去诱导线粒体自噬的发生。
参考文献：
[1]. 溶酶体保护蛋白的基因突变及其结构与功能关系的研究[D]. 周小燕. 中国协和医科大学. 1993
[2]. 国家自然科学基金委员会生命科学部2009年度资助面上基金项目一览表[J]. 佚名. 生命科学. 2009
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[4]. Akt信号通路通过激活TFEB而抑制氧化应激诱导的神经细胞凋亡[D]. 苏倩. 河北医科大学. 2017
[5]. 国家自然科学基金委员会生命科学部2007年度资助面上基金项目一览表[J]. 佚名. 生命科学. 2007
[6]. 应用病人来源iPSC诱导的神经元细胞对神经变性疾病中线粒体变化机制的研究[D]. 阳洋. 浙江大学. 2017
[7]. 布鲁氏菌二元调控系统TceSR和TcfSR的生物学功能研究[D]. 李志强. 石河子大学. 2015
[8]. E3泛素连接酶Smurf1通过调控DAB2IP蛋白控制肿瘤细胞增殖与迁移的作用机制[D]. 李晓宁. 吉林大学. 2016
[9]. 有氧运动及白藜芦醇对Tg APP/PS1小鼠海马Aβ沉积的影响[D]. 张宪亮. 华东师范大学. 2016
[10]. 人副流感病毒3型诱导自噬和调节病毒复制的分子机制研究[D]. 丁彬彬. 武汉大学. 2016
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