李杰
（四川省成都市龙泉驿区第一人民医院骨科四川成都610100）
【摘要】目的：就TNF-α对损伤的内侧副韧带和前交叉韧带中BMP-1基因表达的影响进行探讨。方法：选择重庆医科大学附属第一医院骨科教研室在2011年09~11月时间内所收集到的4例滑膜组织和交叉韧带标本，其中女2例，男2例，截肢膝关节相应组织是在无菌条件下用镊子和剪刀来取得。先细胞培养，其次，pET32a(+)-Tat-PTD-VP3重组质粒构建示，分别测定半定量PCR、实时定量PCR。结果：本组资料研究表明，TNF-α作用时间分别为24h、12h、6h、2h，作用浓度为5ng/ml。对于那些已经损伤的MCL细胞中，BMP-1的表达随着TNF-α浓度的不断增加也会出现逐步的下降趋势，用实时定量PCR来进行显示，BMP-1表达为117%、70%、62%、41%。而对于那些已经损伤的ACL细胞中，BMP-1的表达随着TNF-α浓度的不断增加会出现逐渐下降的趋势。用实时定量PCR来进行显示，BMP-1表达从最初的69%，下降到最后的27%。结论：TNF-α能够有效地下调ACL作用，以及前交叉韧带（ACL）和内侧副韧带（MCL）中BMP-1基因表达都出现了较大的下降，本实验为有效促进ACL自我修复，早期抑制TNF-α浓度提供了较好的理论依据。
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【关键词】TNF-α；内侧副韧带；前交叉韧带；BMP-1；基因表达Effects of BMP-1 gene expression of TNF- on injury of the medial collateral ligament and anterior cruciate ligament.
Li Jie(Department of orthopedics, the first people's Hospital of Longquanyi District, Chengdu City, Sichuan Province, Sichuan, Cheng Du, 610100)
【Abstract】Objective:To explore effects of BMP-1 TNF- on the injury of the medial collateral ligament and anterior cruciate ligament in gene expression.Methods:4 cases of synovial tissue Department of orthopedics,First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University collected in 2011：09~11 cruciate ligament specimens,including 2 cases of female,male 2 cases,amputation of knee joint corresponding tissue is achieved with tweezers and scissors under sterile conditions.Second,cell culture,pET32a (+) to construct the recombinant plasmid of -Tat-PTD-VP3,semi-quantitative PCR,real-time quantitative PCR were measured.Results:the study shows that,TNF- α action time were 24h,12h,6h,2h,concentration is 5ng\/ml.For those who have damage in MCL cells,the expression of BMP-1 with increasing TNF- concentration will gradually decline,real-time quantitative PCR was used to display,BMP-1 expression was 117%,70%,62%,41%.And to all those who have injured ACL cells,the expression of BMP-1 with increasing TNF- concentration will gradually decline.Real-time quantitative PCR was used to show the expression of BMP-1,from the initial 69%,down to the last 27%.Conclusion:TNF- α can downregulate the ACL,and anterior cruciate ligament (ACL) and medial collateral ligament (MCL) expression of BMP-1 genes have appeared in a larger drop,this experiment to effectively promote the ACL repair itself,the early inhibition of TNF- α concentrations provided a good theoretical bas
【Key words】TNF- α;medial collateral ligament;anterior cruciate ligament;BMP-1;gene expressio
【中图分类号】R453【文献标识码】B【文章编号】1003-5028(2013)10-0132-02
对于膝关节损伤患者而言，前交叉韧带（ACL）和内侧副韧带（MCL）是极为常见的症状［1］。内侧副韧带（MCL）往往不需要手术治疗，通常在患者受伤之后1个月就能够完成自我修复工作，而前交叉韧带（ACL）却不能进行自我修复［2］。本文就TNF-α对损伤的内侧副韧带和前交叉韧带中BMP-1基因表达的影响进行探讨。
1资料与方法
11一般资料:选择重庆医科大学附属第一医院骨科教研室在2011年9~11月内所收集到的4例滑膜组织和交叉韧带标本，其中女2例，男2例，截肢膝关节相应组织是在无菌条件下用镊子和剪刀来取得［3］。
12主要生化试剂与仪器:①选择美国Corning公司生产的六孔板Transwell；②选择MBI公司生产的逆转录试剂盒、常规聚合酶链式反应试剂盒；③选择重庆光仪电器有限公司生产的电子天平；④选择Bio-Rad公司生产的PCR扩增仪［4］；⑤选择南洋生物制品科技有限公司生产的胎牛血清(FBS)、EDTA；⑥选择美国Thermo Forma生产的二氧化碳培养箱；⑦选择百泰克公司生产的RNA提取试剂盒；⑧选择TaKaRa公司生产的相对荧光定量PCR试剂盒；⑨选择Gibco公司生产的025%胰蛋白酶、DMEM培养液［5］。
13方法
131细胞培养: 首先取出截肢病人正常的MCL组织与ACL组织，在无菌条件下多次冲洗这些标本，然后再将标本表面多余的外周组织用解剖刀来进行剔除，再将其剪成2×2×2mm3组织块，将其置于50μg/ml抗坏血酸、含10%胎牛血清的培养瓶中进行细胞培养，其中CO2的含量为5%，环境温度为37℃［6］。
待细胞长满瓶底部后，就在新的培养瓶中移植组织块，然后继续培养。在传代到2~5代的时候再使用实验中的细胞，然后再进行12%的力学加载，在24、12、6、2h时提取细胞mRNA进行实验。
132pET32a(+)-Tat-PTD-VP3重组质粒构建示:采用胰蛋白酶消化法将细胞种在等双轴加载腔内的硅胶膜上，2%血清培养基培养12h，之后换成1%血清的培养基进行12%的力学加载，在2h、6h、12h和24h时提取细胞mRNA进行实验。
133半定量PCR:其基本步骤如下（反应体系为25μL，引物序列见表1）：Master Mix125μL，Primer正负引物各1μL，cDNA 1μL，RNase-free water 95μL。
134实时定量PCR:所用引物同上。反应体系为25μL：SYBR Green 125μL，primer各1μL，cDNA 1μL，剩余补水（DEPC-treated）95μL。
2结果
21不同作用时间、相同作用浓度的TNF-α对BMP-1表达的影响:本组资料研究表明，TNF-α作用时间分别为24、12、6、2h，作用浓度为5ng/ml。对于那些已经损伤的MCL细胞中，BMP-1的表达随着TNF-α浓度的不断增加也会出现逐步的下降趋势，用实时定量PCR来进行显示，BMP-1表达为117、70、62、41%。而对于那些已经损伤的ACL细胞中，BMP-1的表达随着TNF-α浓度的不断增加会出现逐渐下降的趋势。用实时定量PCR来进行显示，BMP-1表达从最初的69%，下降到最后的27%。
22不同浓度、相同作用时间的TNF-α对BMP-1表达的影响:本组资料研究表明，TNF-α作用时间为2h，浓度分别为20、5、1ng/ml。对于那些已经损伤的ACL细胞中，BMP-1的表达随着TNF-α浓度的不断增加也会出现逐步的下降趋势，用实时定量PCR来进行显示，BMP-1表达为57、65、93%。而对于那些已经损伤的MCL细胞中，BMP-1的表达随着TNF-α浓度的不断增加而出现了先上升后下降,BMP-1表达分别为87、121、112%［7］。
3讨论
TNF-α被认为是急性炎症阶段中重要的化学介质［6］。它刺激生产胶原酶或基质蛋白水解酶诱导细胞外基质降解，如MMP-2。另一方面，TNF-α抑制胶原的合成［21］。Herruzo JA指出TNF-α能抑制胶原基因的转录、降低胶原蛋白的mRNA水平，并减少成纤维细胞胶中原蛋白的生产［8］。
BMP-1能够切割ECM蛋白分子的肽链，也可以通过对赖氨酸氧化酶产量、胶原产量进行控制来修复韧带，是一种典型的金属蛋白酶，具有多功能。另外，由本组资料课的，ACL中的MCL的下调量明显要低于BMP-1下调，这就充分说明了MCL中的形成难度要远远低于ECM形成的困难程度。
总之，TNF-α能够有效地下调ACL作用，以及前交叉韧带（ACL）和内侧副韧带（MCL）中BMP-1基因表达都出现了较大的下降，本实验为有效促进ACL自我修复，早期抑制TNF-α浓度提供了较好的理论依据。
参考文献
［1］W.Nebelung,H.Wuschech.2005Thirty-fiveyearsoffollow-upofanteriorcruciateligament-deficient knees in high-level athletes［J］. Arthroscopy 21:696-702
论文作者:李杰
论文发表刊物:《河南中医》2013年10月第2期供稿
论文发表时间:2014-3-19
标签：韧带论文; 浓度论文; 定量论文; 细胞论文; 损伤论文; 作用论文; 公司生产论文; 《河南中医》2013年10月第2期供稿论文;