冯均尚[1]2013年在《融合蛋白GGH氮端延长类似物的克隆表达、分离纯化及初步活性评价》文中进行了进一步梳理融合蛋白GGH是由两个人胰高血糖素样肽-1突变体和人血清白蛋白HSA融合而成的重组蛋白，与单体GLP-1相比，GGH不仅可以促进β细胞的增殖、胰岛素的分泌，还大大的提高了体内的半衰期，但其活性并没有达到预期，主要原因可能是氮末端的不完整，针对这一点，本文对GGH的氮端添加氨基酸延长修饰，设计出5种GGH的氮端延长类似物，成功构建了表达5种类似物的基因工程菌，并分离纯化得到五个类似物，进行了活性的筛选和鉴定，主要结论如下：（1）对母体融合蛋白GGH进行了5种方法的延长修饰，即DAH-GGH、MSY-GGH、TFT-GGH、A-GGH和G-GGH，针对延长修饰的思路，首先设计出含有延长氨基酸核酸序列的引物，PCR扩增得到类似物的基因，构建了GGH类似物的重组表达载体，转化子经过菌液PCR、双酶切和测序验证后，以P.pastoris GS115为宿主成功的构建了GGH氮端延长修饰的5个类似物的表达菌株。（2）融合蛋白GGH类似物的毕赤酵母表达菌株发酵表达条件是：120mL/叁角瓶体积的装液量，pH6.0、30℃、200r/min、2%的甲醇诱导浓度、诱导时间72h，五株菌株的蛋白表达量为150-160mg/L。（3）融合蛋白GGH类似物分离纯化的步骤是：冷冻离心：4℃、8000r/min冷冻离心10min，收集上清，超滤浓缩20倍，调节电导为13.0mS/cm。依次经过Blue Sepharose6Fast Flow层析、Phenyl Sepharose6Fast Flow层析、Q Sepharose Fast Flow层析和Sephadex G-25凝胶层得到纯度为98.0%GGH的类似物，SDSPAGE考马斯亮蓝染色和银染证实了纯化蛋白的纯度，纯化过程总回收率达到33.3%。（4）体外活性结果显示TFT-GGH，A-GGH与G-GGH均可以显着的促进cAMP的生成，且A-GGH与G-GGH的体外活性比母体蛋白GGH提高了10倍。小鼠体内糖耐量实验结果表明A-GGH与G-GGH还可以显着控制KM小鼠口服葡萄糖后血糖的增幅，而且类似物A-GGH在给药24h后仍可以显着的发挥控制血糖增高的效果。（5）对体内外活性较高的类似物A-GGH进行质谱法分子量测定，结果发现测定出峰值在6.8104和7.15104m/z，发现它产生了一个新的出峰7.15104m/z，此峰分子量接近其理论分子量（72kD），分子量测定结果证明类似物A-GGH的稳定性有所提高。
邵明龙[2]2016年在《代谢工程改造微生物合成甾体药物中间体ADD和TS》文中认为甾体药物是仅次于抗生素的第二大类药物,因其重要的生理活性,临床上具有广泛的应用。雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)是重要甾体药物中间体,可通过结构上的化学修饰合成几乎所有的甾体类药物,在甾体药物行业中的地位日益突出。然而由于底物投料浓度低,发酵转化周期长及甾体微生物代谢机理认知的不足等问题,我国在甾体微生物转化生产上仍明显落后于欧美等国家,这严重制约了我国甾体药物产业绿色转型的步伐。因此,本论文以甾醇转化过程关键酶为目标,对新金色分枝杆菌Myobacterium neoaurum转化植物甾醇合成ADD过程中的关键酶3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KSDD),胆固醇氧化酶(Cho M),甾酮C27单加氧酶(SMO)和3-甾酮-9α-羟化酶(KSH)进行研究,利用代谢工程策略,实现了ADD的高效积累。此外,本研究对甾醇代谢产物进行了拓展,将来源于人体中AD合成睾酮(TS)的途径在毕赤酵母中进行表达,实现了甾体药物TS的生物学合成。主要内容总结如下:1.课题组前期对M.neoaurum ST-095进行诱变获得菌株M.neoaurum JC-12,其转化植物甾醇合成AD和ADD的总产量相同但摩尔比例不同,推测原因是催化AD到ADD的KSDD活性差异所导致。因此,本研究通过对诱变前后菌株KSDD氨基酸序列比对,发现M.neoaurum ST-095中KSDDI和M.neoaurum JC-12中KSDDII的不同在于氨基酸序列V366S的突变,该突变直接影响了KSDD活性。枯草芽孢杆菌中异源表达和酶动力学分析表明V366S的突变使得KSDD对底物的亲和性和催化效率提高进而明显提高酶活性。对KSDDI和KSDDII在新金色分枝杆菌中的功能进行分析,证实该突变是引起菌株诱变前后产生不同AD和ADD摩尔比的原因。进一步对KSDD催化活性中心结构分析,发现V366S的突变能够减少底物与酶催化中心的空间位阻提高了KSDD的催化活性和稳定性,进而提高其酶活性。2.将M.neoaurum JC-12中的Cho M1和Cho M2基因在枯草芽孢杆菌中进行异源表达,对其酶学性质进行研究,结果表明重组Cho M1和Cho M2的反应最适p H和温度均分别为7.5和37°C,Mg2+和Mn2+能够明显促进其酶活性。动力学参数表明,和Cho M1相比,Cho M2对底物的亲和力更强,从而表现出更高的酶活性。利用构建的重组菌B.subtilis 168/p MA5-cho M1和B.subtilis 168/p MA5-cho M2全细胞实现了胆固醇到4-胆甾烯-3-酮的转化,24 h后产量分别为0.67 g·L~(-1)和0.83 g·L~(-1)。将Cho M2在M.neoaurum JC-12中过量表达以提高底物甾醇的摄取和转化能力,最终ADD产量达到4.73 g·L~(-1),提高了37.1%。结果表明可以通过提高甾醇转化菌株中Cho M活性来改良菌种的发酵特性,实现甾醇的高效转化。3.鉴定了来源于新金色分枝杆菌的叁个SMO同工酶SMO1,SMO2和SMO3具有甾醇侧链末端氧化功能。对其进行异源表达与纯化,酶动力学分析表明SMO2对底物亲和性更强,催化效率更高。对叁个同工酶基因的敲除和功能回补进行研究,发现缺陷菌株对底物甾醇的代谢速率受到明显的抑制作用,证实了SMO是分枝杆菌甾醇侧链转化第一步反应的关键酶,其中SMO2在甾醇代谢过程中作用最为明显。在M.neoaurum JC-12中分别过表达SMO1,SMO2和SMO3,考察过量表达SMO对菌株在甾醇转化能力上的影响。结果表明SMO1,SMO2和SMO3过表达菌株ADD的产量分别从3.48 g·L~(-1)提高到4.49 g·L~(-1),4.96 g·L~(-1)和4.13 g·L~(-1),分别提高了29.0%,42.5%和18.7%,其中SMO2在提高ADD产量上效果最为明显。结果表明可以通过提高SMO的酶活性来提高菌株转化甾醇合成ADD的能力。4.利用代谢工程手段调控M.neoaurum JC-12转化甾醇合成ADD的代谢途径。首先敲除ksh A1基因使得KSH活性缺失,从而阻断了ADD降解途径,ADD产量从3.45g·L~(-1)提高到4.57 g·L~(-1),并且发酵后期ADD不再被降解。在KSH活性缺失的基础上,通过共表达代谢途径中的关键酶Cho M2,SMO2和KSDD提高甾醇代谢途径中的代谢通量,最终获得高效转化植物甾醇合成ADD的重组菌JC-12S2-cho M2-ksdd。以20 g·L~(-1)植物甾醇作为底物进行发酵转化168 h,重组菌ADD的产量从6.55 g·L~(-1)提高到12.40 g·L~(-1),提高了89.3%。为了缩短发酵周期,提高ADD的生产效率,本研究在5-L发酵罐上对重组菌株的发酵工艺进行优化。以果糖作为初始碳源,明显消除重组菌生长延滞期,然后结合多阶段发酵策略,最终180 h获得20.1 g·L~(-1)的ADD,生产效率从0.074 g·(L·h)-1提高到0.112 g·(L·h)-1。这是目前文献报道中利用甾醇转化合成ADD的最高产量。同时发酵工艺技术手段具有广泛的通用性和突出的应用价值,理应得到大力推广。5.论文对甾体药物及中间体睾酮(TS)的微生物合成进行了初步研究。首先将来源于人体中AD合成TS的途径在毕赤酵母中进行表达,实现了TS的生物学合成。将经密码子优化后的人体17β-羟基类固醇脱氢酶3(17β-HSD3)基因在毕赤酵母中进行了异源活性表达,验证了其具有催化AD合成TS的功能,并且该催化反应为不可逆反应。然后在毕赤酵母中共表达17β-HSD3和酿酒酵母的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)构建NADPH辅酶循环再生系统。以葡萄糖为辅底物,重组菌P.pastoris/17β-HSD3P-G6PDH全细胞能够高效转化AD合成TS。进一步优化其全细胞转化条件:温度为37°C,p H为7.5,底物最佳助溶剂为Me-β-CD,最适菌体生物量为200 g·L~(-1)(湿重),最适底物浓度为5 g·L~(-1)。在5-L发酵罐上利用分批补料策略转化120 h,TS的终产量达到11.6 g·L~(-1),这是目前文献报道中微生物法转化合成TS的最高产量。结果表明毕赤酵母系统共表达目的酶蛋白和辅酶循环再生酶系可以作为合成其他甾体药物的有效途径。为实现由植物甾醇一步转化合成TS,将密码子优化后的17β-hsd3基因转化到高产AD的M.neoaurum ZADF-4中。然而遗憾的是,虽然表达出17β-HSD3目的蛋白,但是没有酶活性,并且重组菌也不能够转化植物甾醇合成TS。
黄慧[3]2003年在《质粒DNA发酵与分离纯化过程的研究》文中进行了进一步梳理本论文以含有质粒pcDNA3的E. coli DH5α菌株为对象,系统地研究了从发酵到细胞裂解,再到阴离子交换色谱纯化的质粒大规模制备过程。首先在摇瓶中进行的正交试验用以考察选定因素以及每个因素的各个水对质粒菌发酵中菌体浓度的影响程度。根据实验结果选取利于质粒菌高密度发酵的最优化条件进行质粒的生产。同时进行了大肠杆菌生长曲线的测定和质粒小量制备纯化及含量测定的实验,以研究该质粒在发酵液中含量同宿主菌生长曲线的关系,找出收获质粒的最佳时间。然后重点研究了含有质粒pcDNA3的大肠杆菌E. coli DH5α在发酵罐中的高密度发酵。分别详细考察了间歇发酵和流加发酵过程。研究了包括菌体生长和质粒含量等的关系。最后用碱裂解法裂解细胞提取质粒,并将提取物进行阴离子交换层析以进一步纯化质粒。通过改变层析条件,例如阴离子交换固定相,流动相组成,洗脱方法,上样量等,得到不同的洗脱结果,最终确定阴离子交换色谱纯化质粒的理想操作条件。
刘征[4]2008年在《重组大肠杆菌高效分泌表达杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶》文中提出β-葡聚糖酶是重要的工业用酶,可有效消除谷物β-葡聚糖在酿造和饲料工业中产生的负面影响。国内对β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究还处于初级阶段,天然菌株的产酶量及酶的性能满足不了实际应用。然而,分子生物学、基因工程方法的应用为其提供了契机。现在对β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究主要集中在构建基因工程菌株来提高酶的产量和性能方面。本研究应用工业生物技术进行了一系列的探索,旨在找到一种可持续发展的,可用于产业化、规模化的生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的方法。主要研究内容包括:1.发酵罐流加培养重组大肠杆菌JMl09-pLF3生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶在原有优化培养基基础上,优化了发酵工艺,在7 L发酵罐上进行了分批补料发酵产酶研究。结果表明,在12～32 h之间向发酵罐内恒速流加双倍浓缩的培养基氮源,对细胞生长和产酶有极大的促进作用。最大酶活增长到1680 U/mL,比间歇发酵提高了231.40%;最大细胞密度为7.67 g/L,是间歇发酵3.44倍。2.高效分泌表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶重组大肠杆菌的构建将热稳定性较好的杂合β-1,3-1,4-葡聚糖酶表达基因(bgl)插入质粒pET-22b(+),并插入kil-Km分泌盒,得到了新的β-葡聚糖酶表达质粒pET-22-bgl-(kil-Km)。将重组质粒转化大肠杆菌E coli JM109和BL21(DE3)。通过SDS-PAGE证明了含有质粒pET-22-bgl-(kil-Km)的重组菌株具有目的蛋白的高效分泌表达的功能。3.响应面法优化重组E.coli BL21(DE3)-pET-22-bgl-(kil-Km)产酶培养基在TB培养基基础上,通过单因素实验选择乳糖为最佳碳源,酪蛋白胨为最佳氮源。在单因素优化基础上采用Box-Behnken设计法和RSM响应面分析法考察主要影响因素乳糖浓度、酪蛋白胨浓度和碳氮比叁因素的的交互作用。确定了重组E.coli BL21(DE3)-pET-22-bgl-(kil-Km)产酶的优化培养基配方为(g/L):酪蛋白胨33.39,乳糖8.03,甘油9.15,NaCl 10.0,KH_2PO_4 2.31,K_2HPO_4 12.54。利用优化培养基在37℃、150 rpm条件下,摇瓶培养32.5 h,酶活达到1242.94 U/mL,比初始培养基提高了3.3倍。4.重组酶的分离纯化和酶学性质表征利用Ni~(2+)与6×His标签特异性结合的性质利用亲和层析纯化重组酶,该方法将目的蛋白纯化了7.69倍,纯化后重组酶的活力为1706.2 U/mL,比活11261.6U/mg,酶活回收率达到86.44%。通过SDS-PAGE分析,可知带有6个His标签的β-葡聚糖酶分子量为26 kDa左右。重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质为:最适反应温度和耐热温度均为50℃,最适反应pH在6.0～7.0之间,碱性条件下稳定性较高。
童望宇[5]2001年在《人表皮生长因子工艺的应用基础研究》文中研究指明分离是导致生物技术产品价格高昂的主要原因。提高发酵目标产物的产量、降低发酵液中的杂质含量与扩大目标产物和杂质间的理化性质差异是降低分离成本的有力措施。发酵与分离过程的相互兼容，有机结合（集成）将是降低生产成本的有效途径。基于此原则，本文对生物技术产品hEGF的生产进行了研究。 实验考察了理化因素对工程菌生长的影响，特别是发酵培养条件对人表皮生长因子（human epidermal growth factor，hEGF）产量和发酵液组成的影响，同时对摇瓶发酵的动力学进行了初步探讨，结果表明： （1）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）浓度的增加对工程菌的生长有 一定的抑制作用；异丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D- thiogalactoside，IPTG）对工程菌生长的影响较小；接种量的减 少导致延滞期增长。 （2）根据正交实验极差分析结果，各因素影响对产量的影响作用大 小为：接种量＞Amp浓度＞IPTG浓度＞胰蛋白陈（trypton，try） 与酪蛋白酸水解物（casein，cas）之比＞葡萄糖（glucose，glu） 与乳糖（lactose，lac）之比。 （3）优化培养基组成为：接种量1％，IPTG浓度0.3mM，Amp浓 度150mg/L，lac：glu 5：0（总量为5g/L），Try：Cas为1：1（总量 为40g/L）。在此优化条件下，hEGF的产量从213.4mg/l提高 到242mg/l，特别是发酵培养基中用乳糖替代葡萄糖，其发酵 液中的杂蛋白质浓度显着下降，为纯化分离提供了有利条件。 （4）通过对该发酵体系的分析，建立描述该过程的发酵动力学模 型，由计算结果与实验结果的比较可知，该动力学模型基本上 反映了重组E.coli发酵hEGF过程的规律，特别是在描述菌体 生长上，比较准确。 考察了用STREAMLINE-DEAE阴离子交换剂以填充床模式在AKTAExplore100进行hEGF的初步浓缩分离，各种操作条件对纯化过程的影响进行了系统研究，结果表明： （1）hEGF保留体积随线性流速、进样体积、柱床高度、梯度长度 及pH的增加而增加，但保留体积的增加值等于进样体积的增 加量，此外进样浓度的改变基本不改变其保留体积。回收峰面 积％随进样体积、进样浓度及梯度长度的增加而下降，随柱 床高度及pH值的增加而增加，且线性流速的改变基本不改变 其回收峰面积％。容量因子随线性流速、进样体积、柱床高度、 梯度长度及Ph值的增加而加大；但进样浓度对容量因子影响 浙江大学博土学位论文 摘要 甚小。峰宽随线性流速、进样体积、柱床高度、梯度长度、pH 及进样浓度的增加而上升。但由于进样体积与进样浓度的大量 增加仅引起峰宽的少量加大，故适当加大进样体积与进样浓度 可提高产品浓缩效率和产品的生产率。 Q）初步优化的分离条件为：线性流速为 150 cln／h，进样体积为 50 ml，柱床高度为 11．3 cm，洗脱液为含 2 M NaCI的 0乃2 M的磷 酸盐缓冲液…H7刀），洗脱梯度为ZCV（柱体积）。在此条 件下，hEGF的浓缩倍数达 2．9，回收率达 85％，纯度达 10％以 上。故 STREAMLINE DEAE以填充床模式分离高附加值产品 hEGF是完全可行的。另外，研究表明，采用累加进样方法， 能够扩大柱的吸附容量，并可节省操作时间提高分离效率，也 是一种比较可行的方法。 考察了用ST肪AMLffeE－DEAE阴离子交换剂以扩张床模式对hEGF进行初步浓缩纯化，研究了多种操作条件对分离过程的影响，结果表明： （）线性流速、进样体积、梯度长度、样品浓度及 pH对 hEGF保 留体积、回收峰面积％、容量因子、峰宽等有不同的影响， 而其影晌趋势常与填充床趋势相似，说明扩张床与填充床有相 似的分离机理。 （二）初步优化的分离条件为：线性进样流速为 183 ctn／h，线性洗脱 流速为37 c1Ylul，进样体积为300 ml，柱床高度为 13．8 cm，洗 脱液为含2 M NaCI的0．02 M的磷酸盐缓冲液巾H7刀），洗 脱梯度为 ICV（柱体积）。在此条件下，hEGF的浓缩倍数达 4．3，回收率达80％，纯度达20％以上。从hEGF的扩张床分 离与填充床分高的优化结果发现，其产品的纯度、浓缩倍数及 生产能力都有较大提高，故STngAMLINE DEAE以扩张床模 式分离高附加值产品hEGF具有较好的效果。 考察了不同的线性流速、进样体积与柱床高度对hEGF在凝胶层析中的分离特性和样品组分间分离度的影响。结论如下： 门）hEGF的保留体积具有流速依赖性，hEGF的分配系数随线性 流速的改变而改变，随样品体积的增加而上升，但柱床高度对 hEGF的分配系数几乎无影响。hEGF的标准偏差随进样量的 上?
孙国勇[6]2005年在《流通色谱介质的研制和生物大分子色谱分离》文中认为本文主要研究了以双乳化法制备新型流通色谱介质及其在生物大分子的分离过程中的应用。以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂,甘油溶液为超孔致孔剂,甲苯与正庚烷为微孔致孔剂,安息香乙醚为引发剂,采用双乳化法制备乳化体系,紫外光引发悬浮聚合制备出刚性双孔介质。介质明显地含有超孔与微孔。经二乙胺修饰后,获得的阴离子交换介质,对BSA的静态吸附容量与不含超孔的微孔介质接近,但在高的流速下它有比微孔介质大大高出的动态吸附容量,并用混合模型蛋白溶液来考查介质的分离效果,发现增加流动相流速对双孔介质的分离效果影响不大。再采用碳酸钙悬浮液为超孔致孔剂,环己醇和十二醇为微孔致孔剂,紫外光悬浮聚合制备出双孔介质,比使用甘油溶液为超孔致孔剂,甲苯与正庚烷为微孔致孔剂制备双孔介质,并使制备过程中的乳化体系更加稳定。经乙二胺修饰制得阴离子交换介质,实验证明流速对双孔介质的动态吸附容量影响更小。为了进一步考察自制双孔介质性能,它被用来分离纯化蛋白(分子伴侣GroEL)和核酸(质粒DNA)。先发酵带有分子伴侣GroEL基因质粒的大肠杆菌,然后利用超声法对菌体进行破碎并制得澄清的待分离液,经过小量进样与梯度洗脱确定了对GroEL的洗脱条件,然后在不同的流速下(150和1500 cm/h)对分离液进行穿透吸附,并使用阶跃洗脱得到了电泳纯的GroEL产品。对于质粒DNA的分离也是先发酵带有pcDNA3质粒(5.4 kb)的大肠杆菌,利用碱裂解法制得粗提液,使用梯度洗脱的方法可以得到电泳纯的质粒DNA,并考察了流速、样品盐浓度对分离结果的影响,最后在不同的流速下(150和1500 cm/h)对粗提液进行穿透吸附,并使用阶跃洗脱法得到了电泳纯的质粒DNA产品(0.014和0.113 mg plasmid DNA/min·mL bed)。从而证明了自制双孔介质能够对生物大分子进行很好的分离纯化。
李祝[7]2018年在《嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的异源表达及热稳定性改造》文中指出α-淀粉酶能切断淀粉分子中的α-1,4-葡萄糖苷键,并将淀粉水解为可溶性糊精、低聚糖及麦芽糖和葡萄糖,在制药、纺织、食品以及洗涤剂等行业有着广泛的应用。其中,来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶由于具有优良的热稳定性而被广泛的应用于淀粉的喷射液化工艺中。然而,由于该淀粉酶热稳定性依赖Ca~(2+),液化过程中需要额外添加一定浓度的Ca~(2+)来保持稳定性。本实验室前期筛选得到一株嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)WSH13-17,其所产α-淀粉酶(也叫麦芽六糖α-淀粉酶)具有催化效率高(约为B.licheniformisα-淀粉酶的8倍),热稳定性对钙离子依赖程度低等优点。然而,由于野生酶在高温条件下的稳定性较差,不能满足工业化应用要求。因此本论文将重组表达来源于嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因AmyMH,通过发酵优化提高产酶水平,同时针对重组酶热稳定性偏低的问题,通过定点突变手段定向改造酶的热稳定性,并对相关机理进行探究。进一步在原有突变的基础上,通过在突变体的N端融合寡肽的方法,继续提高酶的应用性能。主要研究结果如下:(1)研究了B.stearothermophilusα-淀粉酶(AmyMH)在大肠杆菌(Escherichia coli)中的重组表达及酶学性质。将B.stearothermophilusα-淀粉酶编码基因AmyMH按照大肠杆菌密码子偏好性进行优化,构建了表达AmyMH基因的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-24a-AmyMH,并考察了不同信号肽介导对重组菌产酶的影响。结果表明,PelB信号肽介导的菌株所产胞外α-淀粉酶活力最高,为782 U·m L~(-1),是原始信号肽介导的4.5倍。摇瓶发酵过程中发现,大肠杆菌菌体浓度与重组酶活力成一定的反比关系。摇瓶发酵样品的透射电镜结果表明,大部分重组大肠杆菌细胞已坏死,细胞内形成很多空洞,只有少部分菌体细胞的组织结构基本存在,而表达失活AmyMH的大肠杆菌细胞形态则较为正常,说明AmyMH的表达对大肠杆菌细胞有一定的毒害作用。将AmyMH在可以表达对大肠杆菌有毒性蛋白的菌株E.coli C41(DE3)中进行重组表达,结果显示胞外最高α-淀粉酶活力为1560 U·mL~(-1),是BL21(DE3)表达的2倍。对重组酶进行纯化和酶学性质分析,结果显示重组酶的最适反应温度和最适反应pH分别为70℃和5.0;以可溶性淀粉为底物时的比活力、k_(cat)、K_m和k_(cat)/K_m分别为5.3×10~4 U·mg~(-1)、6.5×10~4 s~(-1)、2.1 g·L~(-1)和3.1×10~4 g·L~(-1)·s~(-1)。在95℃、pH 6.0、1 mM Ca~(2+)条件下重组酶的半衰期为60 min,而在更高的110℃条件下,重组酶的迅速失活,不能满足工业应用要求。(2)研究了AmyMH在短小芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)中的重组表达,并通过发酵优化提高产酶水平。构建了带有α-淀粉酶编码基因AmyMH的重组菌B.choshinensis/pNCMO2-AmyMH,摇瓶的初步发酵结果显示,发酵上清中酶活力为2149 U·mL~(-1),是大肠杆菌C41发酵的1.4倍。对重组短小芽孢杆菌的摇瓶发酵条件和培养基组分进行优化,优化后发酵酶活力可达1.72×10~4 U·mL~(-1),是未优化前的8倍。在摇瓶优化实验中发现,脯氨酸可以明显促进重组酶AmyMH的表达,流式细胞仪分析结果表明,脯氨酸可以对细胞保持良好状态,延长发酵稳定期有促进作用。并且实验结果表明,脯氨酸对重组菌产酶的促进作用具有一定的普遍性。(3)探讨了重组酶结构域B中非保守区域天冬酰胺突变对重组酶热稳定性的影响。据报道,结构域B对α-淀粉酶稳定性有着重要的影响,并且天冬酰胺的脱酰胺作用是导致α-淀粉酶在高温条件下失活的原因之一。通过氨基酸序列比对,选取了结构域B中的3个非保守天冬酰胺(Asn122、Asn149和Asn193)作为研究目标,构建了5个突变体(N122D、N149S、N149D、N193H和N193F)。热稳定性分析表明,在5个突变体中,突变体N193F的热稳定性提升最为明显,在95℃、pH 6.0、1 mM Ca~(2+)情况下的半衰期为2 h,是野生酶的2倍。蛋白模拟结构显示,Asn193位于一段一段环绕Ca~(2+)-Na~+-Ca~(2+)结构的长Loop上,而Ca~(2+)-Na~+-Ca~(2+)附近结构的稳定对α-淀粉酶整体结构的稳定有着至关重要的作用,因此推测这段Loop对重组酶的稳定性有着重要的影响。(4)通过固定结构域B中178-200位Loop提高AmyMH的热稳定性。基于蛋白质模拟结构分析和比对,选取了Loop上及附近4个可能对重组酶AmyMH稳定性有影响的位点(Pro245,Ser242,Gly180和Ile181),构建了5个AmyMH突变体(ΔIG,S242A,ΔIG/N193F,ΔIG/N193F/P245R和ΔIG/N193F/S242A)。EDTA对野生酶和突变体的活性均有不同程度的抑制作用,其中突变体ΔIG/N193F/S242A的抑制效果最弱。并且,经过10 mM EDTA、60℃处理后,突变体ΔIG/N193F/S242A的残留活性最高,为60%,说明该突变体的Ca~(2+)结合能力最强。突变体ΔIG,S242A,ΔIG/N193F和ΔIG/N193F/S242A的热稳定性较野生酶均有不同程度的提高。其中,突变体ΔIG/N193F/S242A的稳定性最好,在95℃、pH 6.0、1 mM Ca~(2+)条件下半衰期为300 min,是野生酶的5倍,而在不含有Ca~(2+)条件下突变体的半衰期为210 min,是野生酶的26倍。进一步对BLA中相似Loop进行研究,构建突变体,其中叁突变体A269K/S187D/N188T的稳定性最好,在95℃、pH 5.5、10 mM Ca~(2+)条件下半衰期为270 min,是野生酶的9倍。BLA稳定性的提高说明相似Loop的固定对α-淀粉酶热稳定性的提升有着一定的普遍性。(5)将突变体ΔIG/N193F/S242A的N端分别与4种寡肽进行融合,对融合后重组蛋白的酶学性质进行研究。融合蛋白OP1-ΔIG/N193F/S242A对EDTA的耐受性得到加强,而其他叁种融合蛋白对EDTA的耐受性没有得到提升。融合蛋白OP1-ΔIG/N193F/S242A的热稳定性较对照有着明显的提升,在95℃、p H 6.0、1 mM Ca~(2+)条件下处理8 h后,融合蛋白OP1-ΔIG/N193F/S242A的残留活性为58%,而对照仅为37%。在更高温度条件下(110℃),融合蛋白OP1-ΔIG/N193F/S242A与商品酶热稳定性对比发现,在低浓度Ca~(2+)存在的条件下(1和5 mM),融合蛋白OP1-ΔIG/N193F/S242A的残留活性分别为64.6%和63.5%,而商品酶的残留活性则分别为5.2%和58.2%。OP1-ΔIG/N193F/S242A在低浓度钙离子条件下的稳定性要优于商品酶。
贾沙[8]2016年在《Kigamicin生物合成基因簇中orf48和orf49的功能研究》文中指出Kigamicin是由Amycolatopsis sp. ML630-mF1发酵产生的一类多环氧杂蒽酮类抗生素,具有抗细菌、抗真菌和特异性抗肿瘤的活性。其特异性抗肿瘤活性表现为可特异性抑制营养饥饿状态下肿瘤细胞,而对正常状态下的细胞无抑制作用,因此可作为特异性抗癌药物的潜在开发来源。鉴于Kigamicin独特的化学结构和生物活性,人们对其结构与功能的关系产生了浓厚的研究兴趣。本研究在Kigamicin生物合成基因簇成功克隆的基础上,通过分子生物学手段对其相关基因功能进行研究,可使我们进一步了解多氧环杂蒽酮类抗生素生物合成机制,为解释其独特的生物活性提供理论依据。首先,通过生物信息学分析推测Kigamicin生物合成基因簇中orf48和orf49的基因功能,orf48与Xantholipin和Lysolipin生物合成基因xanK和llpK同源性较高,初步推测orf48可能编码3Fe-S Ferredoxin,参与Kigamicin生物合成途径中的电子传递和氧化还原反应；orf49与Xantholipin生物合成基因xan02功能类似,有可能负责Kigamicin生物合成中亚甲基双氧桥的形成；但是也可能与Lysolipin生物合成基因llpOIV相似,参与催化Kigamicin中氧杂葸酮环形成前的环氧化反应。然后,通过PCR-targeting技术分别构建缺失orf48质粒和缺失orf49质粒,即分别以壮观霉素抗性基因替换质粒pLL59上的orf48和orf49,并通过抗性筛选转化子,经PCR验证后,得到突变质粒pLL214和pLL215。而后通过接合转移将突变质粒分别转入天蓝色链霉菌ML154,抗性筛选得到突变株Kiga21468和突变株Kiga21568.通过HPLC-MS检测突变株Kiga21468、Kiga21568以及野生型ML154发酵产物,结果比对,发现突变株Kiga21468和突变株Kiga21568产生了相同的物质组分,并且与Kigamicin具有相同UV特征吸收峰。由此推测,突变株Kiga21468和Kiga21568可能产生Kigamicin结构类似物。对突变株发酵积累代谢产物[M+H]/Z=497, [M+H]/Z=538, [M+H]/Z=527进行分离纯化和结构鉴定,化合物[M+H]/Z=538的分子式为C28H27NO10,其化学结构与Kigamicin结构相比缺少亚甲基双氧桥结构,故而推测Orf48和Orf49参与了Kigamicin亚甲基双氧桥结构的生物合成。
王川[9]2014年在《新型晶胶介质及其蛋白质层析性能》文中研究指明晶胶整体柱在层析分离技术中得到广泛应用，但是存在比表面积小，吸附容量低的缺点。本文针对该问题提出了两种解决方法，同时将晶胶整体柱应用于空间位阻层析中，扩展了晶胶层析材料的应用范围。首先，针对晶胶介质比表面积小的问题，开发了包埋树脂颗粒的方法。将具有合适粒径的形状不规则的高分子树脂颗粒包埋在晶胶骨架中，使晶胶孔隙壁变得粗糙不平，材料的比表面积提高到原来的两倍以上。修饰触须式离子交换基团后，介质对牛血清白蛋白（BSA）吸附量达6mg/mL，为普通晶胶柱的2.8倍，并且在较宽的流速范围内（0.5-20cm/min），吸附量与柱效变化不大，可直接于细菌碱裂解粗料液中对质粒DNA进行粗提，操作快速简便。其次，受限于配基的形态与修饰方法，晶胶材料表面的吸附位点有限，从而导致吸附容量难以提高。针对这一问题，本文提出了二次修饰方法在晶胶材料表面接枝离子交换基团，同时使用包埋颗粒的方法，最终得到具有高吸附容量的晶胶介质，对BSA的吸附量达11.2mg/mL，且适用于快速层析操作。空间位阻层析（SXC）是一种基于聚乙二醇沉淀的层析操作模式，目标蛋白质的保留不依赖其与介质间的直接相互作用。但是高粘度的聚乙二醇流动相限制了其应用。本文将晶胶材料用于该种层析模式，有效解决了流动阻力大、操作压力高的问题，验证了SXC在亲水表面的分离效果，扩展了晶胶材料的应用范围。该方法可用于血清粗料液的处理，能快速实现白蛋白和球蛋白的初级分离，且能对球蛋白实现高倍浓缩。利用电子扫描显微镜观察了SXC操作中球蛋白在晶胶表面的保留状态。另外，利用离子液体单体（乙烯基丁基咪唑氯盐）、两性离子单体（羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯）、BSA制备了新型晶胶材料，通过扫描电镜观察其微观结构，结合宏观机械性能初步判断BSA基质晶胶材料可作为层析介质，其余两种晶胶材料不适合作为层析介质。
白金山[10]2013年在《精氨酸亲和色谱分离纯化超螺旋质粒DNA》文中研究说明与病毒载体相比，质粒DNA具有安全性好、毒性和免疫原性较低以及易于生产等诸多优势，在临床上已被广泛用于基因治疗和DNA疫苗。氨基酸亲和色谱是利用小分子氨基酸作为亲和配基，基于氨基酸和超螺旋质粒DNA之间的特异性相互作用进行质粒纯化的色谱方法，具有操作简便、成本低廉等优势。有研究表明，精氨酸亲和色谱对超螺旋质粒DNA具有很好的选择性，且色谱纯化的条件温和、操作简便。本研究以精氨酸作为亲和配基，考察了介质性能（间隔臂长度，配基密度）和操作条件对质粒DNA吸附量和纯化效果的影响。首先，以琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B作为基质，利用环氧氯丙烷和1,4-丁二醇-二缩水甘油醚进行活化，得到不同间隔臂长度和活化密度的环氧基团，并进行精氨酸配基的固定化。实验结果表明，不同间隔臂长度的精氨酸亲和介质中配基密度分别为21.8mmol/L gel（3-carbon）和21.2mmol/L gel（10-carbon）。同时，以1,4-丁二醇-二缩水甘油醚作为间隔臂活化介质得到配基密度分别为9.6、28.5和47.4mmol/L gel的精氨酸亲和介质。然后，采用迎头分析的方法，考察不同间隔臂长度和配基密度对质粒DNA动态吸附容量的影响。研究发现，配基和载体之间的间隔臂越长质粒DNA的动态吸附容量越大，质粒DNA的动态吸附容量随配基密度升高而增大，在配基密度为47.4mmol/L gel时，质粒DNA的吸附容量最大为6.32mg/mL gel。最后，利用精氨酸亲和色谱从E. coli细胞裂解液中直接分离纯化超螺旋质粒DNA，优化了质粒DNA吸附和洗脱的条件，并详细讨论了上样量和配基密度对质粒DNA纯化效果的影响。结果表明，所得质粒样品的纯度和收率随上样量的增加而降低，质粒的收率随配基密度的增加而增大。利用R47-L-Sep色谱从3mLE. coli澄清细胞裂解液纯化制备了约0.35mg sc pDNA，约为Sousa等利用精氨酸亲和色谱纯化结果的27倍（12.8μg pDNA/mL gel）。
参考文献：
[1]. 融合蛋白GGH氮端延长类似物的克隆表达、分离纯化及初步活性评价[D]. 冯均尚. 江南大学. 2013
[2]. 代谢工程改造微生物合成甾体药物中间体ADD和TS[D]. 邵明龙. 江南大学. 2016
[3]. 质粒DNA发酵与分离纯化过程的研究[D]. 黄慧. 天津大学. 2003
[4]. 重组大肠杆菌高效分泌表达杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶[D]. 刘征. 厦门大学. 2008
[5]. 人表皮生长因子工艺的应用基础研究[D]. 童望宇. 浙江大学. 2001
[6]. 流通色谱介质的研制和生物大分子色谱分离[D]. 孙国勇. 天津大学. 2005
[7]. 嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的异源表达及热稳定性改造[D]. 李祝. 江南大学. 2018
[8]. Kigamicin生物合成基因簇中orf48和orf49的功能研究[D]. 贾沙. 福建师范大学. 2016
[9]. 新型晶胶介质及其蛋白质层析性能[D]. 王川. 天津大学. 2014
[10]. 精氨酸亲和色谱分离纯化超螺旋质粒DNA[D]. 白金山. 天津大学. 2013
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