长沙医学院基础医学院 长沙 410219
摘要 目的：探讨羧甲基壳聚糖对钛颗粒致心脏毒性的保护作用。 方法：利用分光光度计和紫外分光光度计分别检测乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性来观察心功能的变化、HE染色观察心脏组织病理改变。结果：钛颗粒使血清中LDH及CK-MB活性明显升高（P<0.01），而羧甲基壳聚糖能够明显降低LDH、CK-MB的活性。心肌HE染色结果显示，钛颗粒会使心肌细胞胞质淡染，有空泡细胞和坏死灶的形成，而羧甲基壳聚糖能够明显减轻钛颗粒导致的心肌毒性反应。 结论：羧甲基壳聚糖对钛颗粒致心脏的毒性作用起到一定的保护作用。
关键词：羧甲基壳聚糖；钛颗粒；心脏毒性
随着生活水平的提高，心血管疾病发病率逐渐上升，且出现了年轻化的趋势，驱使了心血管植入体的快速发展，而钛合金以其高耐腐蚀性、良好组织相容性、相对便宜以及安全系数高占据了医疗市场的主导地位。在钛合金广泛应用的同时，其毒理学作用也越来越受到人们的关注。大量的证据表明钛合金在机体复杂的内环境下抗腐蚀性能降低，其表面不断释放出的钛颗粒可导致组织细胞的变性和坏死、非特异性炎症、过敏反应，甚至肿瘤的形成，其机制并未完全研究清楚。羧甲基壳聚糖是一种具有良好生物相容性，无毒副作用的天然物质，具有抗凝血、抗炎、协同抗肿瘤[1]，螯合重金属离子[2]等功能，目前壳聚糖因其表面结构类似于球状海绵，有大量的孔隙，可以承载并达到缓释药物的效果从而延长药物治疗的时间[3]被广泛应用于载体。本研究将观察羧甲基壳聚糖是否能对钛颗粒导致的心肌毒性作用起到保护作用，从而为钛毒性的预防措施提供一定的理论依据。
1 材料
钛粉（清河县佳润金属材料有限公司）；羧甲基壳聚糖（德州海利安生物科技股份有限公司）；BD胰岛素注射器（Becton dickinson and Company）；乳酸脱氢酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）；肌酸激酶同工酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）；紫外分光光度计（UV757CRT）；可见分光光度计（722）；恒温水浴锅（DU-20G）；显微镜（CX21-BIM）；高速离心机（TGL-10B）。
2 方法
2.1 钛悬液的制备
将15mg的钛粉用95%的医用酒精于1.5mlEP管浸泡消毒，去其表面内毒素，离心4min（10000转/min），抽去上层酒精，用无菌PBS缓冲液反复清洗残留酒精后抽取1ml无菌PBS缓冲液于EP管中，制成约为15mg/ml的钛悬液。
2.2 2%羧甲基壳聚糖凝胶的制备
称取羧甲基壳聚糖粉末0.2g溶于10g三级超纯水中加热充分混匀，制成浓度为2%的羧甲基壳聚糖凝胶，高温高压灭菌备用。
2.3 实验分组
取健康家兔30只，随机分为A、B、C 3组，每组10只。A组为空白对照组，B组为钛中毒组，C组为羧甲基壳聚糖组。25%乌拉坦（4ml/kg）经耳缘静脉将兔子麻醉后，仰卧固定于手术台，备皮，铺无菌孔巾，沿胸骨体左缘切开皮肤，钝性分离第3、4肋肋间肌，暴露纵隔及心脏，剪开心包，于左室前壁心肌选取8点，A组用胰岛素注射器缓慢注射生理盐水，每点注射0.1ml。B组注射钛悬液和生理盐水，每点注射0.1ml。C组注射钛悬液及2%羧甲基壳聚糖，每点注射0.1ml。消毒缝合关闭胸腔。术后肌肉注射80万个单位的青霉素防感染。
2.4 LDH、CK-MB检测家兔心功能
术后一周心脏取血分离血清，严格按照测试盒说明书，用分光光度计在波长为460nm处检测乳酸脱氢酶（LDH）活力，紫外风光光度计在波长为340nm处检测肌酸激酶同工酶（CK-MB）活力。
2.5 HE染色观察家兔的心肌结构变化
取血完毕后，取心脏用生理盐水冲洗1０%甲醛溶液固定。10%甲醛溶液固定、修样、脱水，石蜡包理切成5μm厚的心脏组织切片，HE染色后光镜下观察。
2.6 统计学分析
所有数据应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，以（X±S）表示，多组间比较采用方差分析，并用SNK检验进一步两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 血清心肌LDH、CK-MB活力的检测结果
给药一周后结果表示，B组钛中毒组与A组空白对照组相比较，心肌酶LDH、CK-MB均明显上升（P<0.01）。C组羧甲基壳聚糖组LDH、CK-MB较B组钛中毒组均明显下降（P<0.01），如表1所示。
4 讨论
国外已有案例报告在耳部植入的钛助听器周围软组织发炎并发现散布的钛微粒[4]，国内一例钛夹掉落腹腔后形成了异物肉芽肿[5]，在这些磨损运动的极少的部位发现了钛对人体造成的伤害，提示我们应该注意其潜在的风险，尽管其抗腐蚀性能在逐步提高，但在人体复杂的内环境的腐蚀下会导致钛颗粒不断释放，巨噬细胞吞噬钛微粒产生的H202会加速钛的腐蚀导致钛微粒从钛表面释放，同时钛微粒一方面激活NF-κB信号通路，上调MIF、TNFα、COX-2这些炎症因子的表达，促进植入体周围炎症反应[6]，另一方面通过p38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路引发炎症反应[7]。目前针对于钛颗粒导致的骨溶解以及炎性反应有大量的研究及治疗方法，例如灌胃淫霍羊苷[8]、雷公藤[9]等都还处于动物实验阶段，而且通过阻断传导通路不能从根本上解决钛腐蚀对机体的损伤，因为这些治疗方式都具有药物依赖性，如果停止服用药物，钛颗粒依然会继续对机体造成损伤，而且长期服药必然会带来一定的副反应。我认为可以考虑在钛合金表面做壳聚糖涂层，一、能使钛合金有更好的组织相容性；二、利用其海绵结构使钛颗粒得到缓释从而抑制炎症反应的发生，减轻反应程度；三、随着壳聚糖在体内的降解而带出游离的钛颗粒；四、其抗凝血作用可以抑制金属支架的并发症——血栓的形成。
心肌酶谱临床上是常用来反映心肌损害的主要生化指标。尤其CK-MB做为心肌损伤标记物，其增高的程度能较准确的反映心肌损害的程度。LDH是糖的无氧酵解和糖异生的重要酶系之一，广泛存在于心脏、肝、肺和人体各组织内。心肌组织一旦损伤，血清LDH即见升高,可持续6～10d，CK-MB活性在3～8h即明显升高。对比A组空白对照组，钛颗粒注射到心肌内后，家兔血清中的LDH和CK-MB活性明显增加，病理学检查可见心肌细胞形态出现异常，说明心脏出现了损伤，提示钛颗粒可以诱导家兔出现心脏毒性。注射2%羧甲基壳聚糖后，可见钛颗粒所致的心脏毒性有一定逆转，心肌酶释放减少，心肌细胞水肿，炎性反应减少，说明2%羧甲基壳聚糖对钛颗粒所致的心脏毒性有一定的拮抗作用，能够保护心肌。但并未达到完全的保护作用。药物的效果往往与剂量成正比，可能是由于浓度太低的原因，接下来我们将会做进一步的研究，观察羧甲基壳聚糖的保护作用能否随浓度递增而增强。
参考文献
[1] Jain A,Jain S,Jain R,Kohli DV.Coatedchitosannanoparticles encapsulating caspase 3 activator for effective treatment of colorectral cancer.Drug Deliv Transl Res.2015 Sep 3.
[2]王林.EDTA-壳聚糖的制备及对Cd2+、Pb2+的吸附研究[D].广东海洋大学,2013.
[3]Kim J,Lin B,Kim S,et al.TGF-β1 conjugated chitosan collagen hydrogels induce chondrogenic differentiation of human synovium-derived stem cells.J Biol Eng.2015 Jan 14,9:1
[4]张华.英研究称体内植入钛合金仍存被腐蚀风险[J]. 中国钛业,2012,03:52.
[5]孙万林.腹腔镜胆囊切除术后钛夹遗留腹壁切口内形成异物肉芽肿1例报告[J].腹腔镜外科杂志,2006,11(1):64.
[6]潘孝云,张先龙,毛昕等.钛颗粒通过NF-κB信号通路上调炎症因子表达[J].浙江临床医学,2013,(1):1-3.
[7] Wang W,Wu C,Tian B,et al.The inhibition of RANKL-induced osteoclastogenesis through the suppression of p38 signaling pathway by naringenin and attenuation of titanium-particle-induced osteolysis.Int J Mol Sci.2014 Nov 28;15(12):21913-34.
[8]Shao H,Shen J,Wang M,et al.Icariin protects againsttitaniumparticle-induced osteolysis and inflammatory response in a mouse calvarial model.Biomaterials.2015 Aug;60:92-9.
[9]Huang J,Zhou L,Wu H,Triptolide inhibits osteoclast formation, bone resorption, RANKL-mediatedNF-қB activation andtitaniumparticle-induced osteolysis in a mouse model.Mol Cell Endocrinol.2015 Jan 5;399:346-53.
论文作者:颜姝
论文发表刊物:《临床医学教育》2017年10月
论文发表时间:2017/11/17
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