李慎菁[1]2002年在《gpc3/mxr7基因在肝癌发生、发展中的生物学功能研究》文中指出细胞表面蛋白聚糖多数为硫酸乙酰肝素类蛋白聚糖(HSPG)，按其与细胞膜结合方式，可分为叁类：①核心蛋白疏水区直接插入脂双层的粘结蛋白聚糖Syndecan家族；②通过与糖基磷脂酰肌醇(GPI)共价结合而锚定在细胞膜上的Glypican家族；③兼职蛋白聚糖，如β-glycan和CD44E。HSPG存在于所有粘附细胞表面，可接合肝素接合型蛋白如生长因子、细胞外基质成分、细胞—细胞粘附分子和与降解通路有关的分子。这些蛋白聚糖在细胞表面分布不同，其代谢途径各异，与细胞外基质成分、细胞因子相互作用所介导的信号转导通路不同，从而发挥着各自的作用。大量的研究表明它们在细胞生物学中具有重要的功能，调控着细胞的生长、增殖、粘附等行为，并且与肿瘤的发生、发展有着密切的联系。其中，glypican3／mxr7基因属于Glypican家族，通过羧基端共价结合GPI锚固定在细胞膜表面。目前的研究认为该基因参与调节机体的生长、发育，并且可能与肿瘤的发生、发展密切相关。 第一部分 gpc3／mxr7基因在肝癌及其它肿瘤中的表达 研究该基因在肝癌、肾癌、大肠癌等肿瘤及其正常组织中的表达情况。正常组织表达分布证实，gpc3／mxr7基因仅在成人的肺、肾脏中有低丰度的表达，在肝脏、心、脑等其它组织中均不表达；在肾癌、大肠癌及转移性的肝癌组织中不表达；而在肝癌组织中该基因mRNA的转录水平明显增加，在癌旁组织中基本不转录，与正常组织及其它肿瘤相比有显着性差异(P＜0.01)。原位杂交进一步证实，gpc3／mxr7基因在肝癌细胞中的转录水平显着增高，且主要集中在肝细胞癌的癌巢组织中。 Northern Blot结果显示，在79例肝细胞癌中，有58例肝癌组织可以检出gpc3／mxr7基因的表达(73.41％，58／79)，而癌旁组织中的转录水平极低，两者 博士学位论义gpc3／rar7基因在肝癌发生、发展中的生物学功能研究 中文摘要 相比差异显着（P＜0刀1）。并且在55例＊P阴性的肝癌中，有4Z例肝癌组织表 达gp c恤r7基因门6．36O，42乃5L这一结果表明雕c砌r7基因的表达与AFP 无明显关系，同时提示在临床肝癌基因诊断上gpc3／mr7的适用范围优于AFP。 综合病理指标分析发现：gpc3／mxr7基因的表达同肿瘤大小明显正相关， gpc3／Inxr7在肿瘤直径sscm ’J’肝癌中的表达率为50刀0％（1厘0X而在＞scm肝癌 中的表达率为sl．36％＊8乃9），二者相差显着叩＜0刀1XgpC3h）lxC7基因的表达 与肿瘤病理分级明显正相关，gpc3／mxr7基因在高分化肝癌门二 级）中的表达 率为44．44％O乃），而在低分化门二V）肝癌中的表达率为77二4％K4厂0L 二 者有显着差异o＜0刀5人耶C3／mxr7基因的表达与患者的年龄／性别、有无包膜、 有无癌栓形成、有无肝内转移（子灶形成）及乙肝病毒感染情况均不相关。 有意义的是gpc3har7基因在肾癌组织中井不表达，而在其癌旁组织和正常 成人肾脏中均有低丰度的表达，与肝癌的表达情况正好相反，提示gpCU沏刀7基 因在肿瘤发生发展中有着复杂的调控机制。 上述结果提示，该基因的表达具有组织特异性，是肝癌特异性高表达基因； gPc3har7基因在不同的组织中具有不同的生物学功能，甚至起着完全不同的作 用，可能与肿瘤组织类型、发病机制等密切相关。I 第二部分gPcjhlirr7基因在肝癌中的转录调控 gPc3hlirr7基因在正常成人肝脏中不表达，而在刀．41％的肝癌组织中出现异 常高表达行为，这一现象表明该基因有其特定的表达调控机制。因而阐明其转录 调控的机制，以及在肝癌组织中基因突变的检测有利于基因功能与应用开发的深 入研究。 在gPC… 7基因的启动子区上游有一个GC含量丰富的甲基化岛，椎测其 对基因的转录具有一定的调控作用。针对8例肝癌组织、3例正常肝组织，采用 特异性甲基化敏感限制性内切酶进行酶切及 Southern blot检测，结果发现，在正 常成人的肝脏中该甲基化岛表现为高度的甲基化，从而抑制了gpc3／mr7基因启 动子的活性，基因表达关闭；而在检测的8例肝癌组织中除1例为部分甲基化， 其余 7例甲基化岛均处于去甲基化状态，gpc汕xr 7基因表达开放，其 mRNA转可 录水平明显增高。随后采用PCRSSCP的方法，对8对肝癌组织进行突变检测， 均未发现阳性结果。上述实验结果初步证实，gpcMllxr7基因启动子区上游的甲 3 博士学位论文gpC3／Inx7基因在肝癌发生、发展中的生物学功能研究 中文摘要 基化岛在该基因的表达调控中起着重要的作用。出生后的高度甲基化，以及在肝
方宁波[2]2013年在《MXR7和MMP2在肝细胞癌中的表达及其临床意义》文中研究说明目的：检测米托蒽醌抗性相关基因(mitoxantrane-resistant7,MXR7)及基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)在肝细胞癌(Hepatocellular carcino-ma, HCC)中的表达情况，并进一步研究MXR7及MMP-2的表达与肿瘤大小、分化程度、临床分期及脉管浸润等临床病理参数的关系以及两者表达之间的相关性，以探讨MXR7与MMP-2在肝细胞癌发生、发展中的作用。方法：收集2008年01月-2011年12月期间南昌大学第一附属医院普外科的HCC患者肝癌组织及癌旁2cm组织的石蜡包埋标本（本文所称癌旁组织均指癌旁2cm组织，下同）各60例。通过免疫组化Envision法检测MXR7和MMP-2蛋白在HCC患者癌肿和癌旁组织中的表达情况，并统计各指标在各分组组织中表达的阳性率，数据输入SPSS13.0软件，采用χ2检验分析两样本率的比较，MXR7及MMP-2表达的相关性分析采用Pearson列联系数关联性检验。结果：1、MXR7和MMP-2在HCC组织中的阳性表达率分别为71.7%（43/60）和68.3%（41/60）；均分别高于两者在癌旁组织中的阳性表达率（10.0%，23.3%），且两者之间的表达差异均具有统计学意义（P＜0.05）。2、MXR7在伴有脉管浸润的肝癌组织中的阳性表达率为90.9%（20/22），在不伴有脉管浸润肝癌组织中的阳性表达率为60.5%（23/38），两者之间的差异有统计学意义（P=0.012）；MXR7在Ⅰ/Ⅱ（期）肝癌组织中的阳性表达率为59.4%（19/32），Ⅲ/Ⅳ（期）组阳性率为85.7%（24/28），两者之间的差异有统计学意义（P=0.024）；MXR7在不同性别、年龄、血清AFP水平、肿瘤大小、分化程度及肿瘤不同结节数组中的表达差异均无统计学意义(P＞0.05)。3、MMP-2在伴有脉管浸润的肝癌组织中的阳性表达率为86.4%（19/22），在无脉管浸润肝癌组织中的阳性表达率为57.9%（22/38），两者之间的差异有统计学意义（P=0.022）；MMP-2在Ⅰ/Ⅱ（期）肝癌组织中的阳性表达率为56.3%（18/32），Ⅲ/Ⅳ（期）组阳性率为82.1%（23/28），两者相比较差异有统计学意义（P=0.031）；MMP-2在不同性别、年龄、血清AFP水平、肿瘤大小、分化程度及肿瘤不同结节数组中的表达差异均无统计学意义(P＞0.05)。4、Pearson相关性分析显示，在肝癌组织中MXR7与MMP-2的表达之间明显相关（C=0.288，P=0.026）。结论：1、 MXR7和MMP-2高表达于临床肝细胞癌组织，参与肝癌的发生、发展；2、MXR7与MMP-2在肝细胞癌组织中的表达与肝癌的临床TNM分期及脉管浸润有关，而与性别、年龄、血清AFP水平、肿瘤结节数目、肿瘤大小及分化程度均无明显关系；3、肝细胞癌组织中MXR7与MMP-2的表达明显相关，联合检测两者的表达有助于肝细胞癌的早期转移及预后的判断并指导治疗。
余彬彬[3]2007年在《Glypican-3在肝癌的表达和意义及其在肝癌发生中的作用》文中指出背景和目的原发性肝细胞癌(HCC)是一种常见恶性肿瘤,其发病隐匿,早期无明显的症状,而且恶性程度高、进展快,临床就诊时约2/3的患者已属中晚期,五年生存率很低,因此,早期诊断是提高肝癌疗效的关键因素之一。AFP是目前最常用的检测肝癌的比较敏感和可靠的血清学指标,大约60-70%的肝癌患者血清AFP阳性。寻找出一个新的、在AFP阴性血清也能检测到的特异的标志物将可提高肝癌的早期诊断水平,进而达到早期治疗提高疗效目的。近来一些研究表明GPC-3很可能是一个敏感的肝癌标志物和基因治疗的靶基因,本研究对大量血清标本和组织进行检测,明确HCC患者中GPC-3表达情况、及其表达水平和临床参数之间的关系。同时通过检测人肝癌及相应癌旁肝组织中GPC-3与IGF-Ⅱ基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达情况,进一步揭示HCC的发生发展机理。方法对大量血清标本进行ELISA检测(肝癌患者血清60份、正常人14份、肝炎或肝硬化患者血清各13份)。用RT-PCR检测GPC-3与IGF-Ⅱ基因的mRNA和在70例人肝癌组织、癌旁肝组织和18例正常肝组织中的表达情况,以及与肝癌患者的血清AFP水平、肿瘤个数、肿瘤直径、临床分期、有无术后复发、有无肝外转移、有无门静脉癌栓、病理分级等指标的关系。同时用免疫组织化学方法检测GPC-3与IGF-Ⅱ基因的蛋白在80例人肝癌组织、癌旁肝组织和8例正常肝组织中的表达情况,以及与肝癌患者的血清AFP水平、肿瘤个数、肿瘤直径、临床分期、有无术后复发、有无肝外转移、有无门静脉癌栓、病理分级等指标的关系。结果GPC-3血清中阳性临界浓度定为60pg/ml时,GPC-3肝癌患者血清中的阳性率为:66.67%(40/60);GPC-3在肝炎、肝硬化组血清中的阳性率为:15.38%(2/13);在14例正常人血清中不表达。GPC-3在肝癌血清中的阳性率明显高于在肝炎、肝硬化组血清中的阳性率,两者比较有显着性差异性(P＜0.05)。GPC-3在肝癌患者血清中的表达与临床分期、肝外转移、术后复发及血清AFP水平相关(P＜0.05),而与门静脉癌栓、肿瘤个数、肿瘤大小、HBsAg及肿瘤分化程度无明显关系(P＞0.05)。在人肝癌血清中,GPC-3的阳性率(66.67%)与AFP的阳性率(66.67%)未见差异(P＞0.05)。用RT-PCR检测到70例HCC组织中GPC-3mRNA的阳性率为82.85%(58/70)明显高于癌旁组织的阳性率34.28%(24/70)(P＜0.01);58例HCC组织中GPC-3mRNA表达水平(0.596±0.205)明显高于24例癌旁组织中表达水平(0.428±0.137)(P＜0.05);18例正常肝组织中未检测到GPC-3的表达。70例HCC组织IGF-ⅡmRNA阳性率为92.86%(65/70)明显高于癌旁组织的阳性率81.43%(60/70)(P＜0.05);65例阳性表达IGF-ⅡmRNA的HCC组织中表达水平为(0.750±0.309)明显高于在60例癌旁肝组织中的表达水平(0.648±0.237)(P＜0.05);18例正常肝组织IGF-Ⅱ基因的表达水平(0.495±0.192)。GPC-3 mRNA和IGF-ⅡmRNA在肝癌组织中的表达呈正相关(相关系数r=0.281,P=0.038),而两者在癌旁肝组织的表达无相关性(相关系数r=-0.165,P=0.500)。用免疫组化方法检测GPC-3、IGF-Ⅱ在肝癌组织中的阳性率分别为73.75%和76.25%,而在癌旁肝组织中的阳性率分别为53.75%和48.75%,差异有显着性(P＜0.05);在癌组织中glypican-3与IGF-Ⅱ的表达呈正相关。两种方法检测同时发现glypican-3基因和IGF-Ⅱ基因在人肝癌组织中的表达与临床分期、肿瘤分化程度、肝外转移及肿瘤大小相关(P＜0.05),而与门静脉癌栓、肿瘤个数、血清AFP水平及术后复发无明显关系(P＞0.05)。结论GPC-3在HCC患者血清中中特异高表达,可作为一肝癌血清标志物;其与AFP联合检测可有效的提高肝癌的诊断率;血清中GPC-3与肝癌的临床分期、肝外转移、术后复发及血清AFP水平等密切相关,可作为监测肝癌愈后及预防复发的指标。GPC-3与IGF-Ⅱ基因在肝癌组织异常高表达,可促使肝癌细胞增殖,两者可能在HCC的发生、发展和转移中起重要作用;它们作为分子靶标在肝癌的基因诊断和治疗中的作用尚待进一步探讨。
阚学峰[4]2004年在《肝癌相关基因差异表达的初步研究》文中认为肝癌的发生和发展是多基因参与、多阶段进行的复杂过程，要了解其发生、发展和浸润转移的分子机制，综合分析肿瘤发生过程中大量基因的表达变化是十分必要的。 目的：对获得的肝癌相关差异表达基因进行生物信息学分析，利用RT-PCR技术研究AFP、COL1A2、UBD、FN、Genimin、GPC3、SPINT2、Stathmin、VEGFB和IGFBP3等10个基因在肝癌组织和癌旁组织间的差异表达情况，及与临床病理学特征的关系；依据10个基因差异表达情况对肝癌分子切缘进行初步研究；建立多重RT-PCR检测基因表达的方法。 方法：收集肝癌手术标本并保存于-80℃；挑选125个差异表达基因阳性克隆进行测序和生物信息学分析；提取手术标本的mRNA后利用RT-PCR对10个肝癌相关基因的差异表达进行半定量分析，多重RT-PCR扩增实验。 结果：(1)125个克隆测序后经生物信息学分析获得基因83个，其中细胞分裂相关基因5个，参与细胞信号转导或通讯的基因5个，参与细胞结构或运动的基因7个，细胞或器官防御相关基因11个，参与细胞内基因转录或蛋白表达的基因22个，代谢相关基因18个，另有15个未归类基因。(2)10个基因在50例患者癌内和癌旁组织中的表达结果表明它们在癌和癌旁组织之间存在差异表达，除去癌内低表达基因IGFBP3以外，其余9个基因在癌和癌旁组织间的差异表达具有显着性差异。(3)SPINT2在癌和癌旁组织间的差异表达和肿瘤大小有关，COL1A2的差异表达和血清AFP水平及肿瘤组织学分级有关，FN和AFP基因的差异表达都和血清AFP异常相关；10个基因的差异表达均和是否携带乙型肝炎表面抗原无关。(4)对25例患者距手术切缘2cm、1cm肝组织、癌旁组织和癌组织的检测表明，10个基因的表达呈现递减(癌高表达基因)或递增(癌低表达基因IGFBP3)的趋势。(5)建立了多重RT-PCR检测基因表达的方法。 结论：(1)125个克隆测序后经分析获得83个肝癌相关高表达基因。(2)天津医科大学硕士学位论文中文摘要AFP等9个肝癌相关高表达基因在癌内和癌旁组织之间存在显着的差异性表达。(3)AFP等10个基因在癌周组织内的表达呈现递减(癌高表达基因)或递增(癌低表达基因IeFBP3)的趋势。(4)AFP、eoLzAZ、sPINTZ、FN等4个基因和肿瘤大小、组织学分级、血清AFP等因素有关。(5)10个基因差异表达提示肝癌组织周围存在分子切缘。(6)成功建立了多重RT一PCR检测基因表达的方法。
韦薇[5]2004年在《肝癌发生过程中差异表达基因的研究》文中认为目的 对应用基因芯片筛选的树鼩诱发性肝细胞癌(HCC)差异表达基因——超氧化物歧化酶1(SOD1)、谷胱甘肽转移酶A1(GSTA1)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)等用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学等方法检测它们在树鼩HCC、癌旁和癌前活检肝组织以及人HCC、癌旁肝组织中的表达情况，以进一步验证基因芯片检测的结果，并探讨这些基因在HCC形成中的作用。 方法一、动物HCC部分：①实验树鼩随机分为两组，实验组给予黄曲霉毒素B_1(AFB_1)，对照组不给予AFB_1；②取实验组11例发生HCC动物的HCC组织、癌旁及癌前活检肝组织，用半定量RT-PCR方法检测SOD1、GSTA1、SCF、TPO、HIAP1、TMSB10、NOP120 mRNA的表达水平；③对扩增出来的树鼩SoD1、GSTA1、SCF基因片段进行测序；④对实验组出癌动物的HCC组织、癌旁、癌前肝组织及未出癌动物的第120周活检肝组织，以及对照组动物第45周、120周活检肝组织，用免疫组织化学方法检测SOD1、GSTA1蛋白的表达情况。二、人HCC部分：①用RT-PCR方法检测35例人HCC及相应癌旁肝组织中SOD1、GSTA1 mRNA表达情况；②用免疫组化方法检测35例人HCC及相应癌旁肝组织中SOD1、GSTA1蛋白的表达情况；③分析SOD1、GSTA1蛋白在HCC组织中的表达情况与相应临床指标的关系，包括患者年龄、肿瘤大小、肿瘤个数、有无胞膜、分化程度、患者血清AFP水平、HBsAg感染、有无门静脉癌栓、有无复发转移等。 结果一、动物HCC部分①至实验第165周，实验组54只树鼩中共有35只发生HCC，发生率为64.8％，对照组动物无一例出癌；②RT-PCR结果：所有11例树鼩HCC、癌旁及癌前肝组织经RT-PCR扩增后，均有SOD1、GSTA1、SCF、TPO、HIAP1、TMSB10、NOP120表达，但表达水平不同。SOD1 mRNA在树鼩HCC中表达水平明显低于癌旁及癌前肝组织(分别为1.200±0.926、万窟发生过窟价省尸浦送寡因肘歼广3.x43士1一34、2.945士1.432，均夕<0.01);GSTAlm丑NA在树韵HCC中表达水平明显低于癌旁及癌前肝组织(分别为1.149士0.320、2.247士1.201、2.“O士1.324，均户<0.05);scFmRNA在树晌HCC、癌旁及癌前肝组织表达水平依次升高(分别为0‘201士0.123、0.279士0.147、0.390士0.149)。其中HCC组织中SCFm丑NA表达水平明显低于癌前肝组织(p=0.003);TPO mRNA在树韵HCC、癌旁及癌前肝组织表达量水平依次升高(分别为0.161士0.096、0.1%士0.1 10、0.231士0.046)。其中HCC组织中TPO InRNA表达水平明显低于癌前肝组织，=0 .045);HIAPI、TMSB 10、NOplZO mRNA在树韵的HCC、癌旁及癌前肝组织中表达差别无显着性(娜>0.05);③DNA测序:树勃肝组织中扩增出SODI、GSTAI、SCF片段与人类相应基因分别有89%、90%、90%的同源性;④免疫组化结果:树韵HCC、癌旁、癌前及实验组未出癌动物第120周肝组织中，SODI蛋白表达的综合得分别为1 .5 14士1 .084、3.075士1.559、2.800士2.015、2.640士1 .188;对照组树韵第45周、120周肝组织中SODI蛋白表达的综合得分别为3.075士1.482、2.517士1.677;HCC中SODI蛋白表达的综合得分明显低于癌旁及癌前肝组织(均尸<0.05)，也低于实验组未出癌第120周及对照组第120周肝组织(均尸<0.05)。癌前与对照组第45周、实验组未出癌第120周与对照组第120周肝组织比较，SODI蛋白表达水平无明显差别(均尸>0.05);树韵HCC、癌旁、癌前及实验组未出癌动物第120周肝组织中，GSTAI蛋白表达的综合得分别为2.391士1.899、3.000士1.212、3.769士2.379、 1.805士1.067;对照组树的第45周、120周肝组织中GSTAI蛋白表达的综合得分别为2.125士0.913、2.608士1.2n;Hcc中GsTAI表达水平与癌旁无明显差别(p=0.306)，但明显低于癌前肝组织勿=0.015);GSTAI在HCC中的表达水平与实验组未出癌第120周及对照组第120周肝组织无明显差别(均夕>0.05);癌前肝组织中GSTAI蛋白的表达水平明显高于对照组第45周(p<0.001)，实验组未出癌第120局肝组织GSTAI蛋白的表达水平明显低于与对照组第120周(p=0.013);二、人HCC部分①RT-PCR结果:在35例人HCC及癌旁肝组织中，SODI mRNA的表达水平在癌组织明显低于癌旁组织(分别为0.888士0.466，1.441士0.921，p<0.001);GsTAlmRNA的表达水平在癌组织为0.937士0.707，明显低于癌旁组织2.216士1 .601(p=0 .00);soDI与GSTAI两者InRNA表达水平无明显相关 (件一0.042，p=0 .810)。②免疫组化结果:SoDI蛋白在Hcc的表达率(71.4%)明显低于癌旁肝组织(943%)，(p=0 .011);GSTAI蛋白在HCC和癌旁肝组织万碑君全过霍沪若异浦布蒸因种班处中表达阳性率分别为82.9%和100%，前者明显低于后者勿=0.025);SODI蛋白在HCC的表达综合得分明显低于癌旁肝组织(分别为1 .634士1.042、3.837士1 .432，p<0.001);在HCC、癌旁肝组织中GSTAI蛋白表达的综合得分别为3.300士2.110、7·446士1.930，前者明显低于后者勿<0.001);两种蛋白表达综合得分无明显相关(二一0.165，p=0 .344)。③蛋白表达与临床指标联系:SODI蛋白综合得分在病理分级为I级的人HCC中(2.557土1 .238)，明显高于n级(1 .725劲.996)、111级(1 .264?
刘晓雁[6]2007年在《复制许可因子CDT1在人正常肝脏组织和肝癌组织中的表达与意义》文中指出通过从临床收集正常肝组织、HBsAg阳性肝癌(肝细胞癌)组织与HBsAg阴性肝癌组织的石蜡切片标本,运用免疫组织化学方法检测CDT1在肝组织中的表达水平,分析研究CDT1在肝癌中的表达特征及意义。研究发现CDT1在正常肝脏组织中呈强阳性表达,阳性着色定位于胞浆。在HBsAg阳性的肝癌细胞中CDT1的表达明显降低,呈阴性或弱阳性,二者相比差异有统计学意义(P<O.05),表明CDT1可能参与了肝癌的形成和发展。HBsAg阴性肝癌组织与HBsAg阳性肝癌组织相比CDT1表达增高,提示CDT1表达与HBV的感染和复制水平有关,并可能与HBV导致肝癌形成的机制密切相关,其作用机制值得深入探讨。
满晓波[7]2002年在《阵列文库及阵列文库消减杂交用于肝癌相关基因筛选、表达和转录调控的初步研究》文中进行了进一步梳理原发性肝癌的研究在我国基础和临床医学研究中占有重要的地位，肝癌相关基因的克隆、鉴定、表达检测和转录调控对于从基因水平认识肝细胞的生长、分化、再生和恶变的分子机理、阐明其信号转导过程和途径，不仅具有重要的研究意义，而且对于肝癌的早期基因诊断和治疗具有重大的临床应用价值和经济利用价值。本文建立了基于DNA阵列的阵列文库消减杂交技术(Arrayed Library Subtraction Hybridization,ALSH)。以此技术结合基因芯片技术用于cDNA文库的大规模高效基因筛选，将之应用于肝脏cDNA文库的小规模的验证性研究得到了相当数量的已知基因、已知EST和一个新基因克隆；结合肝癌表达谱检测进行了肝癌相关基因的差异表达研究。阵列文库消减杂交结合体内染色质免疫沉淀可以进行全基因组尺度内的转录因子调控序列检测，我们进行了较小规模的验证确定了这一平台的有效性和实用性，进行了肝癌细胞经丝裂霉素处理后核转录因子NFкB的表达和结合位点检测，获得NFкB在此状态下的结合位点序列克隆的阵列文库，得到一些新的受NFкB调控的下游基因的启动子结合序列。 第一部分 阵列文库及阵列文库消减杂交用于肝癌相关基因筛选和差异表达的研究 利用平均插入子大小1.60kb的真核表达载体pcDNA3.1正常肝脏质粒文库制备阵列文库，利用BioRobotics TAS多功能基因芯片点样仪进行肝脏阵列文库消减杂交。利用阵列文库和经消减杂交筛选的基因制备基因芯片用于肝癌表达谱检测。制备了大鼠原发性肝癌模型用于基因表达检测。 结果显示，肝脏阵列文库消减杂交得到了相当数量的已知基因和一个新基因片段，利用单链环化反向巢式PCR进行5’RACE得到一个极低丰度的新基因搏士学位论文 阵列文库及阵列文库消减杂交用于 中文摘要——拙W。肝癌表达谱基因芯片检测发现一个肝癌中相对癌旁组织特异性高表达的mxr7基因和肝癌中不表达的CypZel基因。大鼠原发性肝癌模型模拟了从肝脏化学性炎性损害、肝硬化、肝癌早期和肝癌晚期的各个阶段。mxr 7基因的大鼠同源基因OCi－5在正常大鼠正常肝脏中表达极低，在大鼠肝癌组织中OCi－5表达急剧升高，随着肝癌的进展表达逐渐上升，在肝硬化阶段OCi－5的表达高于正常肝脏，在整个肝癌的发生发展过程中oci巧的表达是逐渐升高的。CypZel基因在人肝硬化中的表达低于正常肝脏，而在肝癌中则几乎是完全不表达，在大鼠肝癌发生发展过程的变化同OCi．5相反，表达明显下降直至几乎完全不表达。 结果提示，阵列文库消减杂交的方法可以高效筛选CDNA文库，得到文库中的所有基因克隆。可以用极低的人力物力和财力达到同整个文库随机测序相同的结果，利用阵列文库消减杂交从某种特定的生物、组织或细胞的CDNA文库中筛选全部表达基因具有极大的应用价值，不但可以应用于本项目的肝脏和肝癌文库筛选，还可以广泛地应用于其他领域的基因克隆工作。小规模的验证性研究中得到了一个新基因m丁，这个基因是一个低表达基因，正在进行进一步的研究。mxr7的大鼠同源基因oci－5基因同肝癌的演化关系密切，并且在肝癌早期已经发挥其相应的功能，在肝癌的癌前病变时期即肝脏的炎性损害阶段和肝硬化阶段的表达说明OCi－j基因表达上调在肝癌发生之前尤其是严重肝硬化时就己经发生，提示OCi－5基因不但可以作为肝癌的诊断指标，也可以作为肝癌癌前病变的指标，能够在肝硬化时期作出肝癌高危人群的预警。CypZel在肝癌细胞中可能是完全关闭的，并且也随着肝硬化和肝癌的进展而逐渐降低。mxr沏dociJ基因和CypZel基因与肝硬化和肝癌的发生发展密切相关，在肝癌的演化和进展过程中起重要作用，并且提示可能会具有重要的诊断和理论研究价值。第二部分 阵列文库消减杂交结合染色质免疫沉淀方法用于基因转录调控的 研究 转录调控是基因功能研究中的重点，转录因子对靶基因的结合和调控是转录调控中的主要研究内容，染色质免疫沉淀方法可以进行体内转录因子的结合序 列的状态与变化的检测的新的强有力工具。结合我们的阵列文库消减杂交技术可 以在包括人类在内的复杂基因组中进行全基因组尺度内的大规模转录调控序列 的研究。我们建立了这样一个研究平台，进行了较小规模的验证确定这一平台的 有效性和实用性，同时进行了肝癌细胞 SK－HEP经丝裂霉素刺激后 NF出的表 达和结合位点检测，从而探讨其在肝癌化疗药物耐药中的作用，得到一些NFth 在此状态下的结合位点和受调控的下游基因。 结果显示，50冷ml丝裂霉素使 NF。B进入细胞核，而且在 8 ／J’时细胞内 5博士学位论文 阵列文库及阵列文库消减杂交用于 中文摘要 肝癌相关基因筛选、表达和转录调控的初步研究NF。B总量增加，提示 NF。B自身的表达增加。Western Blot检测丝裂霉素处理后不同时间内总蛋白中的 NF K B含量升至较高水平，RTPCR方法检测 NF。B的基因表达
刘士源[8]2012年在《RNA干扰沉默GPC3基因诱导肝癌细胞凋亡及其机制的研究》文中研究指明背景与目的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是严重威胁全世界人民健康和生存的恶性肿瘤之一,因其早期诊断困难,极易复发转移,放化疗效果不佳而被称为“癌中之王”,所以探索及寻找新的HCC标记物多年来一直是HCC研究领域的热点。近年来,随着人类基因组学、蛋白质组学、肿瘤免疫等相关研究技术的飞速发展,HCC肿瘤标志物的研究已取得了长足的进展。研究发现磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3, GPC3)是HCC患者血清及癌组织中过度表达的癌抗原之一,而且可能与肝癌的一对前期病变,慢性肝炎(CH)和肝硬化(LC)的发展有关,初步展示出作为新的HCC蛋白类标志物的临床应用潜能。此外,作为一种癌蛋白,GPC3对HCC细胞的生长与增殖等生物学行为亦具有重要作用,具体机制目前研究尚不明朗。所以深入研究GPC3促进HCC发生发展的分子机制,阐明GPC3在肝癌细胞中促进增殖和凋亡抵抗作用及具体分子机制,为肝癌基因靶向治疗提供理论依据,对探讨GPC3在HCC早期诊断、治疗甚至预后判断中的价值具有重要意义。本项研究首先设计合成针对GPC3基因的StealthTM RNAis,瞬时转染高表达GPC3蛋白的HCC细胞株HepG2,之后建立RNA干扰(RNAi)抑制HepG2细胞GPC3基因表达的实验条件,观察利用RNAi在转录水平靶向性抑制GPC3基因表达对人肝癌细胞株HepG2生长、凋亡的影响及具体分子机制。方法1.用ELISA法及Western blott方法检测GPC3蛋白在肝癌细胞株的表达水平。2.设计合成针对GPC3基因的StealthTM RNAis,使用转染试剂LipofectamineTM RNAi Max transfection Agent瞬时转染高表GPC3蛋白的HCC细胞株HepG2,采用荧光定量PCR方法检测SealthTM RNAi对HePG2细胞GPC3表达的影响,并筛选具有最佳沉默效应的StealthTM RNAi用于之后的基因沉默实验。3.选取具有最佳沉默效应的StealthTM RNAi转染并沉默HepG2细胞株GPC3的表达,用SRB方法观察各组细胞的增殖活性；用TUNEL法检测沉默GPC3后细胞的凋亡情况：流式细胞术检测GPC3基因沉默后HepG2细胞的凋亡率。4Western blott方法检测不同时间点GPC3沉默前后凋亡相关蛋白的表达水平变化,探索GPC3沉默后HCC细胞凋亡的具体分子机制。结果1.肝癌细胞系HepG2、Huh-7高表达GPC3,而SMMC-7721肝癌细胞株低表达GPC3。2.转染GPC3靶向StealthTM RNAi可明显抑制HepG2细胞GPC3基因表达水平。其中HSS149与叁条StealthTM RNAi的Cocktail对GPC3的表达具有更强的抑制作用。与空白组相比,HSS149转染48及72小时后HepG2细胞中GPC3基因表达水平明显下降(95.90%、96.25%)；Cocktail转染后GPC3基因表达水平下降更明显(96.27%、96.36%)。3.GPC3靶向StealthTM RNAi可明显抑制HepG2细胞的增殖。Cocktail转染24、48及72小时后,HepG2细胞的增殖的抑制率分别为：40.67%,48.34%和57%。4.GPC3靶向StealthTM RNAi转染可明显诱导HepG2细胞发生凋亡,TUNEL法可见明显凋亡小体,流式细胞仪检测发现,转染72小时后,HepG2细胞凋亡率明显上升。5.GPC3靶向StealthTM RNAi转染后,HepG2细胞GPC3、Bcl-2、Procaspase-3以及细胞线粒体Cytochrome c蛋白水平明显降低,而Bax及细胞胞浆中Cytochrome c的蛋白水平明显升高。结论1.GPC3在肝癌细胞系HepG2、Huh-7中高表达。2.GPC3靶向StealthTM RNAi可明显抑制HepG2细胞中GPC3基因和蛋白的表达水平。3.GPC3靶向StealthTM RNAi转染可明显抑制HepG2细胞的增殖。4.GPC3靶向StealthTM RNAi转染可明显诱导HepG2细胞发生凋亡。5.沉默GPC3基因诱导HepG2发生凋亡可能是通过Bax/Bcl-2/Cytochrome c/Caspase-3信号通路完成。6.GPC3基因表达在HCC的凋亡抵抗以及发生发展中起重要作用,其可作为新颖的HCC基因治疗靶点而需要进一步深入研究。
李雪洁[9]2015年在《GPC3在卵巢透明细胞癌中的表达及其临床病理相关性研究》文中进行了进一步梳理目的:1.探讨卵巢透明细胞癌的临床病理特征及其生物学行为;2.检测GPC3蛋白在卵巢透明细胞癌与人体常见肿瘤组织及癌旁组织中的表达及分布;3.探讨GPC3蛋白和mRNA在卵巢透明细胞癌中的表达及临床意义。方法:1.回顾性分析南京医科大学第一附属医院2009年8月到2014年1月住院并手术治疗的45例卵巢透明细胞癌患者,并以同期的52例卵巢浆液性癌为对照,比较其临床病理特征,对治疗的反应及预后等。2.应用免疫组织化学方法检测GPC3蛋白在卵巢透明细胞癌组织与人体常见肿瘤组织及癌旁组织中的分布及表达,并分析GPC3蛋白表达水平的差异。3.采用免疫组织化学方法分别检测83例卵巢癌组织(透明细胞癌45例、浆液性癌20例、粘液性癌18例)、20例浆液性囊腺瘤及20例正常卵巢组织中GPC3蛋白的表达情况,实时荧光定量PCR法检测38例卵巢癌组织(透明细胞癌20例、浆液性癌10例、粘液性癌8例)、5例浆液性囊腺瘤和5例正常卵巢组织中mRNA的表达情况,并分析GPC3蛋白及mRNA与卵巢透明细胞癌临床病理参数及预后的相关性,探讨其在鉴别诊断和临床治疗中的重要意义。结果:1.卵巢透明细胞癌与卵巢浆液性癌患者临床病理特征的比较结果:卵巢透明细胞癌的组织病理特征与浆液性癌不同,卵巢透明细胞癌平均发病年龄为(50.42±10.05)岁与卵巢浆液性癌患者(53.81±8.94)岁相比,平均发病年龄小3岁(P=0.04);卵巢透明细胞癌FIGO分期早期患者(I-II期)占62.22%(28/45)显着高于卵巢浆液性癌28.84%(15/52),(p=0.000);卵巢透明细胞癌化疗耐药占37.78%(17/45)高于浆液性癌11.54%(6/52),透明细胞癌更易铂类耐药(p=0.002),差异均有统计学意义(p<0.05)。血ca125升高者分别占82.22%(37/45)和82.69%(43/52),肿块最大直径≥10cm者分别占44.44%(20/45)和26.92%(14/52)二者相比,差异无统计学意义(p>0.05)。卵巢透明细胞癌患者i-ii期的中位生存时间是48个月,浆液癌患者i-ii期的中位生存时间是57个月,透明细胞癌iii-iv期的中位生存时间是14个月,浆液性癌iii-iv期的中位生存时间是28个月。对于i-ii期和iii-iv透明细胞癌患者平均生存时间均显着短于浆液癌患者(p<0.05)。kaplan-meier生存曲线log-rank检验卵巢透明细胞癌患者i-ii期和iii-iv期存活率均小于浆液性癌(p均<0.05)。卵巢透明细胞癌和卵巢浆液性癌中患子宫内膜异位病史者分别占28.89%(13/45)和7.69%(4/52),子宫内膜恶变者分别占11.11%(5/45)和0.00%(0/52),差异均有统计学意义(p均<0.05)。卵巢透明细胞癌中he切片发现5例异位的子宫内膜发生腺上皮不典型增生移行恶变为透明细胞癌的过程,表明卵巢透明细胞癌由异位子宫内膜恶变而来。2.检测gpc3蛋白在卵巢透明细胞癌与人体常见肿瘤组织及癌旁组织中的表达及分布情况gpc3蛋白在卵巢透明细胞癌的阳性表达率为90.91%(10/11),肝细胞肝癌中30.77%(4/13),食管鳞形细胞癌20%(1/5),前列腺腺癌25%(1/4),阴道鳞形细胞癌20%(1/5),肺鳞形细胞癌33.33%(2/6),胃腺癌25%(1/4),鼻咽癌25%(1/4)。卵巢透明细胞癌大部分呈相对特异性高表达,其他癌组织低表达,fisher精确检验总体组间的多重比较,差异具有统计学意义(p=0.023)。两两比较fisher精确检验,仅卵巢透明细胞癌与其他组织类型差异具有统计学意义(p均<0.05)。其他常见肿瘤组织及癌旁组织中均未发现gpc3蛋白的表达:肺腺癌,胆管腺癌,胰腺腺癌,乳腺导管内癌,肾脏透明细胞癌。肺组织,食管粘膜,胃粘膜,肠粘膜,胰腺组织,肝脏组织,乳腺组织等均未发现gpc3蛋白表达。而在胚胎肝、胚胎脾、胚胎肺、胚胎肾上腺、胚胎肾脏、脐带中有弱阳性表达。3.卵巢透明细胞癌中gpc3蛋白阳性表达率和mrna表达量(82.2%;1.3261±0.4936)均明显高于浆液性癌(20%;0.4265±0.0294)、粘液性癌(5%;0.2652±0.1039)、浆液性囊腺瘤(0%;0.1413±0.0113)、正常卵巢组织(0%;0.2914±0.0481),差异有统计学意义(p值均<0.01)。gpc3蛋白阳性表达率及gpc3mrna表达量与卵巢透明细胞癌的临床分期有相关性,Ⅲ-Ⅳ期患者中的表达(100%;1.8081±0.2657)显着高于i-ii期患者(71.4%;1.0458±0.4036)(p值<0.01)。卵巢透明细胞癌铂类药物耐药患者gpc3蛋白阳性表达率及mrna表达量(100%;1.8081±0.2657)均高于铂类药物敏感型患者(70.3%;0.9918±0.3303)(p值<0.05)。gpc3蛋白阳性表达率与卵巢透明细胞癌患者的预后相关,预后差的患者中阳性率及表达量高,差异有统计学意义(p值<0.05),kaplan-meier单因素生存分析亦显示gpc3蛋白为影响预后的因素(p=0.048)。卵巢透明细胞癌中gpc3蛋白阳性表达率和mrna表达量与患者的淋巴结转移和远处器官转移无相关性(p>0.05)。结论:1.卵巢透明细胞癌有不同于卵巢浆液性癌的临床病理特征及生物学行为,与浆液性癌相比,卵巢透明细胞癌有更早的发病年龄,较高的早期病例比例,较高的耐药性,更低的生存时间和存活率,且其可能来源于子宫内膜异位恶变。2.gpc3蛋白在卵巢透明细胞癌中相对特异性高表达,在多种肿瘤组织中低表达或无表达,提示gpc3在卵巢透明细胞癌发生发展中的特殊意义,值得进一步探讨。3.gpc3在卵巢透明细胞癌中较特异表达且与患者的临床分期、铂类耐药和不良预后相关,在病理鉴别诊断中有着重要的意义,有望成为卵巢透明细胞癌的预后指标和免疫治疗靶标。
郭婷婷[10]2004年在《MXR7在肝癌中甲基化的研究及MXR7抗体协同化疗药物对肝癌细胞杀伤作用的研究》文中提出第一部分 MXR7在肝癌中甲基化的研究 目的—前期研究表明MXR7／GPC3基因在肝癌组织较癌旁组织中表达明显增高，而在正常肝组织中表达沉默。另发现该基因在多种肝癌细胞系中表达，但在其它21种非肝癌肿瘤细胞系中基本不表达。此外，MXR7基因在其它实质性肿瘤中也均未见表达，这提示了该基因是肝癌内高表达的较为特异性的标志基因。但是，到目前为止MXR7基因在肝癌中的重新开放的机制仍不甚清楚。由于该基因的第一外显子内含有1个CpG岛，而且经大量实验表明CpG岛的甲基化与基因表达调控以及肿瘤的发生发展有着密切的关系，本课题对MXR7基因在肝癌中甲基化状态与该基因重新开放的关系进行初步研究，为深入阐明MXR7基因在肝癌中重新开放的机理以及对肝癌发病机制提供实验依据，并且为进一步研究肝癌早期诊断标志物以及对肝癌的早期防治打下理论基础。方法—采用甲基化检测的常用方法。用EcoRI和甲基化敏感限制性内切酶EagI对20对肝癌组织及其相应的癌旁组织、2例血管瘤组织以及2种细胞(MCF-7、HepG2)的基因组DNA进行单双酶切反应，并且针对MXR7基因特定甲基化位点设计一对引物，制备标记α-~(32)p-dCTP的探针。最后，通过Southern blot方法检测不同肝癌组织及其相应癌旁组织中MXR7基因的甲基化状态。结果与讨论—研究发现在20对肝癌与癌旁组织中，有18例肝癌组织中的MXR7基因都呈现非甲基化状态。而与其相应的癌旁组织中，MXR7基因也均为非甲基化状态。其中2对女性患者的肝癌组织中的MXR7基因为部分甲基化状态。此外，MXR7基因在2例肝血管瘤组织以及肝癌细胞系HepG2中也为非甲基化状态。这些结果与Hsingchi Lin等研究的卵巢癌细胞系中MXR7基因甲基化状态不同。在卵巢癌细胞系中，MXR7基因表达沉默，发现它是处于高甲基化状态。Hsingchi Lin等得出结论是MXR7基因的表达沉默与该基因的高甲基化有关，籍此，不能排除在肝癌中MXR7基因呈现的非甲基化状态可能与该基因在肝癌中高表达有关。然而，在正常肝组织中MXR7基因非甲基化状态与肝癌组织类似，这一结果与正常肝组织2001级硕士学位论文中文摘要中MXR7基因高甲基化的推论有差异，提示MXR7基因的非甲基化状态与该基因在肝癌中高表达可能没有直接的关系。 第二部分MXR7特异性多克隆抗体协同化疗药物对肝癌细胞杀伤作用的研究 目的一临床上常使用化疗药物作为肝癌治疗的方法之一，但是使用过高浓度的化疗药物会导致患者诸多不良反应，甚至会对患者的身体造成严重危害。因此，寻求既能增强化疗药物功效同时又能减少其副作用的辅助物己成为人们极其关注的问题。我们将MXR7多克隆抗体协同最常用的二种化疗药物丝裂霉素C(MMC)和5一氟尿嗜睫(5一FU)作用于肝癌细胞(HepGZ和Huh7)，观察它们协同作用后对肝癌细胞的杀伤程度，从而获得在不同天数中最适MXR7多克隆抗体和相应化疗药物的浓度，为临床用药提供实验资料。方法一将培养的肝癌细胞系HepoZ和Huh7按常规方法(5.oxlo4个/ml、Zxlo6个/ml)分别接种于96孔板中。设定不同浓度的MXR7特异性多克隆抗体(0雌/ml;0.01雌/ml; 0.1陀/ml;l拼g/ml;10林g/ml)、MMC(0抖g/ml;10拜g/inl:20林g加1)和5一FU(0林g/ml;10抖g/ml;100雌/ml)，并设实验组孔和对照组孔，每种浓度设六个复孔，加入培养。采用四氮甲哇蓝(MTT)法依据不同的培养天数检测细胞的存活率，分析得出MXR7多克隆抗体和化疗药物的最适浓度以及相应的天数。结果和讨论一MXR7特异性多克隆抗体协同MMC作用HePGZ细胞后，发现第一天、第二天和第四天的协同杀伤HePGZ细胞作用不显着(P>0.05);而第叁天和第五天，0.1林g/ml MXR7多克隆抗体协同10林g/m 1 MMC杀伤HePGZ细胞作用显着(P<0.05)。此外，MXR7多克隆抗体协同5一FU作用Huh7后发现，同样在第一天，MXR7多克隆抗体协同5一FU杀伤细胞作用不显着(P<0.05);而在第叁天，0.1协 g/ml MXR7多克隆抗体协同10林g/m 15一FU后，杀伤细胞生长作用显着(P<0 .05)。MXR7在肝癌中呈高表达并对肝癌细胞增殖有一定的促进作用，研究发现MXR7多克隆抗体在某一浓度协同化疗药物对肝癌细胞的生长有一定的杀伤作用。MXR7通过GPI锚定在细胞膜上，接受的细胞外信号再通过GPI锚转导至细胞内，启动细胞内信号转导机制，提示MXR7多抗协同化疗药物杀伤肝癌细胞的作用可能与MXR7参与信号通路有关。本部分的研究内容只是对MXR7多抗协同化疗药物杀伤肝癌细胞进行的初步实验，提示一定浓度的MXR7多抗协同较低浓度的化疗药物对2001级硕士学位论文中文摘要肝癌细胞可能有杀伤作用。
参考文献：
[1]. gpc3/mxr7基因在肝癌发生、发展中的生物学功能研究[D]. 李慎菁. 第二军医大学. 2002
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[3]. Glypican-3在肝癌的表达和意义及其在肝癌发生中的作用[D]. 余彬彬. 广西医科大学. 2007
[4]. 肝癌相关基因差异表达的初步研究[D]. 阚学峰. 天津医科大学. 2004
[5]. 肝癌发生过程中差异表达基因的研究[D]. 韦薇. 广西医科大学. 2004
[6]. 复制许可因子CDT1在人正常肝脏组织和肝癌组织中的表达与意义[D]. 刘晓雁. 第二军医大学. 2007
[7]. 阵列文库及阵列文库消减杂交用于肝癌相关基因筛选、表达和转录调控的初步研究[D]. 满晓波. 第二军医大学. 2002
[8]. RNA干扰沉默GPC3基因诱导肝癌细胞凋亡及其机制的研究[D]. 刘士源. 兰州大学. 2012
[9]. GPC3在卵巢透明细胞癌中的表达及其临床病理相关性研究[D]. 李雪洁. 南京医科大学. 2015
[10]. MXR7在肝癌中甲基化的研究及MXR7抗体协同化疗药物对肝癌细胞杀伤作用的研究[D]. 郭婷婷. 第二军医大学. 2004
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