钟蕾[1]2002年在《肠型点状气单胞菌和鱼害粘球菌融合子的构建及其特性研究》文中研究说明本试验以肠型点状气单细胞菌58-20-9菌株和鱼害粘球菌G_4菌株作为初发菌株进行原生质体融合，构建融合子，并对其进行形态结构、生理生化、酶类性状及病原性、抗原性等方面的研究，主要结果如下： 1、融合子遗传标记的筛选：应用定性和定量药物敏感性试验，筛选出肠型点状气单细胞58-20-9菌株的遗传标记为E_m~r(红霉素抗性)，鱼害粘球菌G_4菌株的遗传标记为G_m~r(庆大霉素抗性)。在这两种细菌原生质体融合试验中，选择培养基中红霉素的应用浓度为3000Iu／ml，庆大霉素应用浓度为50Iu／ml。 2、融合子的构建：在酶解温度37℃下，选出最适酶解时间为40min，最适溶菌酶浓度为4mg／ml。以PEG为促融剂的条件下，肠型点状气单菌胞58-20-9菌株与鱼害粘球菌G_4菌株的原生质体进行了融合，58-20-9菌株的原生质体形成率为54.7％，原生质体再生率18.2％，G_4菌株的原生质体形成率为50.8％，原生质体再生率为12.2％，初筛的原生质体融合率为4‰，点种500个初筛融合子菌落在双抗培养基上连续传代12次，得到1个稳定的融合子菌落，其稳定率为0.2％。 3、融合子形态结构及理化性状鉴定：筛选的融合子菌株菌体短杆状，比G_4菌株稍短，但较58-20-9菌株略粗，近圆形，平均长轴5.60μm，平均短轴0.67μm，平均体积1.34μm~3，革兰氏阴性，无鞭毛，不运动，培养30天后形成的巨大菌落颜色乳白色，有光泽，中央较厚、隆起、边缘较整齐。对融合子菌株进行酶类性状及生理生化鉴定，其特性有些倾向于58-20-9菌株，有些倾向于G_4菌株。 4、病原性与抗原性研究：用融合子菌株对当年健康草鱼种进行人工感染攻毒，连续观察两周，草鱼种死亡率达95％，空白对照组成活率100％，显示融合子菌株也具有致病性，进一步剖检病死鱼，发现由融合菌株攻毒的草鱼种具有肠炎病和烂鳃病两种疾病的部分症状。用融合菌株制成灭活抗原进行抗原性研究，结果表明，受融合子菌株免疫保护的草鱼种用58-20-9菌株和G_4菌株分别攻毒，其成活率达76.6％和80.0％，免疫保护率达74.9％和75.5％，抗体效价于第四周达到峰值，分别为1：322.5和1：435.5。 总之，在本试验条件下，肠型点状气单胞菌5820习菌株与鱼害粘球菌G。菌】～ 株的原生质体能够融合并形成稳定的融合子，且融合子菌株具有两亲本的病原性 和抗原性。
钟蕾, 肖克宇, 戴良英[2]2010年在《肠型点状气单胞菌和鱼害粘球菌融合子的构建》文中研究表明为探索鱼类病原菌融合疫苗制备的可行性,以肠型点状气单细胞菌58-20-9菌株和鱼害粘球菌G4菌株作为初发菌株进行原生质体融合,构建融合子.在酶解温度37℃下,筛选出最适酶解时间为40min,最适溶菌酶质量浓度为4mg/mL.以PEG为促融剂的条件下,58-20-9菌株与G4菌株的原生质体进行了融合,58-20-9菌株的原生质体形成率为54.7%,原生质体再生率为18.2%,G4菌株的原生质体形成率为50.8%,原生质体再生率为12.2%,初筛的原生质体融合率为4‰.点种500个初筛融合子菌落在双抗培养基上连续传代12次,得到1个稳定的融合子菌落,其稳定率为0.2%.
陈光荣[3]2004年在《草鱼病原菌叁元融合子构建及生物学特性研究》文中研究指明采用细胞融合技术首次构建草鱼烂鳃病、赤皮病和肠炎病的病原菌融合子。应用多种经典检测方法对融合子的形态、构造、生理生化特性、致病性、抗原性和DNA同源性展开深入研究，以揭示融合子生物学特性的遗传规律。建立多元细胞融合技术，为研制鱼类细胞融合疫苗，创造有多种价值的益生菌等优良菌种资源提供科学依据。 应用定性和定量药物敏感性试验与诱变相结合，筛选出荧光假单细胞56-12-10菌株的遗传标记为链霉素抗性，二元融合子AM-1菌株的遗传标记为环丙沙星抗性。在这两种细菌原生质体融合试验中，选择培养基中链霉素的应用浓度为300Iu/ml，环丙沙星应用浓度为100Iu/ml。 在酶解温度37℃下，选出最适酶解时间为60min，最适溶菌酶浓度为5mg/ml。以PEG为促融剂的条件下，荧光假单细胞56-12-10菌株与二元融合子AM-1菌株的原生质体进行了融合，56-12-10菌株的原生质体形成率为81.6％，原生质体再生率19.8％，AM-1菌株的原生质体形成率为79.2％，原生质体再生率为8.2％，初筛的原生质体融合率为6‰，点种100个初筛融合子菌落在双抗培养基上连续传代10次，得到1个稳定的融合子菌落，其稳定率为1％；同时制得叁者的原生质体并悬浮，先取其中58-20-9菌株、G_4菌株的原生质体进行融合，再将56-12-10菌株的原生质体与此二元融合原生质体液混匀并进行第二次融合，经单抗选择培养基上的筛选率约为3.5‰，而经过连续传代10次后，共得到两个菌株，其中一个菌株为特殊变异株，另一为稳定叁元融合子。两种方法均可获得相同的稳定叁元融合子，后者更为快捷。 筛选的融合子菌株菌体短杆状，近于AM-1亲本株，平均长轴4.52μm，平均短轴0.75μm，平均体积1.33μm~3，革兰氏阴性，有鞭毛，运动，巨大菌落圆形，表面光滑、湿润，半透明，边缘整齐。对融合子菌株进行酶类性状及生理生化鉴定，其介于叁原始亲本菌株之间。 用融合子菌株对当年健康草鱼种进行人工感染攻毒，说明融合子菌株也具有致病性，进一步剖检病死鱼，发现由融合菌株攻毒的草鱼种具有肠炎病、烂鳃病及赤皮病叁种疾病的部分症状。对融合菌株进行抗原性研究，结果表明，受融合子菌株免疫保护的草鱼种注射56-12-10菌株、AM-1菌株及叁原始亲本，其免疫保护率分别达64.9％、68.0％、62.5％，抗体效价最高达1：256和1：512。对融合子及其亲本的DNA含量进行测定及琼脂糖凝胶电泳分析，融合子的DNA含量明显高于任一亲本。至于基因具体整合及表达情况，有待于进一步试验。
钟蕾, 肖克宇[4]2007年在《肠型点状气单胞菌和鱼害粘球菌的融合子特性研究》文中研究表明为了探索病原菌融合疫苗制备的可行性及其理论基础,查明鱼类病原菌融合子的遗传规律,本研究对草鱼肠炎病和烂鳃病病原的融合子特性进行了研究,结果表明:筛选的融合子菌株菌体大小、酶类性状及生理生化指标介于两亲本菌株之间;融合子菌株具有致病性,用融合菌株制成灭活抗原进行抗原性研究,免疫保护率达74．9％和75．5％,抗体效价于第4周达到峰值,分别为1:322．5和1:435．5。
何福林, 肖克宇, 陈光荣, 钟蕾, 何燕林[5]2007年在《草鱼叁元病原菌融合子的构建及生物学特性》文中提出采用细胞融合技术首次将肠型点状产气单胞菌菌株和鱼害粘球菌菌株融合,构建二元融合菌株AM-1,再将AM-1与荧光假单胞菌菌株融合,构建叁元融合菌株AM-2。对AM-1和AM-2菌株的形态结构、生理生化特性、致病性、抗原性、抗体效价进行分析。结果表明,AM-1活菌椭圆形,无鞭毛,死菌短杆状,AM-2菌株短杆状,有鞭毛,它们的生理生化性状介于3原始亲本菌株之间;用AM-2菌株对当年健康草鱼种进行人工感染攻毒,被攻毒草鱼种具有烂鳃病、赤皮病及肠炎病的部分症状;AM-2菌株抗原的受免草鱼种对荧光假单胞菌、鱼害粘球菌和肠型点状产气单胞菌菌株的免疫保护率分别达64.90%、68.00%、67.00%,抗体效价最高达1∶256、1∶256、1∶512。测定了AM-1和AM-2菌株及亲本DNA含量并进行了琼脂糖凝胶电泳分析,AM-1和AM-2菌株DNA含量明显高于任一原始亲本。
参考文献：
[1]. 肠型点状气单胞菌和鱼害粘球菌融合子的构建及其特性研究[D]. 钟蕾. 湖南农业大学. 2002
[2]. 肠型点状气单胞菌和鱼害粘球菌融合子的构建[J]. 钟蕾, 肖克宇, 戴良英. 湖南农业大学学报(自然科学版). 2010
[3]. 草鱼病原菌叁元融合子构建及生物学特性研究[D]. 陈光荣. 湖南农业大学. 2004
[4]. 肠型点状气单胞菌和鱼害粘球菌的融合子特性研究[J]. 钟蕾, 肖克宇. 内陆水产. 2007
[5]. 草鱼叁元病原菌融合子的构建及生物学特性[J]. 何福林, 肖克宇, 陈光荣, 钟蕾, 何燕林. 水产学报. 2007
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