肺癌的发病率和致死率在所有恶性肿瘤中居于首位,并且逐年上升,严重危害着人民健康。肺癌起病隐匿,病情发展迅速,影响肺癌预后的最主要因素是分期,约75%~85%的肺癌患者在诊断时就已属晚期,失去彻底切除机会[1-3]。外泌体(exosome,Exo)是由多种细胞如树突状细胞、肿瘤细胞等经内吞逆出芽形成许多小囊泡,直径约30~100nm。它可以在不直接接触的情况下完成细胞间生物信号传导[4]。本研究成功从肺癌细胞中提出外泌体,并揭示了肺癌细胞来源的外泌体能调节肺癌细胞对顺铂化疗敏感性,这为肺癌的治疗提供了一种新的思路和靶点1 资料与方法1.1 细胞培养 肺癌细胞A549 购于上海细胞库。将其接种到培养液中37 ℃、5 % CO2的恒温箱内150rpm培养,培养48h传代一次。培养液成分:RPMI 1640培养液中添加10U/L庆大霉素和10% 灭活胎牛血清。1.2提取exosomes、电镜制样和检测蛋白表达 收集培养48h后的培养液上清液,将上清液用离心机多次离心去除胞体和碎片杂质,取浓缩液,在4℃下继续离心得到的下层沉淀即是exosomes。将得到的exosomes沉淀溶解稀释,取20ul滴到铜网,室温下晾干,即可置于透射扫描电镜下进行观察并拍摄照片。1.3CCK-8法检测细胞的存活率 将A549肺癌细胞(对数生长期)接种到96 孔板中( 细胞数约6×103个/孔),24h后加入不同浓度梯度的顺铂(浓度为0-10μg/ml),培养48h。每孔加入100ul1:9的CCK-8和培养液,30min后,用紫外可见光分光仪在450nm波长下测吸光度。1.4统计学方法 所有数据均采用SPSS22.0软件进行统计分析,计量资料应用平均值±标准差(),计量资料组间比较采用对照组独立样本t检验,计数资料以百分率(%)表示,采用x2检验,P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1肺癌细胞A549来源exosomes形态和蛋白表达图1肺癌细胞A549来源exosomes形态(A)和蛋白表达(B)从透射显微电镜图中可以达到Exosome的形态为圆盘状(图1A),直径约为30-100nm,大小尺寸为纳米级。从图1B中可以发现具有特异性表达CD63和CD81蛋白,这证明我们提取的是细胞分泌到细胞外的exosomes,而不是其他物质,提取成功。2.2exosome对顺铂敏感性调解过程中的影响图2 不同梯度浓度顺铂处理48h后的细胞存活率不同浓度梯度的顺铂对肺癌细胞有一定的抑制作用,浓度越大,细胞存活率就越低,在3ug/ml的顺铂浓度时,细胞存活率为50%(图2)。分别用顺铂处理过的exosome和顺铂处理的exosome预处理细胞,并与对照PBS组作比较(图3)。未顺铂处理的exosome干预细胞组较PBS处理的细胞组细胞存活率高4%,而顺铂处理的exosome干预细胞组较未顺铂处理的exosome干预细胞组细胞存活率高24%。注:1:PBS处理的细胞组;2:未顺铂处理的exosome干预细胞组;3:顺铂处理的exosome干预细胞组。图3.在3ug/ml顺铂浓度下A549细胞存活率3 讨论自1987年,Johnstone等首次观察到外泌体,成功分离纯化并命名为exosomes之后,外泌体的研究引起了广泛的关注。2001年,有研究发现,肿瘤来源的外泌体(tumor-derived exosome,TEX)表面富含肿瘤抗原,可使细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)主动杀伤肿瘤细胞[5]。由此,Exo在肿瘤领域的研究逐渐推上了热潮。Exo也被看作是一种热休克蛋白的载体,热休克蛋白(Hsp)可在各种应激状态下被诱导,作为一种“危险信号”诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫应答,又称为应激蛋白[6]。此研究显示,抑制肺癌细胞Exo的生成或释放将为肺癌的治疗提供新的方法。本研究通过透射电子显微镜观察到了肺癌细胞A549分泌的exosome的形态为圆盘状,蛋白质印迹法也顺利检测到CD63和CD81两种特异性蛋白质。CCK-8法检测到的细胞成活率明显经顺铂处理组要比未经顺铂处理组要高。这说明exosome会影响同源细胞对顺铂敏感性有所降低,不利于癌症患者顺铂化疗的治疗。综上所述,肺癌细胞分泌的exosome可以在细胞间传递信息,导致同源细胞对顺铂敏感性的降低。换句话说,减少exosome的分泌和细胞间的传递可以增加顺铂化疗的敏感性和疗效,可以在治疗肺癌药物研究中加以应用,是一种新的治疗思路。参考文献[1]M.J.Tsai,etal.Cysteinyl leukotriene receptor antagonists decrease cancer risk in asthma patients.Sci. Rep.6(2016),23979.[2]KOSAKA N. Decoding the secret of cancer by means of extracellular vesicles[J]. J Clin Med,2016,5(2):22.[3]Ana Lukic , Casper J.E. Wahlund , Cristina Gómeza, Daniel Brodin , Bengt Samuelsson , Craig E. Wheelock , Susanne Gabrielssonb, Olof Rådmark.Exosomes and cells from lung cancer pleural exudates transform LTC4 to LTD4, promoting cell migration and survival via CysLT1.Cancer Letters. 2019,444,1-8.[4]LiZhou, Tang feng, LvQun Zhang, Qingqing Zhu, Ping Zhan, Suhua Zhu, Jianya Zhang, Yong Song.The biology, function and clinical implications of exosomes in lung cancerCancerLetters,2017,407,84-92.[5]解世林,曲晶磊,范一博,等.Akt和SRC在Exosomes促进同源肺癌细胞迁移中的作用[J].中国医科大学学报,2017,46(04):294-297.[6]Y. Liu, etal.Tumor exosomal RNAs promote lung pre-metastatic niche formation by activating alveolar epithelial TLR3 to recruit neutrophils, Cancer Cell. 2016,30 (2):243–256.十堰市科技局项目项目名称:Exosomes对肺癌发生发展的影响和机制的研究(项目编号:18Y40)
论文作者:杨毅,张志军(通讯作者)
论文发表刊物:《中国保健营养》2019年第2期
论文发表时间:2019/6/27
标签:细胞论文; 肺癌论文; 敏感性论文; 培养液论文; 蛋白论文; 浓度论文; 存活率论文; 《中国保健营养》2019年第2期论文;