（浙江省桐庐县中医院 浙江 桐庐 311500）
【摘要】 对组织培养中的脱病毒及其病毒检测技术进行了综述，脱病毒技术包括热处理、茎尖培养、茎尖微芽嫁接、热处理配合茎尖培养、热处理配合茎尖微芽嫁接等，病毒检测技术包括指示植物法、抗血清鉴定法、生化法和电子显微镜直接观察法等。
【关键词】 组织培养；脱病毒；病毒检测
【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）28-0354-02
病毒病害严重影响植物的生长发育，特别是危害通过嫁接、扦插、根繁等常规无性繁殖的植物，如桃、李、杏、杨、柳、香蕉、草莓、大蒜、康乃馨等。由于病毒是通过维管束传导的，因此利用有维管束的营养体繁殖，就会把病毒传递下去，并且逐代积累，病毒浓度越来越高，危害越来越严重[1]。常用的鉴定方法有指示植物法、抗血清鉴定法、生化法和电子显微镜直接观察法等。脱毒苗的鉴定要在相关部门和权威机构的参与、指导和监督下进行。无病毒苗需要很好的隔离保存。通常无病毒原种材料是种植在隔离网室中，隔离网以300目网纱为好，网眼规格0.4～0.5毫米，主要是防止蚜虫进入传播病毒。栽培土壤要严格消毒，并保证材料在与病毒严格隔离的条件下栽培[2]。海岛或高岭山地，气候凉爽、虫害少，有利于无病毒材料的保持。脱毒苗在生产中应用，关键是要防止病毒的再感染。新种植区、新种植地块，较长时间后才会再度感染；曾种植过感病植株的重作区在短期内就可感染。一旦感染，影响生产质量时，应重新采用无病毒苗。
1.脱毒技术
1.1 热处理
热处理脱毒主要是利用病毒受热的不稳定性而失去其活性达到脱病毒目的。通常是将热处理中伸长生长出的新梢顶端部分嫩枝嫁接到无病毒砧木上，或进行进一步的茎尖培养，或茎尖微芽嫁接以增大脱去病毒的机率。
在热处理茎尖的过程中，通常温度越高、时间越长、脱毒效果就越好。但是同时植物的生存率却呈下降趋势，所以温度选择应当考虑脱毒效果和植物耐性2个方面。洪霓等在梨病毒的脱毒研究中采用2种处理：一为恒温处理，温度控制在37±1℃；二为变温处理，温度为32℃和38℃每隔8h变换1次，发现变温处理比恒温处理植株死亡率低，脱毒效率高[3]。
热处理的缺陷是不能脱除所有病毒。例如在侵染马铃薯的病毒之中，对于PLRV、PVA和PVY不进行高温预处理，脱毒率也相当高，而高温预处理却可以显著提高对PAMV、PVX和PVS的去除。一般而言，对于球状病毒和类似纹状的病毒以及类菌质体所导致的病害才有效，对杆状和线状病毒的作用不大。
1.2 茎尖培养和茎尖微芽嫁接
茎尖培养之所以能够除去病毒，是由于病毒主要是通过维管束传导的，所以病毒在感病植株内的分布不一致。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆维管束越发达的部位，病毒分布越多；而生长点内无组织分化，即尚未分化出维管束，所以通常不存在病毒，把茎尖生长点接种在适宜的培养茎上进行组织培养，就可能培养出无病毒植株。由于茎尖培养脱毒效果好，后代遗传性稳定，而且还可同时脱除类病毒、细菌和真菌，所以是植物无病毒培育应用最广泛的一个途径[4]。试管微芽嫁接法脱病毒可以说是茎尖培养脱毒的一种改良方法，主要用于茎尖培养较困难的植物。
茎尖培养可能出现揭化、玻璃化等现象，这会严重影响植物的成活率，所以必须解决这些问题。褐化是由于外植体在培养过程中分泌的酚、醌类物质妨碍自身的生长[5]。而活性炭可以吸附外植体在培养过程中的有害物质，从而达到防止褐化的目的。在香蕉茎尖培养的培养基中加入活性炭或与维生素C配合使用均能改善外植体褐变情况。
2.检测技术
2.1 指示植物法
当原始寄主的症状不明显时，就可用指示植物法，因为指示植物比原始寄主更容易表现症状。具体做法是将病叶研磨，把汁液接种到寄主植物上。指示植物法简便易行，但它灵敏性差，所需时间长，难以区分病毒种类[6]。
2.2 抗血清鉴定法
抗血清鉴定法要进行抗原的制备，抗血清的采收、分离等。血清可分装到小玻璃瓶中，贮存在-15～-25℃的冰冻条件下，此法灵敏度高，获得检测结果迅速，是目前检测病毒的一种最好方法[7]。此外，PCR微量板杂交法、蛋白质电泳法、嫁接检测法、电子显微镜检定法、病毒症状学诊断法等也可以用来检测植物病毒。
2.3 电子显微镜直接观察法
采用电子显微镜既可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又可鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，但需一定的设备和技术[8]。由于电子的穿透力很低，制品必须薄到10～100um，通常制成厚20um左右的薄片，置于铜载网上，才能在电子显微镜下观察到。近代发展使电镜结合血清检测病毒，称为免疫吸附电镜(ISEM) [9]。
2.4 生化法
生化法包括酶联免疫法和RT-PCR检测法，酶联免疫法方法是将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的抗体，使待检血清与对应抗原的特异性抗体结合，最后用分光光度计进行诊断[10]。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测病毒DNA的转录产物，分析表达的水平。该方法已用于大蒜脱毒苗检测。
3.小结
综上所述，现有的脱毒技术多种多样，各有优缺点。常用的脱毒技术是热处理法、茎尖培养法、抗病毒药剂法，目前应用的趋势是将不同的方法结合起来应用。随着脱毒苗的大量生产，脱毒苗的检测技术也越来越重要，现在广泛应用的检测技术有两种，即ELISA方法和RT-PCR方法。但是ELISA方法需要制备抗体，而且一次只能检测一种病毒，所以相比较来说，最有前途的应当是RT-PCR技术，与其他方法相比，它特异性强、灵敏度高，而且不需要制备抗血清以及放射性探针，操作简单，适于广泛应用。
【参考文献】
[1] 汤亚飞.甘蔗脱毒组织培养及甘蔗花叶病毒的分子检测[D].华南农业大学，2006.
[2] 庞淑敏，方贯娜，周建华等.豫马铃薯茎尖组织培养脱毒体系的建立[J].长江蔬菜，2008，(20):25-26.
[3] 丁文雅.植物组织培养脱毒技术与检测方法[J].农业科技通讯，2009，(3):75-77.
[4] 纪彦.樱桃脱病毒及病毒检测技术研究[D].辽宁师范大学，2005.
[5] 洪艳华，殷广峰，张立军等.百合脱毒及病毒检测技术研究进展[J].沈阳农业大学学报，2003，34(3):225-227.
[6] 高昌勇，尚宏芹.大蒜脱毒及病毒检测技术研究进展[J].蔬菜，2011，(10):24-25.
[7] 黄振瑞.甘蔗黄叶病毒分子检测及ScYLV-CP基因克隆[D].福建农林大学，2006.
[8] 张振臣，乔奇，靳秀兰等.地黄脱毒技术及增产效果[J].植物保护学报，2011，31(4):342-346.
[9] 高山林，卞云云，陈柏君等.生姜组织培养脱病毒、快繁和高产栽培[J].中国蔬菜，2009，(3):40.
[10] 高山林，金雍安，蔡朝晖等.大蒜分生组织培养脱病毒和快速繁殖技术[J].植物资源与环境学报，2012，9(3):15-18.
通讯作者：毛泽玲（1988-），女，硕士毕业，浙江省杭州市桐庐县人，现就职于浙江省杭州市桐庐县中医院，从事中药相关研究4年，研究方向为中药相关成分的药理药效研究，
论文作者:余伟庆,毛泽玲（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第28期供稿
论文发表时间:2015/12/1
标签：病毒论文; 指示植物论文; 血清论文; 植物论文; 电子显微镜论文; 维管束论文; 方法论文; 《医药前沿》2015年第28期供稿论文;