孙达权[1]2008年在《山羊乳腺特异性载体的构建及细胞转染》文中指出基因打靶通过DNA转移手段将外源DNA导入靶细胞或组织中,利用外源DNA序列与靶细胞内基因组中部分DNA序列间的同源性使它们在分裂前期发生DNA间的同源重组,从而对靶细胞基因组上的某一确定位点或座位进行精确的遗传修饰的一门新技术。乳腺生物反应器是基于胚胎操作和转基因技术平台,外源基因导入动物基因组中并利用内源基因的启动元件使外源基因在动物乳腺中表达,并利用动物乳腺的分泌能力从乳汁中获得具有重要使用价值的药用蛋白等外源蛋白的一类转基因动物的总称。随机整合将外源基因随机导入靶细胞基因组中,由于“位置效应”而导致外源基因表达低下甚至沉默。为提高外源蛋白在转基因动物中的表达量,本研究以基因打靶等技术构建山羊乳腺特异性载体,并通过稳定转染和细胞筛选来获得中靶转基因山羊胎儿成纤维细胞,以中靶体细胞为核供体细胞生产乳腺生物反应器动物,解决了外源基因由于随机整合而产生“位置效应”这一难题,并利用乳蛋白基因的启动元件在乳腺中高效表达外源基因。本试验以山羊β-酪蛋白基因座为打靶位点,从西农萨能奶山羊血液中提取DNA基因组,利用LA-PCR分两段扩增了山羊的β-酪蛋白基因,经TA克隆和鉴定后再用LA-PCR的方法从中克隆了该基因的5’端包括调控序列和信号肽在内的3 kb的DNA序列和3’端2 kb的DNA序列作为两条同源臂。同时以在两个LoxP之间插有新霉素磷酸转移酶基因(neo)并在两个LoxP外侧各有一个疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)的通用性打靶载体pA2T为骨架载体,构建了乳腺特异性条件性基因打靶载体。采用具有广谱抗菌、抗病毒、改善免疫、组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等作用的人溶菌酶基因和具有溶解血块、保持血管的畅通等作用且半衰期相对较长的指形区缺乏的人组织纤溶酶原激活剂基因为打靶载体的外源目的基因,两者均通过PCR从带有该基因的载体中克隆出来的,并通过酶切和连接的方法构建打靶载体。另外,试验以带有核定位信号的AcGFP基因为标记基因,外源目的基因通过具有独立起始翻译随后基因作用的IRES序列与AcGFP基因相联系。以质粒pEGFP-C1为骨架载体,先通过改造GFP基因ATG附近的序列使GFP高效表达,再将具有增强剪接作用的间插序列(IVS)与IRES序列与GFP基因相连,再在IVS前加入另一个带有多克隆位点的IVS,构建了载体p3I-GFP,通过细胞转染确实发现载体p3I-GFP及去除了MluI位点的p3I-GFPN能够高效表达标记基因,且荧光亮度要明显高于购买的pIRES2-AcGFP-Nuc载体。再以p3I-GFPN为骨架载体,将人溶菌酶基因导入多克隆位点,通过细胞转染发现的确能够表达绿色荧光蛋白。在此基础上,在CMV启动子和人溶菌酶基因之间插入山羊CSN2的启动子,再将GFP基因用从人胎盘中以PCR的方法扩增获得的干扰素A基因替代,最终构建了一个乳腺中独立表达人溶菌酶和人干扰素蛋白的载体,用于乳腺炎防治的研究。为获得中靶山羊胎儿成纤维细胞株,本试验以山羊胎儿成纤维细胞为打靶体细胞,脂质体2000转染细胞后用含800μg/ml的遗传霉素初步筛选培养,7天后用含400μg/ml的遗传霉素和200 nmol/ml的丙氧鸟苷的细胞筛选液筛选培养,初步筛选中靶细胞。为获得纯化的中靶细胞株,首先建立一个单细胞培养体系,即以5 mg/ml丝裂霉素C处理2h的山羊胎儿成纤维细胞为饲养层和新鲜的细胞培养液,以这个单细胞培养体系培养初步筛选的中靶单个细胞,最后得到扩增的细胞株,再用含400μg/ml的遗传霉素和100 nmol/ml的丙氧鸟苷的细胞培养液培养,获得纯化的中靶山羊胎儿成纤维细胞株。
郑月茂[2]2005年在《转基因山羊乳腺上皮细胞系建立与转基因克隆胚发育》文中提出本研究通过PCR 法克隆了2 248 bp 的山羊β-乳球蛋白基因5′端调控序列,以之作为启动子指导人乳铁蛋白基因在山羊乳腺上皮细胞中特异性表达,以验证表达载体构建的合理性和外源基因的表达效率。利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因cDNA 的重组质粒pBLIG,并导入到山羊乳腺上皮细胞,经G418 及PCR 筛选获得阳性细胞,以之作为供体细胞利用核移植技术构建转基因克隆胚。应用PCR 法检测转基因克隆胚中的外源基因,并与荧光观察进行对照,从而实现在转基因克隆胚早期发育过程中对外源基因的检测,为进一步对荧光阳性胚胎进行移植,以期得到转基因动物个体奠定基础。研究结果如下:1. 山羊乳腺上皮细胞传至第15 代时其生长仍正常。山羊乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状,称之为乳球体;大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,呈蜂窝状;部分细胞呈圆饼状,体积较大;出现部分长形细胞。第15 代细胞表面微绒毛极为发达,细胞质中线粒体和粗面内质网丰富并含有大量脂滴,表明细胞增殖活力旺盛。染色体分析表明,山羊乳腺上皮细胞系稳定,在离体培养条件下细胞未发生转化。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对山羊乳腺上皮细胞培养上清液中的蛋白质进行分离,发现山羊乳腺上皮细胞上清液有3 个条带与标准酪蛋白的3 个条带一致,表明本研究培养的上皮细胞为山羊乳腺上皮细胞,在体外培养条件下能表达山羊酪蛋白。2. 利用PCR 法克隆了山羊β-乳球蛋白基因5′调控序列(2 248 bp),其中包括第一外显子及第一内含子。PCR 产物回收纯化后,克隆在pMD 18-T Vector 的T 位点。质粒标记为pBLG。序列分析表明,该序列与发表的山羊序列同源性达99.70 %。计算机分析表明,此调控序列含有多个调节因子结合位点或反应元件,包括STAT5(MGF)信号转导子和转录激活子5(乳腺因子)结合位点、CCAAT/增强子结合蛋白结合位点、SP1 因子结合位点、Milk box“乳盒”、TBF 因子结合位点、视黄酸反应元件(RARE)、乳腺特异性因子(MSBF)和核因子1(NF1)结合位点等,这提示此调控序列可调控外源基因在乳腺上皮细胞中高效表达,可用于构建乳腺特异性表达载体。3. 将质粒pBLG 和表达载体pEGFP-c1 用AseI 和NheI 双酶切,回收目的片断,T4DNA
李国才[3]2004年在《人溶菌酶动物乳腺生物反应器的研制》文中研究表明人溶菌酶(human lysozyme，hLYZ)能水解细菌细胞壁粘多糖的β-1，4糖苷键，所以对革兰阳性细菌具有直接的溶解作用，在分泌型免疫球蛋白A和补体的参与下对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，因此在医学、食品工业等领域得到十分广泛的应用。 目前使用的溶菌酶主要从鸡蛋清中提取，天然的hLYZ不仅来源有限，而且提取方法复杂、价格昂贵。目前虽有细菌和酵母表达hLYZ的报道，但普遍存在转译后加工修饰不完全、溶解宿主细胞壁和表达水平低等问题，难以进行工厂化生产。转基因动物乳腺生物反应器具有表达水平高、表达产物活性强、易于纯化和无污染等优点，是大规模生产重组蛋白的新途径。 为了研制表达hLYZ的动物乳腺生物反应器，本研究根据已发表的hLYZ序列设计引物，以人乳腺第一链cDNA为模板，用PCR方法扩增出长1.5 kb hLYZ双链cDNA。测序结果显示，其序列与已发表的从人胎盘、巨噬细胞和结肠中克隆的人hLYZ完全一致，其中包括1个447 bp的阅读框和3′端反向重复的Alu序列。将此cDNA序列推导成氨基酸序列，并与GenBank中已发表的hLYZ氨基酸序列进行比较，结果与从人胎盘、巨噬细胞和结肠中克隆的hLYZ完全相同，与从人组织细胞中克隆的hLYZ仅有1个氨基酸差异(41位的异亮氨酸→蛋氨酸替换)，但与从中国人胎盘中克隆的hLYZ具有5个氨基酸差异，分别是第10、111和128位的颉氨酸→丙氨酸替换，124位的异亮氨酸→颉氨酸替换和136位的天门冬氨酰胺→天门冬氨酸替换。因为上述5个氨基酸替换具有一定的规律性(3个为颉氨酸→丙氨酸替换)，所以这种序列差异可能是不同人种之间的遗传差异，而不是克隆过程中产生的随机错误。 将上述hLYZ cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3，用获得的重组质粒转染COS-1细胞，经间接免疫荧光试验证明目的基因能进行正确表达。再将此cDNA扬州大学博士学位论文 克隆入自行构建的乳腺表达载体P205C3、国外引进的乳腺表达载体pBJ41和PBCI，获得的重组质粒分别命名为P205C3LYZ、PBJLYZ和PBCLYZ，经多聚乙 酞亚胺包裹后通过尾静脉注射哺乳期小鼠，经微球菌溶解试验证明叁种重组载体 不仅能在乳腺细胞中表达，而且分泌在乳汁中的重组酶分别达到87、69、60m叭。将基因注射小鼠扑杀，取其12种组织提取总RNA，经Dot blotting检侧证明，叁 种基因构件除在乳腺中表达外，在脾、肠或肾中也有一定的异位表达。这些试验 结果提示，自行构建的乳腺表达载体可以替代国外引进载体进行动物乳腺生物反应器研究。 用显微注射法将重组表达载体p205C3LYz注射入小鼠受精卵，获得136只F0代小鼠，用PCR和s。川出em bfotting分别检测到目的基因整合阳性鼠7只(2早5 占)和4只(1早3占);在soulthern blo伪泣g检测阳性的4只F。鼠中，1只母鼠为hLYZ表达阴性，2只雄鼠与正常母鼠交配出生的F，代母鼠为hLYZ表达阴性，1只雄鼠的4只F，代母鼠乳汁中表达的让止yZ分别为5 mg/L、75 mg几、175m叭和200m留1;从F:代开始，对表达阳性鼠进行兄妹交配，经PCR检测证明转基因的遗传符合孟德尔遗传规律;目前转基因纯合鼠已传到F7代，每代母鼠乳汁中的rhl万z表达量基本稳定，最高表达量达750m叭;将其中的3只母鼠扑杀，取其组织制备细胞裂解液和总RNA，经微球菌溶解试验和Dot blotting检测证明，目的基因除在乳腺表达外，在脾脏和小肠也有一定的异位表达。 取转基因阳性鼠的乳汁进行Westem blotting分析，结果显示乳中表达的八止yZ与人初乳中天然的LYZ具有相同的分子里;将适当稀释的转基因小鼠乳汁和人初乳在60，C、72℃、85，C、100，C水浴中孵育l、3、5、10、15、20、30 min，经微球菌溶解试验证明，比山YZ与天然址万Z具有相似的热稳定性;将乳样的pH调节为2、4、5、7.4、9、10，37℃作用30 min后进行酶活性测定，结果表明r址万Z与天然址万Z的pH活性范围相近;将不同的金属离子加入乳样中，然后进行酶活性测定，结果证明比LYZ和正常址笼Z对所试金属离子具有相似的敏感性;通过琼脂平板扩散法检测不同种类的细菌对迁止YZ和hLYZ的敏感性，检出的敏感菌在37℃培养过程中每隔3On五n取定量混合液进行琼脂平板菌落计数和绘制抑菌曲线，结果表明表达的rhl笼Z与正常址万Z具有相似的抑菌活性。 用重组载体P205C3LYZ注射山羊受精卵，第一批试验使用的供、受体羊分别李国才:人溶菌防动物乳膝生物反应器的研制为17和22只，由于胚胎移植后遇到羊痘病毒感染，导致部分羊死亡，怀孕率很低(4瓜2)，经PCR检测证明出生的3只羔羊为外源基因整合阴性;第二批试验分别使用供、受体羊巧和23只，胚胎移植后35一40天的怀孕率为14/23，尽管流产和产死胎羊相对较多，但仍获得12只存活羔羊;经Dotbl。币ng法初步检测证明，其中7只为外源基因整合阳性。
李国才, 孙强, 孙怀昌, 陈刚, 张泉[4]2003年在《乳腺高效表达人溶菌酶转基因小鼠的制备》文中研究表明目的研究本室构建的动物乳腺特异表达载体p205C3的表达特性。方法将人溶菌酶(hLYZ)cDNA克隆入p205C3,用获得的重组载体p205C3LYZ显微注射法建立转基因小鼠。F_0代小鼠出生后,用PCR初步检测目的基因的整合情况并用Southern杂交确认。F_0代阳性鼠与正常小鼠交配,所得F_1代小鼠以PCR检测目的基因的整合情况。F_0代及F_1代转基因母鼠分娩后第10d取乳汁以微球菌溶解法检测乳中hLYZ活性。扑杀一只表达hLYZ的转基因F_1代小鼠取重要脏器提取总RNA,以RT-PCR法检测表达的组织特异性。结果出生136只F_0代小鼠,PCR和Southern杂交检测阳性率分别为5.15%(2?5?)和2.94%(1?3?)。仅在1只F_0代雄鼠的4只F_1代阳性母鼠乳汁中检测到表达量分别为75、175、200和5μg/ml的溶菌酶。hLYZ仅在乳腺中表达。结论p205C3不仅能驱动hLYZcDNA在小鼠乳腺中高效表达,而且表达具有较强的组织特异性,可以用于动物乳腺生物反应器的研制。
张颖琦[5]2009年在《动物乳腺生物反应器的应用及研究进展》文中指出动物乳腺生物反应器是利用转基因技术获得药物蛋白的动物个体表达系统,其利用乳腺特异性调控元件指导外源基因在乳腺中特异地表达,以转基因动物的乳腺组织生产药用重组蛋白。本文就动物乳腺生物反应器的操作流程、应用、优点、存在的问题及其国内外研究进展和产业化现状作一综述。
王莉[6]2008年在《人胰岛素基因改造及其山羊乳腺特异性表达载体构建》文中研究指明为了构建一个高效的经改造后的人胰岛素基因乳腺特异性表达载体,从而为利用动物乳腺生产人成熟胰岛素打下基础,我们利用Long PCR技术克隆了长为5151 bp的山羊β酪蛋白基因5′调控区,并且在克隆出改造后的人胰岛素基因的基础上,以奶牛β酪蛋白基因调控区为指导元件,以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,构建了人胰岛素基因的乳腺特异性表达载体pEBH,为利用动物乳腺生物反应器生产人成熟胰岛素的研究打下了坚实的基础。研究结果如下:1.利用Long PCR技术成功从人基因组中扩增出长度为1696 bp人胰岛素基因,又以人胰岛素为模板分叁段扩增出长度为262 bp的A肽、218 bp的B肽、928 bp的C肽,连接C肽和A肽。其中包含有完整的编码序列。序列分析表明,片段和GenBank中公布的人胰岛素基因DNA序列的同源性为99%,尽管有叁处发生了碱基突变,但不在主要功能区并没有改变蛋白的功能。2.根据表达载体pEGFP-C1上的多克隆位点以及质粒pBL中的CSN2启动子序列设计引物,在引物两端添加酶切位点,采用定向克隆的方法,成功的将HBCA基因与CSN2调控序列融合在一起。3.采用定向克隆的方法,利用真核表达载体pEGFP-C1构建了含有报告基因的人胰岛素乳腺特异性表达载体pEBH。载体含有抗性基因和绿色荧光蛋白(EGFP)基因,且报告基因和目的基因表达为非融合型表达。4.用脂质体法将表达载体pEBH转染体外培养的山羊乳腺上皮细胞,经G418初步筛选,通过荧光显微镜观察到报告基因的表达。通过PCR检测,表明HBCA基因序列已存在山羊乳腺上皮细胞染色体中。5.采用Long PCR法,克隆了山羊CSN2基因长为5151bp的5′调控区。经NCBI blastn软件进行同源性序列分析,结果表明:所克隆的片段与山羊CSN2基因对应区段的同源性均为99%,证明为山羊β酪蛋白基因的5′调控区。利用本试验克隆的5′调控区和本实验室已有的长为6.6 kb的3′调控序列,可以构建高效的乳腺特异性表达载体。
刘燊, 鲁丹, 林树茂, 张辉华, 杨雪珍[7]2017年在《重组人溶菌酶动物生物反应器研究进展》文中指出动物生物反应器是利用转基因动物活体,在其器官或组织中高效表达某种外源蛋白,并进行工业化生产功能蛋白质的技术,纯化的重组蛋白具有生物活性强、产量高、成本低,分离纯化工艺简单等特点。2006-02-06,利用山羊乳腺生产的重组人抗凝血酶Ⅲ(recombinant human antithrombinⅢ,ATryn)在欧洲获得上市批准,标志着动物生物反应器真正的迈入了产业化阶段。人溶菌酶具有杀菌消炎、免疫调节、改善肠道菌群等作用,也是人体的非特异性免疫物质和母乳重要成分,食/药用安全可靠无免疫原性,可广泛应用于食品保鲜、婴幼儿奶粉、抗菌消炎药和抗生素替代等方面,具有广阔的应用前景。本研究综述了利用动物生物反应器技术制备重组人溶菌酶的研究状况,包括重组人溶菌酶的表达水平,理化性质、纯化工艺、生物功能和安全评价研究等,同时分析了重组人溶菌酶动物生物反应器率先进行产业化可能存在的问题,并对其未来的发展进行展望,旨在为重组人溶菌酶和其他重组蛋白的产业化提供借鉴和参考。
陈建文[8]2012年在《利用RNA干扰和乳腺生物反应器生产抗腹泻病转基因猪育种新材料的研究》文中研究表明仔猪腹泻是养猪业中常见的疾病，给世界养猪业造成了极大地经济损失。传统预防和治疗猪腹泻的方法如改善环境、服食抗菌素和免疫接种等缺点日渐明显，存在很多风险和问题，因此，迫切需要我们用新的方法和手段来有效控制这种疾病的发生。随着分子生物学技术的快速发展，通过转基因操作改良性状的生物育种方法，直接针对育种目标，目的性强、周期短，直接跨越基因互作的消极影响，可以同时改良多个重要经济性状，这是一种新的富有生命力的疾病控制方法，具有传统的免疫学方法控制疾病所无法比拟的优势。因此，利用转基因技术开展猪抗病育种研究，开发出具有自主知识产权和抗腹泻病转基因猪抗病新品种，提高疾病控制水平，有效控制这种疾病，意义重大。本研究主要从两个方面入手创制转基因抗病育种新材料：一是通过RNAi技术，培育特殊抗病力（ETEC F18）的转基因猪生物育种新材料；二是通过乳腺生物反应器模型培育一般抗病力抗病转基因猪生物育种新材料。主要结果如下：1.通过RNAi技术培育转基因猪育种新材料的工作如下：1)建立了一种基于Cre-LoxP的多启动子介导多个shRNA的方法，获得了干扰FUT1的转基因囊胚；2)建立了一种由慢病毒介导shRNA的方法，获得了7头转基因猪，并从其相关免疫学指标及小肠粘附抑制等生物学功能进行了抗病性研究；3)利用2）中获得的慢病毒感染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2），结果显示RNA干扰前后F18大肠杆菌对小肠上皮细胞的粘附能力无显着差异，结合国内外研究，证明了FUT1不是F18大肠杆菌致病的主要受体基因；2.通过乳腺生物反应器模型培育转基因猪育种新材料的工作如下：1)为探讨转pBD-1基因小鼠在疾病方面的抗病作用，利用小鼠可以在SPF这一环境下饲养的这一优势，开展pBD-1在动物水平群体抗病性及上的功能研究，建立了一种猪防御素-1(pBD-1)转基因小鼠模型，为建立大动物抗病育种模型奠定了基础；2)为了评估表达载体设计的合理性和高效性，为进一步开展利用乳腺生物反应器模型培育一般抗病力的生物新品种奠定基础，建立了一种乳腺生物反应器载体验证的细胞模型，同时通过细胞模型预测转基因成体动物相关免疫应答通路奠定了基础及建立了研究模型；3)建立了转人溶菌酶的转基因细胞系，并进行移植，获得了9头胎儿；4)建立了转pBD-1的转基因细胞系，并进行移植，获得了转基因囊胚。本研究的创新点：首次建立了一种由4启动子介导4个shRNA的全部筛选标记可去除的表达载体，并首次获得了干扰FUT1的转基因囊胚；首次通过体细胞核移植获得了慢病毒介导的RNA干扰的大动物模型；首次在细胞学水平上证明了FUT1不是导致仔猪腹泻与水肿病的主效受体基因；首次利用细胞模型对猪防御素进行了研究，初步建立了一种乳腺生物反应器的细胞模型；首次获得了转pBD-1的转基因小鼠与转基因猪囊胚。
张勃伟[9]2007年在《人溶菌酶乳腺生物反应器的初步研究》文中指出人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ)能水解细菌细胞壁粘多糖的β-1,4糖苷键,所以对革兰阳性细菌具有直接的溶解作用,在分泌型免疫球蛋白A和补体的参与下对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用,此外它还具有消炎、消肿、组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用。因此在医学、食品工业等领域得到十分广泛的应用。为了防治奶牛乳房炎,提高奶牛的抗病能力,试图通过转基因动物的方法提高人溶菌酶在奶牛乳腺细胞中表达,以降低乳房炎的发病率。本研究在克隆出牛β-乳球蛋白基因5′调控序列的基础上,结合本实验室已克隆出人溶菌酶cDNA序列,构建人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体pBEL,并通过电穿孔的方法研究其在体外培养的牛乳腺上皮细胞表达情况。通过G418筛选阳性细胞,为本实验室利用核移植技术生产转基因动物提供细胞来源。研究结果如下:1.利用PCR方法扩增了牛β-乳球蛋白基因5′调控成分,其中包括部分上游序列,第一外显子及第一内含子(933bp)。PCR产物回收纯化后,克隆在pMD18-T Vector的T位点。序列分析结果表明:该序列与牛β-乳球蛋白突变体B前体基因、牛β-乳球蛋白基因突变体B、牛β-乳球蛋白基因的同源性分别为99﹪、99﹪、98﹪。软件分析表明:该序列包括一些表达所需的调控成分,可用于构建乳腺表达载体。2.利用双酶切定向克隆的方法,将真核表达载体pEGFP-Cl构建成含有抗性基因、报告基因、人溶菌酶基因cDNA的真核表达载体pEGFP-hLYZ。用PCR和双酶切方法检测,表明插入的人溶菌酶基因位点正确无误,没有发生影响表达的突变。3.利用双酶切定向克隆的方法,将扩增的牛β-乳球蛋白基因的5′调控序列序列取代真核表达载体pEGFP-hLYZ的部分CMV作为启动子,构建人溶菌酶乳腺特异性表达载体pBEL,载体有抗性基因,绿色荧光蛋白报告基因。并且保证报告基因和目的基因为非融合型表达。4.采用电穿孔转化法转化牛乳腺上皮细胞,经过G418的初步筛选后,通过荧光显微镜观察到了绿色荧光。表明该载体是可用的。
李虎[10]2005年在《人血清白蛋白基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建》文中进行了进一步梳理人血清白蛋白Human serum albumin (HSA)是人血浆中最丰富的蛋白质,在人体内起着维持血液渗透压、运输、营养等作用。转基因动物乳腺生物反应器是基因制药的新方法,其生产药用蛋白具有安全、高效、成本低廉等优点,因此,通过制备动物乳腺生物反应器生产人血清白蛋白将会呈现美好的前景。本试验以奶牛β-酪蛋白基因(β-casein,CSN2)5′端和3′端为调控区序列,人血清白蛋白HSA cDNA 为表达序列,构建了含有新霉素抗性基因、绿色荧光蛋白报告基因的人血清白蛋白乳腺特异性表达载体,为下一步的转染乳腺细胞和将来通过体细胞核移植法制备乳腺生物反应器生产人血清白蛋白打下坚实的基础。相关的研究结果如下:1.根据Genebank(登陆号V00495)中HSA 的cDNA 序列,设计扩增引物。采用RT-PCR自人肝脏中扩增出HSA 基因的1995 bp 全长cDNA。产物纯化后连至pMD-18T 载体,转化大肠杆菌DH5a。筛选阳性克隆菌,酶切鉴定并进行序列分析。结果与GeneBank 中登录的人、猴子、牛、猪、绵羊和小鼠的血清白蛋白cDNA 序列的同源性分别为99%、92%、82%、82%、81%和75%,而且,突变并没有引起最大读码框的改变,即成功的克隆了HSA 的cDNA 序列。 2.本试验以肝脏为材料,用Trizol 法提取总RNA,经甲醛凝胶变性电泳,能清晰的看到28s rRNA和18s rRNA 以及一条较弱的5s rRNA带,表明,所提取的RNA完整性好,完全可以用于RT-PCR 反应。3.根据表达载体pEGFP-C1 上的多克隆位点以及质粒pBL 中的CSN2 启动子序列,重新设计引物,在HSA cDNA 两端添加限制性内切酶NheⅠ和BamHⅠ酶切位点,并采用双酶切后定向克隆的方法,成功的将HSA cDNA 表达序列与CSN2 调控序列融合在一起。测序结果显示,两者正确融合,HSA cDNA 读码框正确无误,没有发生影响表达的突变。 4.采用双酶切定向克隆的方法,利用真核表达载体pEGFP-C1 构建了含有抗性基因、报告基因的人血清白蛋白非融合型乳腺表达载体pEGFP-BH。用PCR 方法和酶切方法检测,表明其中的整个人血清白蛋白乳腺表达构件插入位点准确无误。 5.脂质体法将pEGFP-BH 转染体外培养的乳腺上皮细胞,经过G418 的初步筛选,通过荧光显微镜观察到报告基因绿色荧光蛋白的表达。设计特异性的检测引物,利用PCR
参考文献：
[1]. 山羊乳腺特异性载体的构建及细胞转染[D]. 孙达权. 西北农林科技大学. 2008
[2]. 转基因山羊乳腺上皮细胞系建立与转基因克隆胚发育[D]. 郑月茂. 西北农林科技大学. 2005
[3]. 人溶菌酶动物乳腺生物反应器的研制[D]. 李国才. 扬州大学. 2004
[4]. 乳腺高效表达人溶菌酶转基因小鼠的制备[C]. 李国才, 孙强, 孙怀昌, 陈刚, 张泉. 中国细胞生物学学会第八届会员代表大会暨学术大会论文摘要集. 2003
[5]. 动物乳腺生物反应器的应用及研究进展[J]. 张颖琦. 中国生物制品学杂志. 2009
[6]. 人胰岛素基因改造及其山羊乳腺特异性表达载体构建[D]. 王莉. 西北农林科技大学. 2008
[7]. 重组人溶菌酶动物生物反应器研究进展[J]. 刘燊, 鲁丹, 林树茂, 张辉华, 杨雪珍. 农业生物技术学报. 2017
[8]. 利用RNA干扰和乳腺生物反应器生产抗腹泻病转基因猪育种新材料的研究[D]. 陈建文. 安徽农业大学. 2012
[9]. 人溶菌酶乳腺生物反应器的初步研究[D]. 张勃伟. 西北农林科技大学. 2007
[10]. 人血清白蛋白基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建[D]. 李虎. 西北农林科技大学. 2005
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