1湖南省妇幼保健院 湖南长沙 410000；2长沙市第一医院 湖南长沙 410000
摘要：目的 观察I型糖尿病肾病大鼠模型肾脏中自噻相关蛋白LC3、p62的表达情况。方法 ①建立STZ诱导的I型DN大鼠模型：将20只雄性SD大鼠随机分为正常对照组和糖尿病肾病模型组。采用鼠尾静脉注射STZ的方法诱发SD大鼠糖尿病肾病（STZ为50mg/kg）。对照组注射相同体积的枸橼酸盐缓冲液，3天后开始测定血糖和尿糖值，当血糖值≥16.7mmol/L，尿糖值为3+-4+者可确定为糖尿病模型。成模后第八周处死大鼠，留部分肾皮质组织，4%多聚甲醛固定。②进行HE染色观察两组间肾组织病理改变。③免疫组织化学检测两组间肾组织LC3和P62蛋白表达及分布情况。④采用Pearson相关分析评判LC3、p62与STZ大鼠蛋白尿、肌酐的相关性。结果 ①STZ诱导的I型DN大鼠的血尿生化检测结果：血糖波动在19.2-23.3mmol/l；血肌酐波动在72.5-122.7umol/l；尿蛋白波动在4.63-9.19g/24h②STZ大鼠模型基本病理改变：与正常对照组相比，可见肾小球体积明显增大，肾小管局灶性萎缩，小管间质造型纤维化，基底膜增厚，系膜细胞及系膜基质增多。③p63、LC3免疫组化结果：肾组织小管上皮中，p62表达明显增加，LC3表达明显下降，定量分析结果显示，STZ大鼠肾组织小管中，p62较正常组增加2.5倍，LC3下降35%（p<0.01）
④p62、LC3表达与蛋白尿、血肌酐的相关性分析，提示：p62与STZ大鼠 蛋白尿、肌酐呈正相关（P<0.01），LC3与STZ大鼠蛋白尿、肌酐呈 负相关（P<0.05）。结论STZ诱导的I型DN大鼠模型中，自噬相关蛋白P62 表达明显增加，LC3表达明显下降，并于大鼠蛋白尿、血肌酐呈相关。
关键词：糖尿病肾病；自噬相关蛋白；妊娠
The expression of autophagy related protein in type I induced diabetic nephropathy rats induced by STZ
Xiaoxia1 LIhui2
（Hunan maternity and child health care hospital，Hu Nan Chang Sha 410000；2The First Hospital of Changsha，，Hu Nan Chang Sha 410000；）
Abstract：Objective To observe the expression of LC3 and p62 in kidneys of type I diabetic nephropathy rats.
Method：Firstly，A STZ induced tpye I DN rat model was established：20 male SD rats were randomly divided into normal control group and diabetic nephropathy model group.The diabetic nephropathy of SD rats was induced by injection of STZ into rat tail vein（STZ = 50mg/kg）.The control group was injected with the same volume of citrate buffer.After 3 days，the blood sugar and urine sugar were measured.When the blood sugar was more than 16.7mmol/L and the urine sugar was 3+-4+，the diabetes model was determined.The rats were sacrificed eighth weeks after modeling，leaving part of the renal cortex and fixed by 4% paraformaldehyde.Secondly，The HE staining was used to observe the pathological changes of renal tissue between the two groups.Thirdly，Immunohistochemical staining was used to detect the expression and distribution of LC3 and P62 protein in two groups.At the end，The correlation between LC3，p62 and proteinuria and creatinine in STZ rats was evaluated by Pearson correlation analysis.
Results：The biochemical test results of STZ induced I DN rats：blood glucose fluctuation at 19.2-23.3mmol/l；serum creatinine fluctuation at 72.5-122.7umol/l；urine protein fluctuation in 4.63-9.19g/24h.The basic pathological changes in the STZ rat model：compared with the normal control group，the glomerular volume was obviously increased，the renal tubule was atrophied，the tubulointerstitial fibrosis，the thickening of the basement membrane，and the increase of mesangial cells and mesangial matrix.P63 and LC3 immunohistochemical results：in the renal tubular epithelium，the expression of p62 was obviously increased and the expression of LC3 decreased obviously.The quantitative analysis showed that in the renal tubules of STZ rats，p62 was 2.5 times higher than that of the normal group，and the LC3 decreased by 35%（p<0.01）.The correlation analysis of p62 and LC3 expression with proteinuria and serum creatinine showed that p62 was positively correlated with proteinuria and creatinine in STZ rats（P<0.01）.LC3 was negatively correlated with proteinuria and creatinine in STZ rats（P<0.05）.
Conclusion：The expression of autophagy related protein P62 was significantly increased in the I DN rat model induced by STZ，and the expression of LC3 was obviously decreased，and it was related to proteinuria and serum creatinine in rats.
Key Word：Diabetic nephropathy；autophagy related protein；pregnancy
糖尿病肾病是威胁女性妊娠的重要的独立的危险因素，患有糖尿病合并肾病的女性必须在安全的情况下才可以正常妊娠。而糖尿病肾病也是糖尿病最严重并发症之一，且发病率不断增加，已成为全球范围内一个严重的健康问题，故目前迫切需要寻找新的针对糖尿病肾病发病机制的靶向分子或细胞治疗机制，以期更好的防治糖尿病肾病。近期，营养过剩及ROS、内质网应激、缺氧等细胞 内应激被认为糖尿病肾病的发病机制，而自噬在这些机制中起着重要作用。自噬是对多种应激的适应性反应，损伤细胞、受损细胞器及大 分子蛋白质聚积都可激活自噬信号通路，从而维持应激状态下细胞内 环境的稳态。既往研究提示，自噬与糖尿病其他并发症密切相关，在 胰岛素抵抗时，自噬明显增加，以保护胰岛p细胞免受伤害。所以我们推断，自噬在早期糖尿病肾病的发病机制中也可能起着重要作用，对糖尿病肾病有潜在保护作用。
在细胞或动物实验中，LC3蛋白被认为是自噬存在的标志分子。LC3-II的多少与自噬泡数量成正比，通过检测细胞内LC3-II的变化可 以判断细胞内的自嗟状态。p62蛋白，也称sequestosome 1，与泛素化 蛋白结合后，通过与LC3相互作用而定位在自嗟体上，且不断地被自噬 体-溶酶体系统降解。当自噬功能减弱时，p62相关聚集体的大小和数 量明显增加，p62本身的蛋白水平也明显增高。在本研究中，我们通过体内外实验，在STZ诱导的I型糖尿病肾病大鼠模型中，检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达变化，以阐明糖尿病肾病小管细胞是否存在自噬障碍。
1 材料与方法
1.1.1实验材料
8周龄雄性健康SD大鼠36只，体重为 200-250g。
1.1.2主要试剂
链脲佐菌素（STZ）：美国Sigma公司，4°C贮存
兔抗人（大、小鼠）LC3多克隆抗体：美国CELLSIGNALING公司
兔抗人（大、小鼠）P62多克隆抗体：美国SANTACRUZBIOTECHNOLOGY
公司
小鼠、兔二抗：北京中山金桥生物有限公司
多聚甲醛：天津大茂化学试剂厂
无水乙醇：天津大茂化学试剂厂
二甲苯：由本实验室提供
1.1.3主要试剂的配置
配制柠檬酸缓冲液：
0.lmol/L柠檬酸母液：2.10g柠檬酸溶于l00ml双蒸水；
0.lmol/L柠檬酸三钠母液：2.94g柠檬酸三钠溶乎l00ml双蒸水；
0.lmol/L柠檬酸缓冲液（PH4.5）：0.lmol/L柠檬酸母液和0.lmol/L柠檬酸三钠母液混合配制的，比例是1：1.32。
3.7%多聚甲醛：0.35g多聚甲酵固体粉末和2%的鹿糖溶于加热至约60°C的 l×PBS中，加入10N NaOH 2滴混匀，使得多聚甲醛完全溶解，然后用HC1调节 pH值至7.4，定容至10ml，该溶液为现配现用。
1.2 实验方法
1.2.1 STZ诱导的I型DN大鼠模型制备及标本留取
雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠36只。所有大鼠按统一标准进食，室温22-24°C。随机将大鼠分为正常组18只，早期糖尿病肾病模型组18只；糖尿病肾病模型通过一次性静脉注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）（STZ，50 mg/kg，美国Sigma公司）诱发。STZ 溶于新配制的PH值为4.5的0.1mol/L枸橡酸缓冲液中，配成1%浓度的溶液。大鼠空腹12小时后，将新配制成的1%的STZ采用一次性注射器，按50mg/kg剂量行静 脉注射。正常对照组按同等剂量静脉注射枸椽酸缓冲液。3天后测血糖和尿糖，
空腹血糖H6.7mmol/L，尿糖3+-4+，认为糖尿病模型成功，根据之前相关研究，早期糖尿病肾病指的是从建模成功到第八周末。在糖尿病建模成功后8周末将大鼠处死，处死前2天将大鼠放入代谢笼中，并收集24h尿标本，离心后取上清液，于-70°C冰箱中保存，待测尿白蛋白。腹腔注射3%水合氯醛麻醉大鼠，并于腹主动脉取血送检血肌酐，断头处死动物，取结扎侧肾脏；同时处死对照组大鼠，自腹 主动脉灌注4°C预冷的生理盐水，使个肾脏颜色变苍白，游离并切断肾蒂，之后将 肾脏置于冰上，去除包膜，并横行将肾脏切成大约3mm厚的组织块，置于3.7% 多聚甲醛溶液中，将其固定用于制作石蜡切片，最后行病理学以及免疫组化处理。
1.2.2生化检查
采用上海太阳生物公司试剂盒测定24小时尿白蛋白量；
采用全自动生化分析仪检测血清肌酐；
1.2.3石蜡切片的制备
准备包埋蜡，
准备包埋框，
点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子，需作标记应先写好标签
在金属框中倒入硬蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，置好方向。可室温下冷却。
包埋框或纸盒内的蜡逐渐凝结，若表面已凝结形成一层固体状，即可放入 冷水中，加速其凝固。
待蜡块完全凝固以后，便可拆卸包埋框架，或拆开纸盒，取出蜡块
1.2.4常规切片染色-苏木素-伊红（HE）染色
1.2.5免疫组化
1.2.6统计学处理
应用SPSS15.0软件系统进行统计分析，结果用均数±标准差（±S）表示。计量资料采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两样本均数的多重比较采用独立样本t检验，两变量关联性采用Pearson相关分析，以P<0.05认为结果有统计学差异。
2.实验结果
2.1两组大鼠一般情况及生化指标比较
SD大鼠糖尿病模型建立8周末时，糖尿病肾病组大鼠较正常组精神明显 差，且生长较慢，毛发无光泽，足趾感染几率增多。糖尿病组大鼠24小时尿白 蛋白、血清肌酐浓度（Scr）较正常对照组增高。见表1-1，P<0.05）
两组大鼠相关检测指标结果
3结果
早期糖尿病肾脏疾病模型肾脏组织（主要是肾小管）p62表达上调，LC3表达下调p62与蛋白尿、肌酐成正相关，LC3与蛋白尿、肌酐成负相关。
4 讨论
糖尿病肾病的经典发病机制为高糖介导的细胞内外代谢的噶变，比如糖基化终末产物形成增加，蛋白激酶系统的不断激活，多元醇通路活性异常等。而与肾缺氧有关的细胞应激、线粒体产生的活性氧、内质网应激被提出作为糖尿病肾病新的发病机制。所以维持细胞器功能障碍或缺氧等应激状态下的细胞内环境稳态，成为糖尿病肾病治疗的新目标。而自噬是蛋白质在膜包囊泡中降解的生物学过程，主要通过对受损细胞器和老化蛋白质等大分子物质进行降解而维持细胞内环境稳定及细胞的完整性。故研究自噬在糖尿病肾病中作用对糖尿病肾病发病机制的研究及治疗具有重要意义。
本研究中，我们利用相关文献报告构建了STZ诱导的I型糖尿病肾病大鼠模型，普通HE染色示：肾小球体积明显增大，肾小管灶性萎缩，小管间质造型纤维化，基底膜增厚，系膜细胞及系膜基质增多。血尿生化指标示：血糖波动在19.2-23.3mmol/l；血肌酐波动在72.5-122.7mmol/l；尿蛋白波动在4.63-9.19g/24H，提示STZ有道的I型糖尿病肾病大鼠模型成功。
自噬先关蛋白P62由C-myc基因在外显子2和3共同编码，439个氨基酸组成的约62kd的磷酸化蛋白，定位于胞核内，为核蛋白，但在胞浆中合成。P62蛋白由三个结构域组成：N端的Phox和Beml结构域（PB1），C端的泛素相关结构域（ubiquitin associated domains，UBA），中间段的锌指结构域（zincfinger，Zinc）。p62能够结合泛素化蛋白，并与LC3蛋白形成复合物，从而使蛋白转入自噬溶酶体内被降解，自噬发生时，随蛋白不断降解，p62逐渐降低，自噬缺陷时则会再现P62聚集，是检测自噬活性的一个标志蛋白[1].有研究显示[2]p62直接结合于LC3和其他的Atg同源物，如 GABARAP，GABARAPL1，GABARAPL2；p62和Lc3的同源物的相互作用是通过22个氨基酸酸性肽序列结构调节的。因为p62通过自噬降解，而自噬抑制和p62水平提高有相关性，也就是说p62表达增强说明自噬受到了抑制，所以p62也可以作为自噬的标记物。
本次研究中，采用抗p62抗体染色，进行免疫组化分析显示：p62蛋白仅在肾小管上皮中少量表达，而在STZ诱导的I型糖尿病肾病大鼠模型中其表达明显增加，并且主要集中在肾小管。同时，对p62蛋白表达与STZ大鼠尿蛋白和肌酐做相关性分析，结果示p62与蛋白尿、肌酐呈正相关，提示糖尿病肾病小管上皮中存在自噬异常，且与糖尿病肾病肾功能异常存在相关性。
自噻相关蛋白LC3，是哺乳动物细胞中酵母ATG8基因的同源物，定位于前 自噬泡和自噬泡膜表面，是细胞自噬泡膜的通用标记物。在哺乳动物中以三种形式存在-LC3A，LC3B和LC3C，且分布在不同组织内[3]其中，LC3A，LC3B是与自噬泡膜最相关的形式。LC3被Atg4分解后生成LC3-I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸残基。之后LC3-I被E1样酶Atg7活化，转运至第二种E2样酶，被修饰成膜结合形式LC3-II。其定位于前自噬体和自噬体，使之成为自噬体的标志分子。LC3-II 含量的多少在某种程度上反映了细胞的自噬活性。在免疫印记试验中，LC3-II较 LC3-I更加敏感一些[4]
本次研究利用免疫组织化学对STZ诱导的I型糖尿病肾病大鼠及正常大鼠 肾组织LC3蛋白进行检测，发现STZ大鼠肾组织（特别是肾小管）中LC3明显下降，经半定量分析发现，LC3下降至正常组35%。同时，也对LC3蛋白表达与STZ大鼠尿蛋白和肌酐做相关性分析，结果示LC3与蛋白尿、肌酐呈负相关。可以初步证实，自噬可能与糖尿病肾病功能异常及发病机制有关。
参考文献：
[1]Klionskyd D J，Abeliovich H，Agostinis P，et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes [J]，Autophagy，2008，4（2）：151-175.
[2]Pankiv S，Clausen TH，Lamark T，et al.p62/SQSTMl Binds Directly to Atg8/LC3 to Facilitate Degradation of Ubiquitinated Protein Aggregatesby Autophagy.The Journal of Biological Chemistry，2007，282（33）：24131-24145
[3]Klionsky DJ，Abeliovich H，Agostinis P，et al.Guidelines for the use and interpretation of assays formonitoring autophagy in higher eukaryotes.Autophagy 2008，4：151-75
[4]Kabeya Y，Mizushima N，Yamamoto A，Oshitani-Okamoto S，Ohsumi Y，Yoshimori T.（2004）LC3，GABARAP and GATE 16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formationJ Cell Sci 117：2805-2812
基金项目：湖南省卫生厅（20180191）
论文作者:肖霞1,李慧2
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年7月21期
论文发表时间:2018/9/6
标签：大鼠论文; 蛋白论文; 糖尿病肾病论文; 蛋白尿论文; 细胞论文; 模型论文; 肌酐论文; 《中国误诊学杂志》2018年7月21期论文;