李瑛[1]2014年在《两种蟾毒灵脂质体制备工艺及抗肿瘤作用研究》文中研究指明目的：蟾毒灵是中国传统中药蟾酥的主要有效成分，具有广谱抗肿瘤作用。然而其水溶性差、毒性大、代谢速度快、治疗窗窄等缺点严重限制了其临床应用。本课题采用新型给药体系脂质体为载体，不仅解决蟾毒灵的难溶性问题，还能起到缓释控释的作用。通过柑橘果胶（CP）包裹蟾毒灵脂质体（BFL），制得果胶-蟾毒灵脂质体（CPL），为肠道黏膜腔道给药提供新思路。另通过耦合anti-CD40单克隆抗体连接上BFL，制得anti-CD40-蟾毒灵脂质体（anti-CD40-BFL），协同化疗和免疫治疗，增强抗肿瘤效果的同时降低了因药物在体内快速分布而引起的全身性副作用。方法：采用高效液相色谱技术（HPLC）建立BFL中蟾毒灵含量的测量方法。通过单因素考察及正交设计优化BFL的最佳工艺。通过正负电荷吸附制备CPL，评价其质量、稳定性、黏附性、细胞吸收情况、体外抗肿瘤作用及机制；并考察CPL及BFL在大鼠体内的药代动力学情况。通过马来酰亚胺-硫醇反应制备anti-CD40-BFL，评价其体内外抗黑色素瘤作用；通过Western blot印迹实验考察凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9及Cyt C表达水平；TUNEL法及苏木精-伊红染色（H&E染色）观察肿瘤细胞的凋亡；ELISA法测量体内细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6，IFN-γ及ALT含量；并通过免疫荧光实验观察其在体内分布情况。结果：用HPLC法测量BFL中蟾毒灵含量，回归方程为A=17865C-2116.7，r=1，蟾毒灵在0.8~40μg/mL浓度范围内线性关系良好，特异性、精密度和回收率均符合测量要求。用乙醇注入法制得脂质体的包封率较高，正交设计最佳处方为：药-脂比为1∶5，卵磷脂-胆固醇的质量比为1∶5，PBS缓冲液体积为10.0mL，将材料完全溶于乙醇后缓慢注入水相中，50℃不断搅拌，持续加热至乙醇全部挥尽，加PBS缓冲液补充体积至10.0mL，用脂质体挤出仪反复挤压通过200nm的膜。制得CPL外观圆整、分散均匀，粒径296.3±77.4nm(PI=0.171)，表面电位18.1±5.33mV，包封率72.31±5.84%；制成冻干粉剂后长期稳定性较好；体外释放时间延长，黏附性增加约3倍；包裹上果胶后不影响细胞吸收情况，同时增强对SW480结肠癌细胞抑制作用；蟾毒灵将SW480结肠癌细胞增殖阻滞于S期。脂质体组较蟾毒灵单体药物组总清除率减小，曲线下面积增大。蟾毒灵、BFL及CPL药代动力学参数CLz/F分别为0.101±0.006、0.049±0.007及0.062±0.02L/min/kg；AUC(0-t)分别为8.718±1.14、16.531±2.842及12.186±1.88mg/L min。制得anti-CD40-BFL粒径为205.4±68.4nm （PI=0.062)，表面电位-15.68mV，包封率为73.59±3.14%，ELISA法测得脂质体上耦合anti-CD40的密度为5mg/mL。CCK-8法测得蟾毒灵、BFL及anti-CD40-BFL体外抗黑色素瘤B16细胞作用IC50分别为224.12±3.14、69.91±0.93、61.73±1.21nmol/mL；生理盐水、anti-CD40溶液、蟾毒灵、BFL及anti-CD40-BFL治疗荷黑色素瘤C57小鼠，最终瘤体积分别为726.354±102.53，477.96±76.89，284.35±84.05，254.53±44.99及176.34±43.86mm3；anti-CD40-BFL组Caspase-3、Caspase-9及细胞色素C表达水平升高，灰度值分别为0.92±0.026，1.58±0.013，1.069±0.016；anti-CD40-BFL组细胞因子含量低于anti-CD40组，且在肿瘤、脾、淋巴结等部位能够更持久的停留。结论：CPL具有较好的稳定性、缓释性、黏附性及抗SW480结肠癌细胞作用，能够有效的减缓蟾毒灵在大鼠体内的代谢速率，增加药物的半衰期及生物利用度，是一种有前景的治疗结肠癌药物；anti-CD40-BFL联合化疗及免疫治疗作用，抗黑色素瘤作用增强，同时由于缓释控释作用，减少系统副作用。
袁佳妮[2]2016年在《蟾毒灵脂质体的制备工艺、质量评价及药代动力学研究》文中进行了进一步梳理研究背景:蟾毒灵(Bufalin,BF)是蟾酥的主要活性成分之一,属于蟾毒甾烯类化合物,对多种实体瘤具有抑制作用。但是,由于其水溶性差等理化性质,心脏及神经毒性大等生物特性以及代谢迅速等体内药代动力学特征,限制了研究与应用。本课题拟采用脂质体作为给药载体,有望解决蟾毒灵水溶性差的问题,且达到缓释控释的效果。脂质体表面连接两亲性聚合物DSPE-PEG2000,制得PEG修饰的蟾毒灵脂质体,可达到靶向肿瘤、延长蟾毒灵血中循环时间的作用。本课题就蟾毒灵脂质体的制备工艺、质量评价及药代动力学进行了研究,为蟾毒灵制剂开发提供依据。方法:应用高效液相色谱技术(HPLC)建立蟾毒灵脂质体制剂及PEG修饰的蟾毒灵脂质体制剂中BF含量测定的方法。通过单因素考察和正交实验,筛选脂质体制备的最佳处方与工艺。通过表面修饰制备PEG修饰蟾毒灵脂质体,评价其质量、稳定性、体外抗肿瘤作用;并考察蟾毒灵脂质体及PEG修饰的蟾毒灵脂质体在大鼠体内的药代动力学情况。结果:HPLC法测定BF含量,线性拟合回归方程为A=17991x-2183.6,R2=0.9999,表明BF在0.80-40.0μg/m L浓度区间内线性关系良好。专属性、精密度、稳定性、重复性、回收率以及样品测定实验结果均符合测量要求。应用工艺改良后的均质-薄膜分散法所得的蟾毒灵脂质体粒径均一、包封率高,正交实验得最佳处方及工艺为:药物-磷脂质量比为1∶10,蛋黄卵磷脂-胆固醇质量比为4∶1,完全溶于3.0 m L氯仿中,50℃恒温减压挥去有机溶剂,蒸馏水30.0 m L于50℃恒温水浴,涡旋震荡水化15 min,500 bar高压循环10次,ATS脂质体挤出仪挤压过200 nm聚碳酸酯膜。制得蟾毒灵脂质体外观圆整、分散均匀,粒径为172.1±3.4 nm(PI=0.237),表面电位为2.24±0.33 m V,包封率为76.31±3.40%;制得PEG修饰的蟾毒灵脂质体粒径为178.9±4.21nm(PI=0.285),表面电位为-18.05±2.57 m V,包封率为78.40±1.62%。长期稳定性较好;释放药物速度:PEG修饰的蟾毒灵脂质体<蟾毒灵脂质体<单体药物;蟾毒灵包裹上磷脂材料后,对U251神经胶质瘤细胞的抑制作用增强。脂质体组较蟾毒灵单体药物组峰浓度降低,消除半衰期延长,曲线下面积增大。蟾毒灵、蟾毒灵脂质体及PEG修饰的蟾毒灵脂质体的药代动力学参数Cmax分别为1326.628±24.519、1254.022±16.604及1071.332±36.311 ng/m L;AUC(0-t)分别为25012.029±2246.286、57137.521±1453.14及138046.006±2771.79 ng/m L·min;T1/2z分别为40.516±10.607、54.396±3.329及87.842±7.79 min。结论:与蟾毒灵脂质体相比,PEG修饰的蟾毒灵脂质体具有较好的稳定性、缓释性及抑制U251神经胶质瘤细胞生长,能够有效降低蟾毒灵大鼠体内代谢速率,延长药物消除半衰期,增加生物利用度,对神经胶质瘤的治疗具有较好的前景。
李芳[3]2010年在《蟾毒配基静脉注射载药系统的研究》文中研究指明蟾酥是我国的传统中药,其发挥抗肿瘤作用的主要活性成分是蟾毒配基类化合物。本文对蟾酥药材中蟾毒灵、华蟾毒精和脂蟾毒配基进行分离,并将其制备为脂质体和纳米结构脂质载体两种制剂,主要解决蟾酥静脉注射后的血管刺激性、半衰期短、体内分布广泛等难题,充分发挥药物的抗肿瘤活性,降低其心脏毒性等毒副作用。本文首先建立了药材、提取物以及最终分离物的薄层色谱和高效液相的定性定量质量控制方法。以三种蟾毒配基的总含量和转移率为指标,对药材进行80%乙醇回流提取,乙酸乙酯萃取和硅胶柱层析分离,最终分离物中三种蟾毒配基的总含量在95%以上,总转移率大于70%。处方前研究表明,三种蟾毒配基在水中的溶解度较低,其溶解度及在正辛醇／水系统中的分配系数均具有非pH依赖性,Log P值均在3左右。稳定性实验表明,蟾毒配基分离物在露置空气、高温、高湿和强光照射下稳定性良好,其水溶液在pH大于8或小于4的环境中均不稳定,在pH6.0-7.0之间较稳定。酶解实验中,蟾毒灵与脂蟾毒配基较稳定,华蟾毒精在血浆中的稳定性较差,其降解符合伪一级反应动力学。以脂质体的外观、粒径、包封率为评价指标,对蟾毒配基脂质体(BU-lipo)的制备过程进行了研究。确定处方为：磷脂用量为1.25%,药脂比为1：20,胆固醇与磷脂比为1：20,α-生育酚用量为磷脂的1%。冷冻干燥过程中使用10%海藻糖为冻干保护剂,工艺为：-75℃预冻12 h,冻干机程序升温过程为-35℃保持1h后升温至-25℃维持12 h,然后升温至20℃干燥4 h。BU-lipo多为单室脂质体,粒度为96.5±50.6 nm,zeta电位为-8～-4 mV,pH值在6.5左右,三种蟾毒配基的包封率分别为86.5%,90.0%和92.1%。体外释放符合Weibull模型,BU-lipo中华蟾毒精在血浆中的稳定性与游离药物相比有显著提高。此外建立了微渗析法测定微粒制剂的包封率,该法准确度高,重现性好。采用单硬脂酸甘油酯、中链脂肪酸甘油酯和油酸为脂质材料,以Lipoid E80(?)、PluronicF68及脱氧胆酸钠为乳化剂,使用高速搅拌超声法制备蟾毒配基纳米结构脂质载体(BU-NLC)。制剂粒径为104.1±51.2 nm,zeta电位为-15～-20 mV,pH值在6.8～7.2之间,三种蟾毒配基在制剂中的包封率均大于85%。采用透射电镜及冷冻蚀刻电镜观察BU-NLC粒子形态为较圆整的球形,DSC和X-射线衍射结果显示冷冻干燥后BU-NLC以无定形状态存在于冻干保护剂中。体外释放符合Weibull释放模型,72 h后药物的释放进入平台期,BU-NLC可较好的控制药物的体外释放。体外血浆稳定性实验表明,当血浆浓度为80%时,BU-NLC中华蟾毒精的降解半衰期为9.34 h,是BU-lipo和溶液剂中华蟾毒精降解半衰期的1.72和17倍。冷冻干燥工艺研究表明脂质浓度和冻干保护剂种类对冻干样品有较大的影响。当脂质浓度为0.3%含10%蔗糖为冻干保护剂时,BU-NLC粒子在冷冻干燥过程中可被完好保护。建立了同时测定生物样品中三种蟾毒配基的UPLC-MS／MS法,该法专属性强,灵敏度高,分析时间短。大鼠药代动力学实验表明：BU-NLC在0.25～1.0 mg／kg剂量范围内的体内代谢符合线性动力学特征；给予相同剂量(1.0 mg／kg)BU-NLC和BU-S后,BU-NLC可使药物在体内保持较高的血药浓度,蟾毒灵、华蟾毒精、脂蟾毒配基的AUC0-t分别是BU-S组的1.87,1.96和2.84倍,Cmax也有显著提高(P<0.05)。BU-NLC组表观分布容积和清除率也比BU-S组的小。组织分布实验表明：正常小鼠静脉注射相同剂量(1.5 mg／kg)BU-NLC和BU-S后,BU-NLC可使蟾毒配基在脑、脾、肝中的浓度增加,而心组织中药物的分布有所下降；荷瘤小鼠多次或单次静脉注射相同剂量(1.0 mg／kg)BU-NLC和BU-S后,与正常小鼠相比各组织中药物的相对分布量没有明显差异。三种蟾毒配基在瘤组织中均有一定的分布,依次为R>C>B,BU-NLC可提高蟾毒配基在瘤、脑、脾和肝中的浓度,减少其在心中的分布,但是由于荷瘤动物数据点较少,不具有统计学显著差异。此外值得注意的是与大多数药物不同,给予两种制剂后,三种蟾毒配基分布较多的脏器依次是肺,脑,脾,肾,心和肝,其在肝组织中的浓度均最低,在脑中的分布相对较多,同时脑组织内药物代谢相对较慢。以人胃癌HGC-27细胞和人胶质瘤U87-MG细胞为细胞模型,采用MTT法对蟾毒配基游离药物及BU-NLC的体外抗肿瘤活性进行评价。结果表明BU-NLC对两种细胞系的抑制作用与游离药物相似,表现出了明显的时间和浓度依赖性。体内抗肿瘤实验采用S180肉瘤细胞小鼠皮下移植瘤动物模型,蟾毒配基溶液剂组(1.0 mg／kg／d)的抑瘤率为36.79%,BU-NLC高(1.0 mg／kg／d)、中(0.5 mg／kg／d)、低剂量(0.25 mg／kg／d)组均能有效抑制体内S180小鼠肿瘤细胞的生长,并且随着剂量的增加,抑制作用增强,最高抑制率可达67%左右,同时没有阳性药环磷酰胺降低脾脏指数、胸腺指数的副作用。急性毒性实验表明,BU-NLC的LDso值为2.95 mg／kg,是蟾毒配基溶液剂LDso的1.28倍。安全性实验结果表明,当脂质浓度低于1.2 mg／mL时,BU-NLC体外不引起溶血。本文研究显示BU-NLC可改善蟾毒配基的体内行为和抗肿瘤疗效。其性质稳定,安全有效,适于静脉给药,希望能为蟾酥用于临床提供剂型、药效、毒理方面的科学依据。
梁伟[4]2000年在《蟾毒灵脂质体的研究》文中研究表明蟾酥在我国已有上千年的应用历史。最近研究发现，蟾酥主要成分之一蟾毒灵（bufalin简称BF）具有选择性地诱导人白血病细胞分化和凋亡的作用，并可恢复临床上耐维甲酸白血病细胞对维甲酸的敏感性，与其它抗肿瘤药合用，可提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。但蟾毒灵具有很强的强心作用，剂量小，治疗指数窄，影响了它的使用。本文旨在将蟾毒灵制成脂质体（Liposome，L），利用脂质体具有靶向和降低毒性的特点，探索将蟾毒灵用于抗肿瘤的可能性。 蟾毒灵系采用硅胶G柱层析法从蟾酥氯仿提取物中分离而得，并经~(13)C-NMR和~1H-NMR进行了结构确证。 采用薄膜法分别制备了蟾毒灵阳离子、阴离子及中性脂质体。发现于磷脂中加入改变脂膜电性的其他成分对蟾毒灵的包封率、渗漏及脂质体的粒径无明显影响。 DSC研究表明，胆固醇（Chol）、十八胺（OA）、二硬脂酰磷酸甘油（DSPG）及BF均使磷脂酰胆碱（phosphocholine，PC）脂膜主相转变温度变宽，向低温方向移动。~(31)P-NMR谱图表明，未经超声波处理的PC脂膜，BF可降低PC脂膜的流动性，呈凝胶相特征。PC双分子层膜经超声波处理后可形成脂肪链由内向外翻转的单层小囊泡，呈六晶相特征。BF可加速上述过程，可能是由于BF的存在减弱了PC分子间的作用力，从而使PC脂膜更易受外力作用的影响。固体~(13)C-NMR谱解析表明，BF与PC可产生较强的相互作用。25℃时BF可使PC分子中甘油骨架碳原子及胆碱与磷原子相连的两个碳原子核磁共振峰消失，BF也使PC脂肪链远离羧基端的3个碳原子以及近羧基端的3个碳原子核磁共振峰发生明显的强度变化，影响碳链的转动。上述实验结果说明BF可能插入到PC双分子层脂膜中，超声波处理改变了PC脂膜的结构。 PC-BF-Chol-L、PC-BF-OA-L、PC-BF-DSPG-L三种荷电性不同的蟾毒灵脂质体及BF对HL-60细胞生长抑制的IC_(50)分别为2.5×10~(-8)M、1.6×10~(-8)M、2.0×10~(-8)M、2.O×10~(-8)M。BF浓度为1×10~(-7)M时三种脂质体及BF可完全抑制HL-60、U937细胞的生长，而1×10~(-8)M BF对HL-60、U937细胞的生长抑制率分别为17.2％和18.6％。表明PC-BF-OA-L对HL-60细胞生长的抑制作用最强，PC-BF-DSPG-L次之，PC-BF-Chol-L较差。蟾毒灵产生细胞毒作用的浓度范围很窄在1×10~(-7)～1×10~(-8)M。 妇毒灵脂质体的研究 IIL－60细胞经PC－BF－Chol－L、PC－BF－OA－L、PC．BF－DSPG－二及BF以不同浓度处J‘ill 24小f 以及厂 IX10“＊M BF处理不同lj问，PC．BFChol．L、PC－BFOA1 ＠导HL60细胞凋亡的效果较PC－BFDSPG＊与BF稍弱。细胞周期分析表明，三利：脂质体和 BF均使 HL60细胞阻止在 G。－M期。DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示，浓度为IX10”‘M的 BF和 BF三种月质体处理 HL－60自0 15刁时·以及 l。10刁M向 BF f［IBF三刊。脂质体处理HL－60纫胞24小时，HL－60细胞DNA呈现明显的梯状条带门adder），为凋亡细胞＊NA的典型特征。提示蜡毒灵对H卜6O细胞生长的抑制仆J！I足其血过沥导细胞程序化死亡（即凋亡）来实现的。 HL－60细她经卜 10｛M禾 IXIO”gM的 PC－BF－DSPG－L与 BF处理 3天，通过 NBT还原能力的测定，计算分化细胞的百分数。结果表明，lx10“gM的 l。C．BF．DSPG．L与 BF诱导 HL－60细胞分化的百分数分别为 sl．60和 78．3O，IX10－‘M BF没有进一步提高HL－60细胞分化的百分数。 小鼠腹腔单次注射赡毒灵及赡毒灵脂质体，其LDS。值分别为1石4O．5叫．8）sg从g ＊2＊8（Z．43～Z．95）＜＊＊，两者相差1＊3倍，具有显著性差异（P＜0＊1）。赡毒灵O＊3。ng／吨及峭毒灵脂质体口．5＊mg／g0等毒齐迢对小鼠＊训s月癌（皮下栓中D。〕的抑瘤率分别为 39．130＄［146．740（P＜0．05），赡鸯灵脂质体优于蜡毒灵；以等剂量0．u＞旮咋相比，抑瘤率分别为39．门％和枯．84％（P＞0．05）。赡毒灵脂质体可以降低赡毒灵的毒性和提高抗肿瘤效果。
梁伟, 侯惠民[5]1999年在《蟾毒灵脂质体的研究》文中研究说明蟾毒灵(Bufalin 简称 BF)是中药蟾稣中有效成分之一,为一甾体类化合物。BF具有广泛的药理作用:对N~+a-K~+-ATP酶具有强烈的抑制作用;其局部麻醉作用是可卡因的30-60倍。最近研究发现BF具有较强的细胞分化诱导作用,选择性地诱导人白血病HL-60和U937细胞分化凋亡,有望用于白血病的治疗。 BP为疏水性毒性药物,目前尚未单独作为药物应用,但其存在于蟾酥中已临床应用上千年。鉴于其作用强烈,剂量小,我们将其制成脂质体,研究其与磷脂膜的相互作用,为进
罗会俊, 潘铁英, 梁伟, 史新梅, 侯惠民[6]2000年在《蟾毒灵对脂质体相结构的影响：~(31)P-NMR研究》文中指出蟾毒灵(Bufalin,简称 BF)是中药蟾酥中主要有效成份之一,属甾族化合物,对白血病 HL-60和 U937细胞具有分化诱导作用,有望用于白血病的治疗, 但 BF 为疏水性毒性药物,迄今尚未单独作为药物使用,小鼠腹腔注射 LD50为 2．2mg/kg。鉴于 BF 作用强烈,剂量小,治疗指数窄,故将蟾毒灵制成卵磷脂脂质体(Liposome)。由于脂质体具有缓释和靶向的特性,可望提高蟾毒灵的疗效和降低其毒性。为了了解蟾毒灵在磷脂膜的作用部位以及由此引起的磷脂膜结构的变化,为脂质体处方设计、制备工艺及稳定性提供理论依据,本文采用 P-NMR 技术进行了研究。
袁佳妮, 曹蔚, 周暄宣, 杨倩, 孙纪元[7]2015年在《紫外分光光度法测定靶向修饰脂质体中蟾毒灵的含量》文中指出目的:建立靶向修饰的蟾毒灵脂质体(BLs)制剂中蟾毒灵(Bu)含量测定的方法。方法:采用紫外分光光度法,通过测定波长300nm处的吸光度,计算BLs制剂中Bu的含量。结果:Bu在15.62-250.0μg/mL的浓度范围内,于300nm处的吸光度线性关系良好,回归方程为Y=0.0114X-0.0346(R~2=0.9997),平均回收率为99.82%,RSD为1.13%(n=9)。结论:本方法操作简单,且稳定性、准确度和精密度均符合要求,可用于BLs制剂中Bu含量的测定,并计算得到BLs制剂中Bu包封率。
罗会俊, 潘铁英, 史新梅, 梁伟, 侯惠民[8]2000年在《蟾毒灵对脂质体双分子层结构的影响:~(31)PNMR研究》文中研究表明应用31 PNMR方法研究了蟾毒灵 (BF)对脂质体双分子层结构的影响 .研究结果表明对于未经超声波处理的卵磷脂 (PC) ,BF对磷脂双分子层膜具有稳定作用 .另一方面 ,当PC经过超声波处理后 ,首次观测到纯PC的双分子层膜转变为胶束或微胞 ,后者的比例随着超声波处理的时间的增加而增加 ;而BF的存在可加速PC由双分子层结构向胶束相的转变 .
袁佳妮, 李瑶, 杨倩, 周暄宣, 谢艳华[9]2018年在《蟾酥类制剂的研究进展》文中提出目的:为蟾酥类制剂的二次开发和合理应用提供参考。方法:以"蟾酥"、"蟾毒灵"、"制剂"、"Chansu"、"bufalin"和"preparation"为关键词,在PubMed、Medline、中国知网等数据库中检索相关文献(1991.01-2017.01),对蟾酥类化合物的制剂学方面的研究进行综述。结果:共检索出相关文献297篇,其中有效文献126篇。蟾酥类制剂主要以丹剂和丸剂为主,有效成分以蟾毒灵等为主,但存在溶解度差、毒副作用强和生物利用度低等问题,近年来采用新制剂技术将其制备成纳米靶向制剂,但同时也存在一定局限性,需进一步对蟾酥类制剂的制备工艺、新剂型、药效学和药代动力学等进行系统研究,以充分发挥蟾酥药材的功效,同时降低其毒副作用。
胡强[10]2014年在《载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊的构建及其对肠癌抑制作用的研究》文中指出[研究背景和目的]研究背景：在美国,结直肠癌是男性和女性第三大最常见的癌症,同时也是第三大癌症死亡的原因。结直肠癌患者的生存和预后取决于肿瘤的检测阶段。不幸的是,约50%的患者在诊断时已有区域或远处转移。虽然近年来对结直肠癌的诊断与外科治疗均取得长足发展,但该病的术后5年生存率仍徘徊在50%-65%。究其原因是由于结直肠癌早期诊断率低,术后易复发并向其他脏器组织侵袭转移。因此,结直肠癌的治疗已成为世界范围内研究的焦点。结直肠癌转移是一个非常复杂的过程,其发病机制目前尚不完全清楚,诊治的方法未达到理想的效果,尤其是对于晚期结直肠癌患者,治疗手段仍然不多。因此,人们现在正在寻找新的诊治方法。中医药已在肿瘤治疗领域中表现出独特的优势,在杀伤肿瘤细胞的同时,可以减轻化疗和放疗不良反应。蟾毒灵是从中药蟾酥中分离提取的活性单体物质,蟾毒灵对多种肿瘤具有显著的抗肿瘤效果,然而,因为其具有较大的毒性、难以溶于水、半衰期短等缺点,限制了其在临床上的应用。研究表明,用纳米复合材料包载蟾毒灵可以克服以上的缺点。利用纳米技术研制的靶向纳米药物,使药物具有了肿瘤靶向性,在肿瘤组织内滞留缓慢释放,可以提高药效,并可以减少原有的药物副作用。普朗尼克(Pluronic)属于两亲性三嵌段的共聚合物(聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯),结构中有亲水链(聚氧乙烯)和疏水链(聚氧丙烯),具有较好地生物组织相容性和可降解性,已被作为食品和医用敷料的人工聚合物材料之一。但Pluronic胶束纳米粒在溶液中极不稳定,很容易被稀释而自行降解,这就限制了它的应用范围。聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)是一类阳离子聚合物,含有大量氨基结构,可作为一种非病毒基因转染系统。低分子量的PEI可以作为交联剂与Pluronic结合,能提高Pluronic聚合物复合材料(pluronic-polyethylenimine, Pluronic-PEI)的稳定性,并大大提高了共聚物所形成的胶束稳定性,可以用于制备药物的纳米载体。目的：制备具有靶向作用和缓释作用的包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊,并建立质量评价标准；测定该纳米微囊体外释放和靶向分布规律,探讨其对裸鼠结直肠癌的抑制作用,以揭示包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊的药理学机制。[研究方法]1.包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊制备方法：选用低分子量PEI (Mw=2000)作为交联剂进行交联,改善普朗尼克的热力学不稳定性,采用超声乳化法制得包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊。2.对包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊的理化性质进行研究：透射电子显微镜观察纳米微囊表征及粒径分布；测定包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊的包封率和载药量,绘制体外释放曲线,检测空白纳米微囊细胞毒性。3.包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊靶向分布研究：选用罗丹明B(Rb)作为荧光探针,将其包裹在纳米微囊中,在激光共聚焦显微镜下观察细胞中所摄入纳米微囊的分布情况。4.包载蟾毒灵的Pluronic-PEI纳米微囊对裸鼠结直肠癌的抑制作用：建立HCT116肠癌裸鼠肿瘤模型,随机分为对照组、空白纳米微囊组、蟾毒灵组、包载蟾毒灵纳米微囊组、奥沙利铂组,尾静脉给药。比较治疗前后各组裸鼠的体重变化、活体靶向荧光成像以及全身转移情况。[研究结果]1.包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊的制备及理化性质：通过化学交联改性剂交联,克服了普朗尼克的热力学不稳定性,制备的纳米微囊粒径大小均匀,外形圆整,粒径最小30nm,最大80nm,平均65±0.214nm, Zeta电位为5.87±0.42mV。当蟾毒灵投药量为0.4mg时,载药量最高。2.包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊的体外释放明显较游离蟾毒灵缓慢。在4小时左右,游离蟾毒灵的释放率已经超过了60%。而纳米微囊在前5小时表现出突释相特征,累计释放量达到40%-50%,5小时之后,纳米微囊的体外累积释放明显放缓,在32小时时,蟾毒灵的累积释放量达70%-80%。3.药物靶向分布研究：在HCT116细胞内,载药纳米微囊组罗丹明B的红色荧光明显强于游离罗丹明B组,且主要分布在细胞浆内,只有少量分布在细胞核内,而游离罗丹明B组细胞核内基本观察不到红色荧光。4.包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊对裸鼠肠癌的抑制作用：治疗后包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊与等剂量蟾毒灵相比,对裸鼠肠癌肿瘤生长、转移的抑制作用更加明显,且裸鼠生存质量更高。[研究结论]1.本研究采用超声乳化法建立了包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊的制备方法和质量评价标准。2.与游离蟾毒灵相比,包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊显示出明显的缓释特点,随着时间的延长逐步释放出药物,在32小时累积释放达70-80%。3. Rb-Bufalin-Pluronic-PEI纳米微囊的细胞摄取效率比游离的蟾毒灵的摄取显著提高,说明纳米微囊能更有效地靶向肿瘤,具有较好的肿瘤靶向作用。4.空白纳米微囊细胞增值率≥80%,说明基本无细胞毒性。5.包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊对肠癌的生长、转移有明显抑制作用,对裸鼠肠癌具有较好的治疗作用,并能显著提高荷瘤裸鼠的生存质量。
参考文献：
[1]. 两种蟾毒灵脂质体制备工艺及抗肿瘤作用研究[D]. 李瑛. 第四军医大学. 2014
[2]. 蟾毒灵脂质体的制备工艺、质量评价及药代动力学研究[D]. 袁佳妮. 第四军医大学. 2016
[3]. 蟾毒配基静脉注射载药系统的研究[D]. 李芳. 沈阳药科大学. 2010
[4]. 蟾毒灵脂质体的研究[D]. 梁伟. 上海医药工业研究院. 2000
[5]. 蟾毒灵脂质体的研究[C]. 梁伟, 侯惠民. 第七届全国生物膜学术讨论会论文摘要汇编. 1999
[6]. 蟾毒灵对脂质体相结构的影响：~(31)P-NMR研究[C]. 罗会俊, 潘铁英, 梁伟, 史新梅, 侯惠民. 第十一届全国波谱学学术会议论文摘要集. 2000
[7]. 紫外分光光度法测定靶向修饰脂质体中蟾毒灵的含量[J]. 袁佳妮, 曹蔚, 周暄宣, 杨倩, 孙纪元. 陕西中医. 2015
[8]. 蟾毒灵对脂质体双分子层结构的影响:~(31)PNMR研究[J]. 罗会俊, 潘铁英, 史新梅, 梁伟, 侯惠民. 波谱学杂志. 2000
[9]. 蟾酥类制剂的研究进展[J]. 袁佳妮, 李瑶, 杨倩, 周暄宣, 谢艳华. 陕西中医. 2018
[10]. 载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊的构建及其对肠癌抑制作用的研究[D]. 胡强. 山东大学. 2014